제시된 프로토콜은 마우스 난관에서 게놈 조작을 위한 매우 유연한 방법입니다. 면역 적격 환경 내에서 편집되지 않은 세포로 둘러싸인 산발적으로 돌연변이 된 세포의 형성을 허용합니다. 이는 암 개시를 연구하는 데 유리하다.
이 기술의 주요 장점은 마우스 라인이 절대적으로 필요하지 않고 쉽게 교체할 수 있는 돌연변이 조합 세트로 관심 있는 장기, 영역, 영역 또는 세포 유형을 표적으로 삼는 데 높은 적응성을 제공한다는 것입니다. 이 방법은 내강과 장기 실질이 있는 장기에 사용하기 위해 쉽게 적용할 수 있습니다. 시작하려면 마이크로피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 날카로운 지점으로 당깁니다.
한 쌍의 테이퍼 형 초미세 팁 집게를 사용하여 해부 현미경으로 당겨진 모세관의 뾰족한 끝을 잘라내어 구멍을 만듭니다. 개구부가 너무 크지 않은지 확인하십시오., 난관을 손상시키고 느린 주입을 방지하십시오. 다음으로, 멸균 수술 장비, 현미경, 미세 조작기 및 전기 처리기를 깨끗하고 멸균된 벤치 또는 생물 안전 캐비닛 내부에 배치합니다.
디스크의 가열 패드를 가열하고 깨끗하고 완비된 케이지 아래에 놓습니다. 멸균된 1X PBS를 페트리 접시에 붓습니다. 깨끗한 가위를 사용하여 흡수지를 1x1cm 정사각형으로 자릅니다.
이것을 PBS에 떨어뜨려 담그십시오. 다음으로, 당겨진 모세관 바늘을 마그네틱 마운트로 안정화된 클램프 마운트 마이크로매니퓰레이터에 부착합니다. 2 마이크로 리터의 주입 용액을 멸균 된 페트리 접시에 피펫팅합니다.
현미경으로 관찰하면서 미세 조작기에 부착 된 공기 압력 주사기를 사용하여 주입 용액의 1-2 마이크로 리터를 미세 주입 바늘에 천천히 흡수합니다. 바늘에 기포가 들어가지 않도록 하십시오. 생후 6-8주 된 암컷 마우스를 마취시키고 카프로펜을 피하 투여한 후 가열된 흡수지 위에 마우스를 등쪽이 위로 향하게 하여 놓습니다.
수술 중 건조를 방지하기 위해 각 눈에 눈 윤활제를 바르십시오. 한 쌍의 집게로 발가락을 꼬집어 마취 정지를 확인한 후, 장래의 절개 부위 주변의 등 털을 제거하고 맨살을 방부제로 닦아냅니다. 한 쌍의 곧고 뭉툭한 집게를 사용하여 맨살을 꼬집고 멸균 가위를 사용하여 신체 정중선을 따라 1cm 길이의 절개를 만듭니다.
한 쌍의 멸균 Adson 집게를 사용하여 절단 부위의 한쪽을 꼬집고 잡습니다. 그런 다음 한 쌍의 멸균되고 구부러진 톱니 모양의 집게를 사용하여 정중선 절개에서 시작하여 측면으로 움직여 체벽에서 피부를 부드럽게 분리합니다. 신장 아래에 지방 패드를 배치한 후 멸균되고 곧고 뭉툭한 집게를 사용하여 지방 패드 바로 위의 체벽을 꼬집습니다.
혈관을 피하도록 주의하면서 멸균되고 날카롭고 뾰족한 해부 가위를 사용하여 체벽에 작은 절개를 만듭니다. 똑 바르고 뭉툭한 집게로 체벽을 꼬집으면서 한 쌍의 무균, 무딘, 구부러진 집게를 절개 부위에 삽입하고 체벽에 생성 된 절개를 넓힌다. 뭉툭하고 구부러진 집게로 보이는 지방 패드를 잡고 구멍에서 당겨 난소, 난관 및 자궁을 노출시킵니다.
멸균 불독 클램프로 지방 패드를 고정하여 생식 트랙을 노출된 상태로 유지하십시오. 해부 현미경의 무대에 노출 된 생식 트랙과 함께 마취 된 마우스를 조심스럽게 놓습니다. 용액이 있는 주사 바늘이 현미경으로 관찰되도록 미세 매니퓰레이터를 조정합니다.
그런 다음 현미경을 조작하여 난소, 난관 및 자궁을 쉽게 관찰하십시오. 한 쌍의 멸균되고 가늘어지는 초미세 팁 집게를 사용하여 주입할 난관 부위를 잡습니다. 영역은 미세 주입 바늘의 방향과 일치해야 합니다.
미세 매니퓰레이터를 조정하여 미세 주사 바늘로 난관을 뚫는 동시에 테이퍼 형 초미세 팁 집게를 사용하여 난관을 바늘에 공급합니다. 미세 주입 바늘을 부드럽게 움직여 난관에 삽입되었는지 확인합니다. 1마이크로리터의 주입액과 5% 여과된 트리판 블루를 난관에 천천히 주입하면서 청색 용액의 움직임과 난관 내강의 확장을 관찰합니다.
루멘에 기포가 들어가지 않도록 하십시오. 주사 후 난관에서 바늘을 제거하고 PBS에 미리 담근 흡수성 종이로 표적 부위를 덮습니다. 미리 적신 종이와 대상으로 할 부위를 전극 핀셋으로 잡고 본체에서 당겨 빼냅니다.
1초 간격으로 50밀리초 동안 30V에서 3개의 단극 펄스를 사용하여 대상 영역을 전기천공합니다. 전기 천공 후 흡수지를 제거하고 마우스를 가열 패드에 다시 놓습니다. 불독 클램프를 풀고 노출된 생식 트랙을 체벽 아래로 조심스럽게 밀어 넣습니다.
두 난관을 모두 전기천공하고 체벽 아래에 다시 놓은 후 바늘 홀더를 사용하여 바늘을 잡습니다. 한 쌍의 멸균되고 구부러진 톱니 모양의 집게를 사용하여 절단 부위의 한쪽을 꼬집고 잡습니다. 그런 다음 바늘 홀더를 사용하여 봉합사를 조작하고 상처를 봉합합니다.
가열 패드 위에 놓인 깨끗한 케이지로 마우스를 옮기고 마우스가 활성화될 때까지 모니터링합니다. 3mm 또는 1mm 핀셋 유형 전극을 사용하여 전기천공할 때 TdTomato로 표지된 표적 영역은 원위 난관 상피로 제한되었습니다. 3mm 핀셋형 전극의 경우 1mm 핀셋형 전극을 사용하여 말단의 가장 끝인 infundibulum만 표적으로 삼는 것과 비교하여 팽대부의 훨씬 더 넓은 영역을 표적으로 삼았습니다.
표적 영역에서, TdTomato에 의해 표시된 전기천공된 세포는 전기되지 않은 세포들 사이에 무작위로 분포되었다. 또한, 전기천공된 세포는 점막 상피로 제한되었고 하부 기질 또는 근육층에서 관찰되지 않았습니다. CRISPR 매개 게놈 편집을 확인하기 위해 DNA 분리 및 염기서열 분석을 위한 FACS 분류를 통해 형광 세포를 분리할 수 있습니다.
이를 통해 우리는 표적 대립 유전자의 빈도를 정량화하고 샘플 간의 고유한 통신을 추적하여 면역 적격 환경에서 원발성 종양의 생체 내 관상 진화와 전이를 추적할 수 있습니다.
