우리는 Brigham and Women's Hospital과 Harvard Medical School의 Mel Feany 박사에게 대조군과 알파 시누클레인 발현 초 파리 계통의 친절한 선물을 주신 것을 인정합니다. NINDS K08, American Parkinson Disease Association George C. Cotzias Fellowship, Department of Defense Parkinson's Disease Early Investigator Award와 같은 Olsen 박사에 대한 보조금 지원 출처를 인정합니다.

이 분석에 사용된 파리: 대조군: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; 알파 시누클레인 파리: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+; 1일 및 10일 후 폐쇄; 수컷과 암컷(짝짓기 및 짝짓기 없음) 파리( 재료 표 참조).
1. 염색 된 플라이 푸드 준비
<ol><li>파란색 소프트 젤 페이스트 식용 색소( 재료 표 참조)와 증류수를 1:1 비율(v/v)로 혼합합니다. 참고: 일부 파란색 염료는 신경 보호 효과가 있는 것으로 나타났으므로 비흡수성 염료만 포함된 상업용 식용 색소를 사용하십시오21.</li>
	<li>음식이 액체나 슬러리로 녹을 때까지 10-15초 간격으로 표준 옥수수 가루 한천( 재료 표 참조)으로 구성된 플라이 푸드 바이알을 전자레인지에 돌립니다. 음식이 끓지 않도록 하십시오.</li>
	<li>염료 혼합물을 식품의 각 바이알에 첨가하여 바이알 사이에 균일한 착색을 얻습니다. 식품이 균일한 파란색이 될 때까지 염료 혼합물을 혼합합니다(그림 1). 음식의 색이 포화되고 바이알 사이의 색이 변하지 않도록 파란색 염료 혼합물을 약간 첨가하십시오. 알림: 이 단계는 음식이 빨리 굳기 때문에 전자레인지 직후에 수행해야 합니다. 음식이 굳으면 바이알을 다시 전자레인지에 돌리십시오.</li>
	<li>염색된 음식의 바이알이 굳을 때까지 공기 중에서 말리십시오. 건조하는 동안 바이알 입구에 얇은 종이 타월을 놓아 길 잃은 파리가 바이알에 떨어지지 않도록 합니다.</li>
	<li>음식이 식고 굳어지면 테스트에 사용할 파리를 파란색 음식으로 옮깁니다. 알림: 좁은 바이알(25mm)의 경우 각 바이알에 9-14개의 파리를 추가하는 것이 좋습니다. 넓은 바이알(28.5mm)의 경우 각 바이알에 10-20개의 파리를 추가하는 것이 좋습니다. 파리는 성별이나 짝짓기 경험에 의해 분리되지 않으며 짝짓기 된 암컷과 짝짓기하지 않은 암컷과 함께 수컷과 암컷의 혼합 개체군을 포함합니다.</li>
	<li>파리가 있는 바이알을 인큐베이터에서 25°C에서 밤새 배양합니다.</li>
</ol>2. 파리 이미징
참고: 이 단계는 선택 사항입니다(그림 2).
<ol><li>다음날 아침 (시간 0), 대표 파리를 60 초 동안 이산화탄소로 마취시킵니다. 복부 쪽이 위쪽을 향하도록 파리를 놓습니다.</li>
	<li>카메라( 재료 표 참조)를 사용하여 매시간 파리의 이미지를 캡처하여 소화 시스템에 남아 있는 파란색 음식의 양을 시각화합니다. 알림: 이 파리는 마취가 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 분석의 정량 부분(3단계)에 사용해서는 안 됩니다.</li>
	<li>매 시간마다 새로운 파리를 마취하고 이미지를 촬영하십시오.</li>
</ol>3. 변비 분석 수행
<ol><li>나머지 (마취되지 않은) 파리는 표준 초파리 사료가 담긴 바이알로 옮깁니다. 각 바이알에 번호를 매깁니다.</li>
	<li>파리를 25°C의 인큐베이터에서 60분 동안 그대로 둡니다.</li>
	<li>60분 후, 파리를 표준 초파리 사료와 함께 새 유리병으로 옮깁니다. 첫 번째 바이알 세트에서 데이터 기록을 시작합니다.</li>
	<li>바이알 길이 아래에 점선을 그려 카운팅이 시작되는 지점을 표시합니다.</li>
	<li>각 바이알의 벽에 있는 작고 둥근 점의 수를 수동으로 계산합니다. 음식이나 바이알 플러그에 있는 점을 세지 마십시오.</li>
	<li>각 바이알의 벽에 있는 파란색 점의 수를 세는 것으로 시작합니다.</li>
	<li>각 유리병의 벽에 있는 불투명하고 무색의 점의 수를 세십시오. 참고: 각 점은 소변과 배설물의 조합인 파리 배설물입니다22. 때때로 파리가 배설물 위를 걸어 다니며 흔적을 남길 수 있으며, 이 경우 흔적의 각 개별 표시가 아닌 원래 점만 계산합니다.</li>
	<li>각 바이알의 총 점 수에 대한 파란색 점의 비율을 기록합니다. 알림: 총 점 수는 동일한 바이알 벽에 있는 무색 점 수에 바이알 벽에 있는 파란색 점 수를 더한 것입니다. 이것은 시간당 파란색 배설물의 백분율을 계산하는 데 사용됩니다.</li>
	<li>3.2-3.8단계를 7번 더 반복하여 총 8시간 동안 매시간 데이터를 수집합니다.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>각 조건에 대해 시간당 파란색 배설물 비율을 그래프로 표시합니다.</li>
	<li>조건 간의 데이터를 비교합니다. 참고: 통계적 유의성은 조건 간의 개별 시점을 비교하거나, 시간 경과에 따른 선의 기울기를 측정하거나, 곡선 아래 면적을 비교하는 3가지 방법으로 결정할 수 있습니다.</li>
</ol>

Drosophila Flies의 변비 분석

<ol>
	<li>Kalia, L. V., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).</li><li>Bloem, B. R., Okun, M. S., Klein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease.">Parkinson's disease.</a> Lancet. 397 (10291), 2284-2303 (2021).</li><li>Ball, N., Teo, W. P., Chandra, S., Chapman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+and+the+environment.">Parkinson's disease and the environment.</a> Front Neurol. 10, 218 (2019).</li><li>Zhou, J., Li, J., Papaneri, A. B., Kobzar, N. P., Cui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+neuron+challenge+test+for+early+detection+of+Parkinson's+disease.">Dopamine neuron challenge test for early detection of Parkinson's disease.</a> NPJ Parkinsons Dis. 7 (1), 116 (2021).</li><li>Ueki, A., Otsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+style+risks+of+Parkinson's+disease:+association+between+decreased+water+intake+and+constipation.">Life style risks of Parkinson's disease: association between decreased water intake and constipation.</a> J Neurol. 251 (Suppl 7), vII18-vII23 (2004).</li><li>Houser, M. C., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gut-brain+axis:+is+intestinal+inflammation+a+silent+driver+of+Parkinson's+disease+pathogenesis.">The gut-brain axis: is intestinal inflammation a silent driver of Parkinson's disease pathogenesis.</a> NPJ Parkinsons Dis. 3, 3 (2017).</li><li>Pfeiffer, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-motor+symptoms+in+Parkinson's+disease.">Non-motor symptoms in Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat Disord. 22 (Suppl 1), (2016).</li><li>Klann, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gut-brain+axis+and+its+relation+to+parkinson's+disease:+A+review.">The Gut-brain axis and its relation to parkinson's disease: A review.</a> Front Aging Neurosci. 13, 782082 (2021).</li><li>Mukherjee, A., Biswas, A., Das, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+dysfunction+in+Parkinson's+disease.">Gut dysfunction in Parkinson's disease.</a> World J Gastroenterol. 22 (25), 5742-5752 (2016).</li><li>Yemula, N., Dietrich, C., Dostal, V., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson's+disease+and+the+gut:+symptoms,+nutrition,+and+microbiota.">Parkinson's disease and the gut: symptoms, nutrition, and microbiota.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1491-1505 (2021).</li><li>Chen, S. J., Lin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microenvironmental+changes+as+a+potential+trigger+in+Parkinson's+disease+through+the+gut-brain+axis.">Gut microenvironmental changes as a potential trigger in Parkinson's disease through the gut-brain axis.</a> J Biomed Sci. 29 (1), 54 (2022).</li><li>Hawrysh, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRKN/parkin-mediated+mitophagy+is+induced+by+the+probiotics+Saccharomyces+boulardii+and+Lactococcus+lactis.">PRKN/parkin-mediated mitophagy is induced by the probiotics Saccharomyces boulardii and Lactococcus lactis.</a> Autophagy. 19 (7), 2094-2110 (2023).</li><li>Liu, W., Lim, K. L., Tan, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestine-derived+&#945;-synuclein+initiates+and+aggravates+pathogenesis+of+Parkinson's+disease+in+Drosophila.">Intestine-derived &#945;-synuclein initiates and aggravates pathogenesis of Parkinson's disease in Drosophila.</a> Transl Neurodegener. 11 (1), 44 (2022).</li><li>Rota, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constipation,+deficit+in+colon+contractions+and+alpha-synuclein+inclusions+within+the+colon+precede+motor+abnormalities+and+neurodegeneration+in+the+central+nervous+system+in+a+mouse+model+of+alpha-synucleinopathy.">Constipation, deficit in colon contractions and alpha-synuclein inclusions within the colon precede motor abnormalities and neurodegeneration in the central nervous system in a mouse model of alpha-synucleinopathy.</a> Transl Neurodegener. 8, 5 (2019).</li><li>Diwakarla, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATH434+reverses+colorectal+dysfunction+in+the+A53T+mouse+model+of+Parkinson's+disease.">ATH434 reverses colorectal dysfunction in the A53T mouse model of Parkinson's disease.</a> J Parkinsons Dis. 11 (4), 1821-1832 (2021).</li><li>Ordonez, D. G., Lee, M. K., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#945;-synuclein+Induces+mitochondrial+dysfunction+through+spectrin+and+the+actin+cytoskeleton.">&#945;-synuclein Induces mitochondrial dysfunction through spectrin and the actin cytoskeleton.</a> Neuron. 97 (1), 108.e6-124.e6 (2018).</li><li>Olsen, A. L., Feany, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+&#945;-synuclein+promotes+neurodegeneration+characterized+by+a+distinct+transcriptional+program+in+vivo.">Glial &#945;-synuclein promotes neurodegeneration characterized by a distinct transcriptional program in vivo.</a> Glia. 67 (10), 1933-1957 (2019).</li><li>Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neurons+and+systemic+signals+couple+nutritional+and+reproductive+status+with+intestinal+homeostasis.">Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis.</a> Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).</li><li>Urquhart-Cronish, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-environment+interplay+in+Drosophila+melanogaster:+chronic+nutritional+deprivation+in+larval+life+affects+adult+fecal+output.">Gene-environment interplay in Drosophila melanogaster: chronic nutritional deprivation in larval life affects adult fecal output.</a> J Insect Physiol. 69, 95-100 (2014).</li><li>Popovic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blocking+dPerk+in+the+intestine+suppresses+neurodegeneration+in+a+Drosophila+model+of+Parkinson's+disease.">Blocking dPerk in the intestine suppresses neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson's disease.</a> Cell Death Dis. 14 (3), 206 (2023).</li><li>Poteet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+actions+of+methylene+blue+and+its+derivatives.">Neuroprotective actions of methylene blue and its derivatives.</a> PLoS One. 7 (10), e48279 (2012).</li><li>Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+digestive+tract+of+Drosophila+melanogaster.">Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).</li><li>Schlichting, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neural+network+underlying+circadian+entrainment+and+photoperiodic+adjustment+of+sleep+and+activity+in+Drosophila.">A neural network underlying circadian entrainment and photoperiodic adjustment of sleep and activity in Drosophila.</a> J Neurosci. 36 (35), 9084-9096 (2016).</li></ol>

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이 프로토콜에는 분석을 성공적으로 완료하는 데 도움이 되는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 각 바이알에 대한 각 라운드 사이의 시간 간격이 실험 전반에 걸쳐 일관되도록 하는 것이 중요합니다. 바이알에 번호를 표시하면 긴 유전자형 설명의 필요성을 피하고 시간을 절약하는 데 도움이 됩니다. 또한, 배설물(22 )을 계수하는 방법이 실험 전반에 걸쳐 일관되게 유지되는 것이 중요하다. 파란색 배설물은 음식과 바이알 플러그에서 볼 수 있지만 무색의 배설물은 보이지 않습니다. 따라서 음식이나 바이알 플러그의 파란색 점을 세지 마십시오.
행동 분석에서는 파리 행동의 변동 또는 분석에 영향을 미치는 알 수 없는 변수로 인해 결과가 일치하지 않을 가능성이 항상 있습니다. 모든 실험에 동일한 초파리 배지, 동일한 식용 염료 및 동일한 브랜드의 바이알을 사용하는 것이 좋습니다. 흥미롭게도, 몇몇 실험에서 파리는 이른 오후에 배변을 덜 하는 경향이 있는 것으로 관찰되었는데, 이는 아마도 파리의 일주기 리듬23 때문일 것이다. 그러나, 이 행동은 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리 둘 다에서 일관됩니다, 그래서 우려를 일으키면 안됩니다.
분석 초기에 파리가 푸른 배설물을 배설하지 않으면 사용된 염료가 충분히 착색되지 않았을 수 있습니다. 이 경우 그에 따라 염료와 증류수의 비율을 높일 수 있습니다. 또한 파리의 소화관에 소량의 파란색 음식만 남아 있을 때 배설물이 옅은 파란색인지 무색인지 판단하기 어려울 수도 있습니다. 이런 일이 발생하면 바이알 뒤에 흰색 종이를 놓으면 배설물 점의 색상을 결정하는 데 도움이 됩니다. 배설물이 매우 연한 파란색일지라도 무색의 배설물보다는 파란색 배설물로 기록하는 것이 가장 좋습니다.
이 분석의 한 가지 한계는 대변 반점을 수동으로 계산해야 한다는 것입니다. 고처리량 스크리닝의 가능성을 개선하기 위해 이 프로토콜은 향후 다중 웰 플레이트에서 개별 파리에 의해 생성된 청색 분변 반점을 자동으로 정량화할 수 있도록 수정될 수 있습니다. 또 다른 한계는, 알파 synuclein 모형이 PD의 전구 모형으로 발전되는 잠재력이 있더라도, 변비가 neurodegeneration 없이 출석하는 최선 시점이 아직 확인되지 않았다 입니다.
요약하면, 이 방법은 PD의 초파리 모델에서 연구가 부족한 비운동 PD 증상인 변비를 모델링하는 간단하고 직접적인 접근 방식을 제공합니다.

파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 진행성 신경퇴행성 질환으로, 서동, 경직, 떨림과 같은 운동 증상이 임상적으로 나타나 상당한 이환율을 초래한다1. 병리학적으로, PD는 흑질에 있는 도파민 신경 세포의 손실 및 알파 synuclein의 misfolding에 의해 정의되, Lewy 몸 및 Lewy neurites의 대형으로 이끌어 내. 파킨슨병의 발병 기전은 아직 잘 알려져 있지 않은데, 이는 유전적 요인과 환경적 요인의 복잡한 상호작용에 기인하는 것으로 보인다 2,3. 현재로서는 질병 수정 요법을 사용할 수 없으며, 이는 부분적으로 진단 당시 병리학의 진행된 단계 때문일 수 있습니다. 연구에 따르면 흑질에 있는 도파민 뉴런의 60% 이상이 운동 증상의 시작으로 이미 소실된 것으로 나타났으며, 이는 질병 조기 발견을 위한 잠재적인 바이오마커를 탐색해야 할 필요성을 강조합니다4. 이러한 임상적 바이오마커 중 하나는 변비인데, 변비는 파킨슨병 환자에서 흔히 발생하며5,6 운동 증상 발현보다 수년 또는 수십 년 전에 나타날 수 있다.
운동 증상에 근거한 복막투석의 임상적 정의에도 불구하고, 변비는 증상적으로 치료하기 어렵고 환자의 삶의 질에 심각한 손상을 초래하는 여러 비운동 증상 중 하나이다7. 뇌와 장 신경계 사이의 양방향 통신을 나타내는 장-뇌 축의 변화는 PD 발병과 관련이 있습니다. 알파-시누클레인 응집체는PD 환자8의 위장관에서 채취한 조직 샘플에서 발견되었으며, 동물 모델은 장 신경계의 알파-시누클레인 응집체가 프리온과 같은 방식으로 중추 신경계(9)에 퍼진다는 것을 시사한다. 또한, 복막투석 환자는 장내 마이크로바이옴(microbiome)10에 이상을 보이며 과도한 장내 염증을 경험할 수 있다11. 파킨슨병의 변비는 파리(12,13) 또는 설치류(14,15)에서 파킨슨병과 관련된 변비에 대한 보고된 모델은 거의 없는 등 연구가 부족했다.
이 분석실험은 파리가 범 뉴런 드라이버인 n-synaptobrevin의 통제하에 인간 알파-시누클레인 유전자를 발현하는 PD의 초파리 모델을 사용합니다. 이 파리는 알파-시누클레인 응집, 운동 기능 장애 및 노화 관련 신경 퇴행을 포함한 PD의 모든 특징을 나타내어 도파민 뉴런16,17의 손실을 초래합니다. 이전 연구에서는 소화 시스템의 기능적 차이를 밝히기 위해 파리의 배설물 배출량을 측정하고, 파리의 배설물을 정량화하고, 다양한 유전 계통에 걸쳐 배설량을 비교하는 방법을 도입했습니다 18,19,20. 여기에서, 우리는 인간 알파 시누클레인을 발현하는 파리를 이용한 변비 분석을 시연한다. 이 간단하지만 유용한 도구를 사용하면 PD의 중요한 비운동 증상을 연구할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1400 g sucrose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>904713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1800 g dextrose</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>901521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2884 g yeast</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>903312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>428 g agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10253156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4600 mL molasses</td>
			<td>Grandma&#39;s Molasses</td>
			<td>7971942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>68 L water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6864 g cornmeal</td>
			<td>Pearl Milling</td>
			<td>125045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Pharmco-Aper</td>
			<td>111ACS200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flugs for wide plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>49-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Version 9.5.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus DP23 camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12 Stereo Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphoric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S25470A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A258 - 500&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft gel paste food color, Royal blue</td>
			<td>AmeriColor</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tegosept</td>
			<td>Apex</td>
			<td>20-258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Stocks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4</td>
			<td>All lines provided by Dr. Mel Feany</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Lines are available directly from Dr. Feany&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>w1118</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring constipation in a drosophila model of parkinson's disease

파킨슨병(PD)의 비운동 증상은 흔하고 치료가 어려우며 삶의 질을 크게 떨어뜨립니다. 흔한 비운동 증상 중 하나는 변비인데, 변비는 파킨슨병 진단보다 수년 또는 수십 년 앞설 수 있습니다. 변비는 PD의 동물 모델에서 충분히 연구되지 않았으며 특별한 치료법이 부족합니다. 이 분석실험은 PD의 초파리 모형을 이용합니다 인간 알파 synuclein가 pan 신경 운전사의 밑에 표현되는 곳. 알파 synuclein를 표현하는 파리는 PD의 특징을 개발합니다: 도파민성 신경 세포의 손실, 운동 손상 및 알파 synuclein 포함.
이 프로토콜은 이 파리의 변비를 연구하는 방법을 설명합니다. 파리는 밤새 파란색 첨가물이 첨가된 플라이 사료에 넣은 다음 다음날 표준 사료로 옮깁니다. 그런 다음 8시간 동안 매시간 표준 플라이 푸드가 있는 새 바이알로 옮겨집니다. 각 이식 전에 바이알 벽의 총 분변 반점 대비 파란색 분변 반점의 비율이 계산됩니다. 알파 시누클레인이 결핍된 대조군은 알파 시누클레인을 발현하는 파리가 생기기 전에 모든 청색 염료를 배출합니다. 또한 장에서 파란색 음식물이 통과하는 것을 간단한 사진으로 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법의 단순성으로 인해 전방 유전 또는 화학 스크리닝에서 초파리의 변비 조절 인자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

초파리의 복부는 투명하기 때문에 살아있는 마취된 파리의 장 안에서 푸른 음식을 시각화할 수 있습니다. 장 이동의 질적 차이는 다양한 시점에서 파리의 이미지를 촬영하여 평가할 수 있습니다. 대조군 파리에서는 파란색 음식이 빠르게 배출되는 반면 알파 시누클레인 파리에서는 파란색 음식이 8시간 동안 장에 존재합니다(그림 2).
알파 synuclein 파리는 eclosion10 후에 10 일까지 발달하는 튼튼한 표현형과 더불어 나이 관련 neurodegeneration를, 표시합니다. 이 시점에서 대조군과 비교할 때 장 통과 시간의 차이는 조건 간의 개별 시점을 비교하거나, 시간 경과에 따른 선의 기울기를 측정하거나, 곡선 아래 면적을 비교하여 확인할 수 있습니다(그림 3). 운동 역기능과 neurodegeneration가 또한 아직 출석하지 않을 때 통제와 알파 synuclein 파리 사이 내장 이동에서 다름은 또한 출석하지 않는 더 이른 시점, 1 일 후에 eclosion (숫자 4)에서 관찰되지 않습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2.jpg"> 그림 1: 파란색 식품 바이알과 배설물 반점. (A) 모든 바이알에는 파란색 식품이 들어 있습니다. 이 시점에서 파리는 이제 막 파란 음식에 들어갔고 파란 배설물은 보이지 않습니다. (B) w1118 파리가 날아간 후 바이알을 1시간 동안 신선한 음식으로 옮긴 다음 제거했습니다. 왼쪽 삽입은 (C)에서 확대되고 오른쪽 삽입은 (D)에서 확대됩니다. (C) 파리 먹이의 존재로 인해 분석에서 제외된 영역. (D) 파란색(검은색 화살표)과 파란색이 아닌 반점(노란색 화살표)을 나타내는 배설물 반점의 확대 보기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig02.jpg"> 그림 2: 시간 경과에 따른 염색된 식품의 장 이동의 시각화. 신경 세포에 있는 인간 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리는 파랗 염색한 음식에 밤새 남겨두었다가 그 후에 표준 매체로 옮겼다. 파리는 매시간 새로운 표준 파리 먹이로 순차적으로 옮겨졌습니다. 전송 후 시간 0과 2, 4, 6, 8시간의 대표 이미지가 표시됩니다. 대조군과 알파 시누클레인 파리는 시간 0에서 장에 있는 파란 음식의 유사한 헝겊 조각을 보여줍니다. 후속 시점에서, 대조군 파리는 알파-시누클레인 파리보다 파란색 음식이 적고, 모든 파란색 음식은 대조군 파리의 8시간 시점에서 사라집니다. 각 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같습니다: 대조군(nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); 알파-시누클레인(nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+)이 날아갑니다. 암컷 파리는 크기가 더 크기 때문에 복부를 시각화하는 능력이 더 쉽기 때문에 이미징에 사용됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2.jpg"> 그림 3: 폐실 후 10일째 변비 분석 . 신경 세포에 있는 인간 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리는 밤새 파랗 염색한 음식에 남겨두었다가 그 후에 표준 비행거리 음식으로 옮겼다. 파리는 매시간 새로운 표준 매체로 순차적으로 옮겨졌습니다. (A) 시간당 파란색 배설물 비율. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. N = 유전자형당 6개의 바이알; 각 유리병에는 9-14마리의 파리가 들어 있었습니다. 모든 통계 분석은 Graphpad Prism에서 수행되었습니다( 재료 표 참조). 각 시점에서의 통계적 유의성은 이원 분산 분석을 사용하여 계산되었습니다. 선의 기울기와 기울기의 차이는 선형 회귀 분석을 사용하여 계산되었습니다. (B) 각 유전자형에 대한 곡선 아래 면적을 계산했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같습니다: 대조군(nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); 알파-시누클레인(nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+)이 날아갑니다. 수컷과 암컷 파리는 거의 같은 수로 포함됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2.jpg"> 그림 4: 폐실 후 1일차의 변비 분석. 신경 세포에 있는 인간 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리는 파랗 염색한 음식에 밤새 남겨두었다가 그 후에 표준 매체로 옮겼다. 파리는 매시간 새로운 표준 파리 먹이로 순차적으로 옮겨졌습니다. (A) 시간당 파란색 배설물 비율. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. N = 유전자형당 최소 5개의 바이알; 각 유리병에는 9-14마리의 파리가 들어 있었습니다. 모든 통계 분석은 Graphpad Prism에서 수행되었습니다. 각 시점에서의 통계적 유의성은 이원 분산 분석을 사용하여 계산되었습니다. 선의 기울기와 기울기의 차이는 선형 회귀 분석을 사용하여 계산되었습니다. (B) 각 유전자형에 대한 곡선 아래 면적을 계산했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같습니다: 대조군(nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); 알파-시누클레인(nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+)이 날아갑니다. 수컷과 암컷 파리는 거의 같은 수로 포함됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65966/65966fig4v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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저자 스포트라이트: 파킨슨병의 비운동 증상 탐구 

이 프로토콜은 파킨슨병의 알파 시누클레인 기반 초파리 모델에서 변비를 모델링하기 위한 분석을 제시합니다.

파킨슨병의 초파리 모델에서 변비 측정

Non-motor symptoms in Parkinson's disease (PD) are common, difficult to treat, and significantly impair quality of life. One prevalent non-motor symptom ...

파킨슨병은 서운동증, 떨림, 경직 등의 운동 증상으로 정의됩니다. 그러나 파킨슨병을 앓고 있는 많은 환자들은 치료가 더 어렵고 삶의 질에 더 큰 손상을 초래하는 비운동 증상으로 고통받고 있습니다. 이러한 질병의 동물 모델에서는 잘 연구되지 않았으며, 이는 새로운 치료법을 찾는 우리의 능력을 제한합니다.이 프로토콜은 간단하고 저렴하지만 재현 가능한 결과를 생성합니다. 배우기 쉽고 특수 장비가 필요하지 않습니다. 이 간단한 분석으로 신경 퇴행이 있는 파리의 변비를 평가할 수 있습니다.앞으로는 신경퇴행이 시작되기 전에 파리가 변비를 앓는 모델을 개발하고자 합니다. 이를 통해 파킨슨병의 발병 기전을 더 잘 이해할 수 있습니다.

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Measuring Constipation in a Drosophila Model of Parkinson's Disease

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1.3K 조회수.  University of Pittsburgh. 파킨슨병은 서운동증, 떨림, 경직 등의 운동 증상으로 정의됩니다. 그러나 파킨슨병을 앓고 있는 많은 환자들은 치료가 더 어렵고 삶의 질에 더 큰 손상을 초래하는 비운동 증상으로 고통받고 있습니다. 이러한 질병의 동물 모델에서는 잘 연구되지 않았으며, 이는 새로운 치료법을 찾는 우리의 능력을 제한합니다.이 프로토콜은 간단하고 저렴하지만 재현 가능한 결과를...

비디오: 저자 스포트라이트: 파킨슨병의 비운동 증상 탐구 

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, primarily in the substantia nigra. The disease causes motor deficiencies, which present as rigidity, tremors and dementia in humans. Rotenone is an insecticide that causes oxidative damage by inhibiting the function of the electron transport chain in mitochondria. It is also used to model Parkinson&#8217;s disease in the Drosophila. Flies have an inherent negative geotactic response, which compels them to climb upwards upon being startled. It has been established that rotenone causes early mortality and locomotion defects that disrupt the flies&#8217; ability to climb after they have been tapped downwards. However, the effect of rotenone on spontaneous movement is not well documented. This study outlines two sensitive, reproducible, and high throughput assays to characterize rotenone-induced deficiencies in short-term startle-induced locomotion and long-term spontaneous locomotion in Drosophila. These assays can be conveniently adapted to characterize other Drosophila models of locomotion defects and efficacy of therapeutic agents.

Methods to Characterize Spontaneous and Startle-induced Locomotion in a Rotenone-induced Parkinson's Disease Model of Drosophila

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, causing locomotion defects. Rotenone models Parkinson&#8217;s disease in Drosophila. This paper outlines two assays that characterize both spontaneous and startle-induced locomotion deficiencies caused by rotenone.

방법은 자발적인 특성화 및 놀라게 유도 로코을의 로테 논에 의한 파킨슨 병 모델에서합니다<em&gt; 초파리</em

Parkinson&#8217;s disease is a neurodegenerative disorder that results from the degeneration of dopaminergic neurons in the central nervous system, ...

연구

신경과학

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.

측정과 남성의 변경 결합 드라이브<em&gt; 노랑 초파리</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

Vivo에서 단일 분자 초파리 연 접 모터 신경 맨끝에 추적

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. Drosophila larval neuronal dendritic arborization (da) is an ideal model for studying morphogenesis of neural dendrites and gene function in the development of nervous system. There are four classes of da neurons. Class IV is the most complex with a branching pattern that covers almost the entire area of the larval body wall. We have previously characterized the effect of silencing the Drosophila ortholog of SOX5 on class IV neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) using four parameters: the length of dendrites, the surface area of dendrite coverage, the total number of branches, and the branching structure. This protocol presents the workflow of NDAC quantitative analysis, consisting of larval dissection, confocal microscopy, and image analysis procedures using ImageJ software. Further insight into da neuronal development and its underlying mechanisms will improve the understanding of neuronal function and provide clues about the fundamental causes of neurological and neurodevelopmental disorders.

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

This protocol focuses on quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity (NDAC) in Drosophila, which can be used for studies of dendritic morphogenesis.

초파리 에서 신경 돌기 Arborization 복잡성의 정량 분석

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model Parkinson&#39;s disease synucleinopathy and nigrostriatal degeneration. The standardization of &#945;-syn PFF generation and in vivo application is critical in order to ensure consistent, robust &#945;-syn pathology. Here, we present a detailed protocol for the generation of fibrils from monomeric &#945;-syn, post-fibrilization quality control steps, and suggested parameters for successful neurosurgical injection of &#945;-syn PFFs into rats or mice. Starting with monomeric &#945;-syn, fibrilization occurs over a 7-day incubation period while shaking at optimal buffer conditions, concentration, and temperature. Post-fibrilization quality control is assessed by the presence of pelletable fibrils via sedimentation assay, the formation of amyloid conformation in the fibrils with a thioflavin T assay, and electron microscopic visualization of the fibrils. Whereas successful validation using these assays is necessary for success, they are not sufficient to guarantee PFFs will seed &#945;-syn inclusions in neurons, as such aggregation activity of each PFF batch should be tested in cell culture or in pilot animal cohorts. Prior to use, PFFs must be sonicated under precisely standardized conditions, followed by examination using electron microscopy or dynamic light scattering to confirm fibril lengths are within optimal size range, with an average length of 50 nm. PFFs can then be added to cell culture media or used in animals. Pathology detectable by immunostaining for phosphorylated &#945;-syn (psyn; serine 129) is apparent days or weeks later in cell culture and rodent models, respectively.&#160;

The goal of this article is to outline the steps required for the generation of fibrils from monomeric alpha-synuclein, subsequent quality control, and use of the preformed fibrils in vivo.

모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Applying the RatWalker System for Gait Analysis in a Genetic Rat Model of Parkinson's Disease

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta. Gait abnormalities, including decreased arm swing, slower walking speed, and shorter steps are common in PD patients and appear early in the course of disease. Thus, the quantification of motor patterns in animal models of PD will be important for phenotypic characterization during disease course and upon therapeutic treatment. Most cases of PD are idiopathic; however, the identification of hereditary forms of PD uncovered gene mutations and variants, such as loss-of-function mutations in Pink1 and Parkin, two proteins involved in mitochondrial quality control that could be harnessed to create animal models. While mice are resistant to neurodegeneration upon loss of Pink1 and Parkin (single and combined deletion), in rats, Pink1 but not Parkin deficiency leads to nigral DA neuron loss and motor impairment. Here, we report the utility of FTIR imaging to uncover gait changes in freely walking young (2 months of age) male rats with combined loss of Pink1 and Parkin prior to the development of gross visually apparent motor abnormality as these rats age (observed at 4-6 months), characterized by hindlimb dragging as previously reported in Pink1 knockout (KO) rats.

Here we describe the RatWalker system, built by redesigning the MouseWalker apparatus to accommodate for the increased size and weight of rats. This system uses frustrated total internal reflection (FTIR), high-speed video capture, and open-access analysis software to track and quantify gait parameters.

파킨슨병의 유전적 쥐 모델에서 보행 분석을 위한 RatWalker 시스템 적용

Parkinson's disease (PD) is a progressive neurodegenerative disorder caused by the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased stereological counting is the standard for quantification of these cells, but it remains a laborious and time-consuming process, which may not be feasible for all projects. Here, we describe the use of an image analysis platform, which can accurately estimate the quantity of labeled cells in a pre-defined region of interest. We describe a step-by-step protocol for this method of analysis in rat brain and demonstrate it can identify a significant reduction in tyrosine hydroxylase positive neurons due to expression of mutant &#945;-synuclein in the substantia nigra. We validated this methodology by comparing with results obtained by unbiased stereology. Taken together, this method provides a time-efficient and accurate process for detecting changes in dopaminergic neuron number, and thus is suitable for efficient determination of the effect of interventions on cell survival.

Here we present an automated method for semi-quantitative determination of dopaminergic neuron number in the rat substantia nigra pars compacta.

자동 이미지 분석을 사용하여 설치류 모델의 실질적인 Nigra에서 도파민성 뉴런 밀도의 반정량 측정

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...

The 6-hydroxydopamine Rat Model of Parkinson's Disease

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta (SNc) and dopaminergic striatal deficit. Animal models have been widely used to simulate human pathology in the laboratory. Rodents are the most used animal models for PD due to their ease of handling and maintenance. Moreover, the anatomy and molecular, cellular, and pharmacological mechanisms of PD are similar in rodents and humans. The infusion of the neurotoxin, 6-hydroxydopamine (6-OHDA), into a medial forebrain bundle (MFB) of rats reproduces the severe destruction of dopaminergic neurons and simulates PD symptoms. This protocol demonstrates how to perform the unilateral microinjection of 6-OHDA in the MFB in a rat model of PD and shows the motor deficits induced by 6-OHDA and predicted dopaminergic lesions through the stepping test. The 6-OHDA causes significant impairment in the number of steps performed with the contralateral forelimb.

The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model has been used for decades to advance the understanding of Parkinson's Disease. In this protocol, we demonstrate how to perform unilateral nigrostriatal lesions in the rat by injecting 6-OHDA in the medial forebrain bundle, assess motor deficits, and predict lesions using the stepping test.

파킨슨 병의 6- 히드 록시 도파민 쥐 모델

Motor symptoms of Parkinson's disease (PD)-bradykinesia, akinesia, and tremor at rest-are consequences of the neurodegeneration of dopaminergic neurons in ...

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical manifestations include weight loss, dyslipidemia, and hypermetabolism; however, it remains unclear how these relate to motor neuron degeneration. Using a Drosophila model of TDP-43 proteinopathy that recapitulates several features of ALS including cytoplasmic inclusions, locomotor dysfunction, and reduced lifespan, we recently identified broad ranging metabolic deficits. Among these, glycolysis was found to be upregulated and genetic interaction experiments provided evidence for a compensatory neuroprotective mechanism. Indeed, despite upregulation of phosphofructokinase, the rate limiting enzyme in glycolysis, an increase in glycolysis using dietary and genetic manipulations was shown to mitigate locomotor dysfunction and increased lifespan in fly models of TDP-43 proteinopathy. To further investigate the effect on TDP-43 proteinopathy on glycolytic flux in motor neurons, a previously reported genetically encoded, FRET-based sensor, FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, was used. This sensor is comprised of a bacterial glucose-sensing domain and cyan and yellow fluorescent proteins as the FRET pair. Upon glucose binding, the sensor undergoes a conformational change allowing FRET to occur. Using FLII12Pglu-700&#181;&#948;6, glucose uptake was found to be significantly increased in motor neurons expressing TDP-43G298S, an ALS causing variant. Here, we show how to measure glucose uptake, ex vivo, in larval ventral nerve cord preparations expressing the glucose sensor FLII12Pglu-700&#181;&#948;6 in the context of TDP-43 proteinopathy. This approach can be used to measure glucose uptake and assess glycolytic flux in different cell types or in the context of various mutations causing ALS and related neurodegenerative disorders.

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucose uptake is increased in Drosophila motor neurons affected by TAR DNA binding protein (TDP-43) proteinopathy, as indicated by a FRET-based, genetically encoded glucose sensor.

TDP-43 단백질 요법의 드로소필라 모델에서 포도당 섭취 측정

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements known as L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) develop with prolonged use of this dopamine precursor.&#160;It is estimated that the incidence of LIDs escalates to approximately 90% of individuals with PD within 10&#8211;15 years of treatment. Understanding the mechanisms of this malady and developing both novel and effective anti-dyskinesia treatments requires consistent and accurate modeling for pre-clinical testing of therapeutic interventions. A detailed method for reliable induction and comprehensive rating of LIDs following 6-OHDA-induced nigral lesioning in a rat model of PD is presented here. Dependable LID assessment in rats provides a powerful tool that can be readily utilized across laboratories to test emerging therapies focused on reducing or eliminating this common treatment-induced burden for individuals with PD.

This article describes methods to induce and evaluate levodopa-induced dyskinesias in a rat model of Parkinson&#39;s disease. The protocol offers detailed information regarding the intensity and frequency of a range of dyskinetic behaviors, both dystonic and hyperkinetic, providing a reliable tool to test treatments targeting this unmet medical need.

파킨슨 병의 쥐 모델에서 레보도파 유도 운동 장애의 유도 및 평가

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...