이 기술은 살아있는 Drosophila 조직에 있는 특정 세포에 있는 포도당 upup를 측정할 수 있기 때문에 중요합니다. FRET 기반 센서는 세포내 포도당 수치의 변화를 직접 측정합니다. 이 기술은 연구원이 ALS 모형 대 통제에서 살아있는 운동 신경 안에, 실시간으로 포도당 수준에 있는 변경을 평가할 수 있습니다.
어려운 측면은 버퍼를 변경 한 후 뉴런의 동일한 세트를 이미징입니다. 현미경에 샘플을 두면 VMC가 가능한 한 적게 움직이도록 하는 데 도움이 됩니다. 해부를 시작하기 전에 이미징 현미경 및 레이저를 켭니다.
그런 다음 방황하는 세 번째 인스타 애벌레를 수집하고 이중 증류수로 헹구고 이전에 준비된 엘라스토머 안감 접시에 HL3 버퍼 한 방울에 놓습니다. 해부 현미경 아래, 조심스럽게 곤충 핀으로 유충 길이를 스트레칭하여, 애벌레의 전방 및 후방 끝을 고정하는 집게의 쌍을 사용합니다. 각진 아이리스 가위를 사용하여 후부 핀 바로 위에 절개를 합니다.
그런 다음 애벌레의 앞쪽 끝으로 절개에서 수직 절단을합니다. 필요한 경우 HL3 버퍼 몇 방울을 추가 한 후 중추 신경계를 방해하지 않고 기관 및 부동 기관의 나머지 부분을 제거하십시오. 그런 다음 플랩을 고정하고 신경 근육 시스템을 그대로 유지하면서 중추 신경계를 노출시키기 위해 신체 벽을 스트레칭합니다.
이미지 수집을 위해 40배의 수질 침수 렌즈로 수직 공초점 현미경을 사용하십시오. 그런 다음 CFP를 자극하기 위해 405 나노미터 레이저를 선택합니다. 그런 다음 스캔 속도, 평균, 목표, 줌 핀홀 크기 및 공간 해상도와 같은 획득 매개 변수를 최적화합니다.
신호가 최적의 동적 범위에 있도록 게인을 조정하고 모든 유전자형에 대해 동일한 매개 변수를 사용합니다. 복부 신경 코드 내에서 모터 뉴런을 이미지하려면 렌즈 아래에 해부된 샘플로 실리콘 접시를 놓고 렌즈를 낮추어 트레할로스 자당 HL3 버퍼와 접촉하게 됩니다. 렌즈가 버퍼에 완전히 잠겨 있는지 확인하고 필요한 경우 버퍼를 더 추가합니다. 다음.
CFP 및 FRET 채널을 사용하여 복부 신경 코드 미드라인을 따라 초점을 맞춘 최소 6개의 모터 뉴런으로 구성된 광학 선택을 수동으로 선택합니다. 그런 다음 10분 동안 10초마다 이미지를 수집합니다. 이러한 이미지는 기준선을 나타냅니다.
포도당 자극의 경우 파스퇴르 파이펫을 사용하여 HL3 버퍼를 함유한 트레할로스 자당을 제거하고 복부 신경 코드를 움직이지 않고 HL3 버퍼를 보충한 5밀리머 포도당을 추가합니다. 그런 다음 10초마다 이미지를 10분 간 추가로 획득합니다. 이러한 이미지는 자극 단계를 나타냅니다.
이미지를 CZI 파일 또는 이미징 소프트웨어에서 지원하는 파일 유형으로 이미지를 날짜, 유전 배경, 실험 상태 및 사용되는 채널을 포함한 파일 이름으로 저장합니다. 매개 변수를 다시 사용하여 모든 유전자형을 이미지화합니다. 이미지 처리의 경우 피지-ImageJ 이미징 소프트웨어를 열고 CZI 파일을 열고 하이퍼 스택이 있는 뷰 스택을 선택하고 색상 모드를 회색 으로 설정하고 분할 채널을 별도의 창으로 선택합니다. 다음.
드리프트 보정 플러그인, 터보 레그 및 스택 레그로 이미지를 처리합니다. 각 채널은 플러그인 에서 스택 레그를 선택한 다음 번역변환을 선택하여 별도로 수정됩니다. 전체 타임 시리즈에 초점을 맞춘 모든 모터 뉴런을 추적하여 관심 영역 또는 ROI 영역을 수동으로 선택합니다.
그런 다음 ROI 관리자를 사용하여 각 모터 뉴런 윤곽선을 저장합니다. 다중 측정 함수를 사용하여 각 시점에서 각 ROI의 평균 회색 값을 측정합니다. 그런 다음 첫 번째 채널에서 두 번째 채널로 추적된 ROI를 복사하여 사전 자극 이미지를 위해 복사합니다.
데이터 분석을 위해 FRET 및 CFP 채널의 평균 회색 값을 사용하여 CFP 비율별로 FRET를 계산합니다. CFP 비율에 의한 FRET의 변화는 세포내 포도당 농도의 변화를 반영한다. 그런 다음 각 ROI 및 시간 대 시간에 대해 CFP 비율로 FRET를 플롯합니다.
유전적으로 인코딩된 FRET 기반 포도당 센서는 운동 뉴런의 포도당 섭취를 측정하는 데 사용되었습니다. 포도당이 센서에 바인딩되지 않을 때 CFP 여기는 CFP 방출만 발생합니다. 그리고 포도당이 결합될 때, YFP 신호는 CFP와 YFP 사이에서 발생하는 FRET 때문에 검출될 수 있습니다.
여기에 표시된 바와 같이 기준선 및 자극 조건 하에서 TDP-43 돌연변이 뉴런의 포도당 센서 제어에서 FRET 및 CFP 신호의 이미지가 표시됩니다. 대표적인 운동 신경은 ROI의 예로 각 이미지에 설명되어 있습니다. 포도당 자극시 포도당 센서를 표현하는 제어 운동 뉴런은 포도당 섭취량이 작아지며 TDP-43을 표현하는 뉴런은 상당히 높은 포도당 섭취를 보였습니다.
TDP-43 돌연변이 모터 뉴런의 CFP 비율에 의한 추가 FRET는 매 시점에서 포도당 센서 제어로 정규화되었다. 기준 조건하에서, 유전자형 사이에는 차이가 없었다. 그러나, 포도당 자극시, 대조군에 비해 TDP-43 돌연변이체에서 포도당 섭취량의 신속하고 유의한 증가를 관찰하였다.
바 그래프 표현에서, 포도당 센서를 표현하는 뉴런의 포도당 자극은 기준선에 비해 CFP 비율에 의한 FRET의 작지만 유의한 증가를 입증하였다. 대조적으로 TDP-43을 발현하는 뉴런은 기준선에 비해 자극시 비율의 상당한 증가를 보였다. TDP-43과 포도당 센서를 표현하는 모터 뉴런 사이의 CFP 비율에 의한 FRET의 순 차이는 약 10.9%의 시간 관리가 이 절차에 매우 중요하며, 이는 뉴런이 이미징 과정에서 죽지 않도록 하는 것입니다.
이를 피하기 위해 해부 직후 이미지를 이미지화하는 것이 중요합니다. 이 기술은 뉴런에서 포도당 대사의 중요성을 강조하고 모터 뉴런 재생에 있는 glycolysis의 역할을 더 조사하기 위하여 우리의 단을 지도했습니다.
