우리는 해부 비디오 편집과 지원을위한 절차와 로드니 맥페일을 (생물 과학학과, 퍼듀 대학교) 촬영을 위해 라이언 마네리을 (오이스터캐쳐 프로덕션, LLC) 감사드립니다. 수터 실험실 연구는 DMS에 퍼듀 대학에서 NIH (R01 NS049233)와 빈들리 Bioscience 센터에서 기금에 의해 지원됩니다

솔루션 <ul><li> L15 - ASW의 세포 배양 매체 (일리터) <ul><li> L15 가루 1 봉지 </li><li> H 2 O ultrapure 800 ML을 추가 </li><li> NaCl 400 MM </li><li> MgSO 4 27 MM </li><li> MgCl 2 28 MM </li><li> L - 글루타민 4 MM </li><li> Gentamicin 50 μg / ML </li><li> HEPES 5 MM </li><li> 산도 7.9로 조정 </li><li> (precipitates 경우 스톱) 드롭 CaCl 2 9.3 MM을 들러 추가 </li><li> 1리터에 H 2 O ultrapure 추가 </li><li> osmometer (증기압, Wescor # 5520)와 osmolarity (950-1000 mmol / kg)를 확인 </li><li> 긍정적인 압력 여과 장치 (Millipore의 SVGV010RS 필터)를 사용하여 필터 0.22 μm의 </li><li> 최대 1 개월 4 ° C에 보관 </li></ul></li><li> 폴리 - L - 라이신은 (70-150 KD) 200 살균 H 2 O ultrapure에 μg / ML 주식 솔루션은 -20 O C에서 보관 </li><li> 0.5 M MgCl 2 용액 </li></ul> 1 일 : Aplysia 복부 신경절의 해부 효소 분리 솔루션의 준비 <ol><li> Eppendorf 튜브에 : Dispase 효소 (LS02111 워싱턴, 고양이)의 90-10 MG를 달다 </li><li> L15 - ASW 문화 매체 900 μl 및 살균 H 2 O ultrapure 100 μl 추가 </li><li> 실온 (RT)에서 혼합 및 장소 </li></ol> 복부 신경절의 해부 <ol><li> 0.5 M MgCl 2 솔루션으로 50 ML의 주사기를 채우십시오. </li><li> 탱크에서 한 동물을, 동물의 inking 방어 반응을 피하기 위해 부드럽게 처리할 수 있습니다. </li><li> 왼쪽으로 오른쪽, 꼬리쪽으로 절개 보드의 측면에 Aplysia (스티로폼 보드), 주동이의 옆에 놓습니다. </li><li> 그냥 머리 뒤에 동물에 바늘을 삽입하고 뱃속에 모든 MgCl 2 솔루션을 주입. </li><li> 부드럽게 뱃속 내내 MgCl 2 솔루션을 해산하기 위해 동물을 문질러 완전히 anaesthetized하는 동물을위한 몇 분 동안 기다립니다. </li><li> 이 바늘로 해부 보드 동물의 머리와 꼬리를 핀. </li><li> 측면에 큰 열기를 만들기 위해 머리와 꼬리를 향해 큰 가위로 피부와 근육의 계층을 통해 잘라내기, 피부를 리프트에 집게를 사용하십시오. </li><li> 브러시와 같은 난소에서 복부 신경절을 찾아보십시오. 복부 신경절 앞에서 1cm에 대한 연결 신경 잡아 집게를 사용하여, 포셉 보관 위치 앞에와 복부 신경절 뒤에 해부 가위로 신경을 절단. </li><li> 22 Dispase 솔루션 및 15-16 H에 대한 부화에 플레이스 신경절 ° C 온도 제어 물을 욕조를 사용합니다. </li></ol> 일 2 : Aplysia 가방 세포의 도금 폴리 - 라이신 - 코팅 coverslips 준비 <ol><li> 흐름 벤치에서, 4 ML L15 - ASW 매체 각을 작성, 신경절의 해부를 위해 요리를 작업을 피해 3 35mm 배양 접시를 준비합니다. 소화의 15.5 시간 후 작업 요리 중 하나 dispase 솔루션에서 복부 신경절을 전송합니다. </li><li> 포셉 취할 사용하면 산성 - 청소 # 1.5 coverslips (22x22 mm)는 에탄올에 저장된, 알코올을 제거하고 알콜 램프를 통해 간단히 그들을 불타는하여 coverslips을 소독. 문화 요리에 coverslips를 삽입하기 전에 그들이 잠시 더위 좀 식히자. </li><li> 알콜 램프에 비해 노란색 팁 (불꽃은 간단히 플라스틱의 용융을 피하기 위해를!) 굴곡하여 곡선 도금 팁을 준비합니다. </li><li> 무균 H 2 O ultrapure 200 μg / ML 주식 솔루션을 diluting 20 μg / ML - 폴리 리신 솔루션의 적절한 금액을 준비합니다. </li><li> 20 μg / ML - 폴리 리신과 RT에서 20 분에 대해 품어 500 μl 각 coverslip을 커버. </li><li> 500 μl 무균 H 2 O ultrapure 각 각 coverslip 3-5 번 씻으십시오. </li><li> coverslips 물을 제거, L15 - ASW 문화 매체 4 ML 각 요리를 입력합니다. </li></ol> 가방 세포의 분리 <ol><li> 해부 현미경에서 이전에 95 %의 에탄올 (그림 1 라인 1) 청소 이분의 일 사용 해부 가위와 집게의 복부 신경절를 잘라. </li><li> 가방 전지 클러스터 hemiganglion 세포 (그림 1 2 호선) 사이 컷 신경절, 그리고 가방 세포의 반대편에 남아있는 신경 확장 (그림 1 라인 3) 버려야 중 절반에. 한 번에 신경절의 반은 작업, 첫 번째 클러스터의 세포가 도금되는 동안 접시에있는 다른 반쪽을 두십시오. </li><li> 이 포셉 (또는 한 포셉 및 해부 가위), 가방 전지 클러스터를 둘러싼 결합 조직 칼집을 별도로 추진하여 릴리스 가방 셀 클러스터를 사용합니다. 필요한 경우 해부 가위 들고 도망 결합 조직을 잘라. 이 과정에서 당기 너무 많은 가방 셀 클러스터를 만지지 않도록 조심하십시오. </li><li> 대부분 결합 조직의 제거되면 B를 전송벤트 노란 팁으로 새 작업을 그릇에 AG 전지 클러스터는 이전 준비. 가방 전지 클러스터가 노란색 팁 안에 갇혀 또는 공기 / 미디어 인터페이스에 붙어있을 수 있도록하지 않도록주의하십시오. </li><li> 개인 가방 세포를 제거하는 노란색 팁으로 클러스터를 씹다. 팁에서 퇴원 클러스터를 pipetting하여이 작업을 수행합니다. 낮은 전단 병력과 함께 시작하여 필요에 따라 힘을 향상시킬 수 있습니다. 항상 너무 많은 세포를 죽이지 않고 뉴런을 제거하는 데 필요한 최저 힘을 사용합니다. </li><li> 3-5 건강한 가방 세포를 수집하고 쓰임새 라이신 - 코팅 coverslip있는 요리로 전송할 수 있습니다. 죽은 세포 (그들은 중앙에 검은 / 투명) 및 결합 조직의 파편을 채취하지 마십시오. </li><li> 6 단계를 반복합니다. 각 coverslip의 중심에 15-25 살 뉴런에 대한 곳. 죽은 세포이나 먼지가 잘으로 전송하는 경우, 그것을 수확하거나 건강한 세포에서 멀리 불어하여 ​​원치 않는 물질을 제거합니다. 이 과정은 두 클러스터에 대한 2-3시간 걸립니다. </li><li> 일단 (원치 않는 진동을 피하기 위해 해제 흐름 벤치 송풍기 유지) 세포를 첨부할 수 있도록 RT 적어도 2 시간 흐름 벤치에서 문화 요리를 보관 마쳤다. </li><li> ° C 하룻밤, 또는 추가를 사용하기 전까지 14에서 인큐베이터에 요리를 놓습니다. 성장 원뿔은 40-10시간에서 개발 있습니다. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/old/662_2008_2_10_0/image001.jpg" alt="그림 1. Aplysia californica 복부 신경절의 개략도. 가방 전지 클러스터를 얻기 위해 상처 어디에 컬러 라인 나타냅니다." /> 그림 1. Aplysia californica 복부 신경절의 개략도. 가방 전지 클러스터를 얻기 위해 상처 어디에 컬러 라인 나타냅니다. 3 일 : Aplysia 가방 세포의 라이브 영상을위한 챔버 설정 이미지 챔버 조립 <ol><li> 라이브 셀 이미징 실험을위한 가방 세포를 사용하기 전에, 낮은 전력 현미경에서 세포를 검사합니다. 세포가 건강하게 성장 콘을 개발하지 않은 경우, 1-2 시간 동안 RT에서 신선한 매체와 휴가를 제공합니다. </li><li> 신선한 L15 - ASW 매체와 번호판을 공급하기 위해 진공 라인 오래된 매체의 절반 (~ 2ml)를 제거하고 새로운 2 ML L15 - ASW의 배양 접시 당 매체를 추가하십시오. 이 coverslip에서 세포를 제거하므로 완전히 한꺼번에 접시에서 모든 매체를 제거하지 않는 것이 중요합니다. </li><li> 가방 세포 이미징을 위해, 우리는 샌드위치와 같은 영상 챔버의 두 coverslips 두 플라스틱 스페이서를 조립. 샌드위치의 맨 coverslip는 중간 및 시약을 쉽게 교환할 수 있도록 짧은 컷입니다. 조립하는 동안 연결된 가방 세포와 coverslips는 dislodging에서 세포를 방지하기 위해 항상 L15 - ASW 매체에 빠져들해야합니다. </li><li> 챔버를 준비하려면, 잘라 ~ 2mm를 다이아몬드 펜 (유리 커터)와 통치자와 # 1 coverslips 22x22 mm의 오른쪽에서. </li><li> 1 ML의 주사기를 사용하여 짧은 coverslip의 양면 높은 진공 그리스를 적용하고, 각 측면에 플라스틱 스페이서를 연결합니다. 두 스페이서의 상단에 진공 그리스를 적용합니다. </li><li> coverglass에 가방 세포를 포함하는 페트리 접시에 coverslip와 스페이서 조립, 장소 반전. 정렬 부드럽게이 Q - 팁 리버스 엔드와 하단 coverslip 맨 coverslip을 막대기 아래로 누르십시오. </li><li> 포셉을 사용하여 부드럽게 밖으로 누출 매체없이는 배양 접시의 샌드위치 조립을 리프트. 필요한 경우, 두 coverslips를 정렬하고, Kimwipe로 초과 매체를 닦아. 현미경 슬라이드 홀더의 하단 부분에 샌드위치를​​ 장소와 클립을 사용하여주의 덮개를 부착합니다. </li><li> Q - 팁을 샌드위치의 맨 위에 측면의 중심을 깨끗이 유리 청소기 ( &#39;스파클&#39;은 유리 청소기로 사용됩니다)에 dabbed. 신속 리크 라인을 피하기 위해 두 번째 건조 Q - 팁과 유리 청소기를 건조. 하단 coverslip에 대해 동일한 작업을 수행. 리크 라인 무료 깨끗한 coverslips는 고품질의 영상을 위해 중요합니다. </li></ol> 현미경에 가방 세포 Aplysia 가방 세포의 연결을 문화가 저밀도에 있기 때문에 귀하의 현미경 설정은 세포 사이를 전환할 촉진 무대 위치 기능을 가지고있다면, 그것은 최고입니다. 가방 세포는 쉽게 이미징 실험을하는 동안 무대에서 몇 시간 동안 RT에 보관하실 수 있습니다. 증발을 방지하기 위해 정기적으로 매체를 교환.

<ol>
	<li>Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP+induces+changes+in+distribution+and+transport+of+organelles+within+growth+cones+of+Aplysia+bag+cell+neurons.">Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons.</a> J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).</li><li>Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ig+superfamily+cell+adhesion+molecule,+apCAM,+mediates+growth+cone+steering+by+substrate-cytoskeletal+coupling.">The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling.</a> J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).</li><li>Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodia+and+actin+arcs+guide+the+assembly+and+transport+of+two+populations+of+microtubules+with+unique+dynamic+parameters+in+neuronal+growth+cones.">Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones.</a> J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).</li><li>Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+are+necessary+for+SRC+family+kinase-dependent+growth+cone+steering.">Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering.</a> Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).</li></ol>

Aplysia 가방 세포 뉴런은 거의 비의 연결을 세포와 혈청의 연결이없는 세포 배양 시스템을 제공합니다. 이러한 뉴런 중요한 세포 생물 학적 질문 숫자를 해결하기 위해 적합한 매우 큰 성장 원뿔을 형성합니다. 가방 세포 뉴런 쉽게 몇 시간 동안 조작하고 실온에서 몇 군데하실 수 있습니다. 형광등을 사용하면 하나 양적 F - 굴지와 미세 소관의 중합 및 translocation 역학의 다양한 매개 변수를 분석할 수 현미경 (FSM)?...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>#1 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>VWR</td>
<td>48366067</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#1.5 glass coverslips 22x22 mm</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>2870-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 mm Petri dishes</td>
<td>Tool</td>
<td>Falcon</td>
<td>353001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Filters for medium filtration</td>
<td>Tool</td>
<td>Millipore</td>
<td>SVGV010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High vacuum grease</td>
<td>Tool</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>1597418</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Osmometer</td>
<td>Tool</td>
<td>Wescor</td>
<td>5520</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic shims</td>
<td>Tool</td>
<td>Small Parts Inc </td>
<td>SHSP-200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Calcium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>C79-500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gentamicin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15750-060</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>H4030</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L15 medium</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>41300-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>G8540</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>5958-04</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Magnesium sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt</td>
<td>6070-12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-L-lysine (70-150 kD) </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6282</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Mallinckrodt </td>
<td>7581</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neutral Protease (Dispase)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Worthington</td>
<td>LS02111</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

neuronal cell cultures from aplysia for high-resolution imaging of growth cones

의 연결을 성장 콘은 환경에서지도 신호를 감지하고 적절한 대상 세포쪽으로 방향 움직임에이 정보를 transduce 수 axons의 끝에 높은 운동성이있는 구조입니다. 완벽하게지도 정보가 기본 동적 cytoskeletal 네트워크에 세포 표면에서 전달하는 방법 이해하기 위해서, 하나는 높은 시간적 및 공간적 해상도에서 단백질 역학 라이브 셀 이미징에 적합한 모델 시스템이 필요합니다. 전형적인 척추 성장 콘은 양적 F - 굴지와 미세 소관의 역학을 분석하는 너무 작은 수 있습니다. 군소 Aplysia californica에서 뉴런은 뉴런 척추보다 5-10 배 큰 쉽게 실온에서 보관 수 있으며, 미세 조작 및 biophysical 측정을 매우 강력한 세포 수 있습니다. 그들의 성장 콘은 매우 세포질 지역과 잘 설명 cytoskeletal 시스템을 정의했습니다. 의 연결을 세포 기관은 성장 콘 운동성 및지도를 공부에 대한 프로브의 다양한 microinjected 수 있습니다. 현재의 프로토콜에서는 복부 신경절, 가방 셀 뉴런의 문화와 성장 콘 라이브 셀 이미징에 대한 이미징 챔버를 설정 해부를위한 절차를 설명합니다.

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Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Aplysia californica의 뉴런 성장 콘 운동성 및지도 고해상도 이미지를위한 최고의 아르 문화의 큰 성장 콘을 개발. 여기서 우리는 절개 및 Aplysia 가방 셀 뉴런의 도금뿐만 아니라 라이브 셀 이미징을위한 챔버를 설정을위한 프로토콜을 제시한다.

성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 Aplysia에서의 연결을 셀 문화

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.3K 조회수.  Purdue University. Aplysia californica의 뉴런 성장 콘 운동성 및지도 고해상도 이미지를위한 최고의 아르 문화의 큰 성장 콘을 개발. 여기서 우리는 절개 및 Aplysia 가방 셀 뉴런의 도금뿐만 아니라 라이브 셀 이미징을위한 챔버를 설정을위한 프로토콜을 제시한다.

비디오: Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the removal of brains from animals at 70-78 hrs after puparium formation. The isolated brains are shown after brief incubation in papain followed by several washes in serum-free growth medium. The process of mechanical dissociation of each brain in a 5 ul drop of media on a coverslip is illustrated. The axons and dendrites of the post-mitotic neurons are sheered off near the soma during dissociation but the neurons begin to regenerate processes within a few hours of plating. Images show live cultures at 2 days. Neurons continue to elaborate processes during the first week in culture. Specific neuronal populations can be identified in culture using GAL4 lines to drive tissue specific expression of fluorescent markers such as  GFP or RFP. Whole cell recordings have demonstrated the cultured neurons form functional, spontaneously active cholinergic and GABAergic synapses. A short video segment illustrates calcium dynamics in the cultured neurons using Fura-2 as a calcium indicator dye to monitor spontaneous calcium transients and nicotine evoked calcium responses in a dish of cultured neurons. These pupal brain cultures are a useful model system in which genetic and pharmacological tools can be used to identify intrinsic and extrinsic factors that influence formation and function of central synapses.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. Views of live cultures show neurite outgrowth and imaging of calcium levels using Fura-2.

늦은 단계 Drosophila Pupae의 두뇌에서 기본의 연결을 문화

In this video, we demonstrate the preparation of primary neuronal cultures from the brains of late stage Drosophila pupae. The procedure begins with the ...

연구

생물학

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. Addition of interleukin 2 to the culture media during the expansion phase is necessary to prevent cell death and sufficient to maintain short-term T cell lines but has been shown to increase Th1 polarization 3. Replacement of interleukin 2 by T cell growth factor (TCGF) which contains a mix of cytokines is more effective than interleukin 2 in maintaining long-term T cell lines in vitro 3. Moreover, TCGF can easily be prepared in large amounts in the laboratory and is much cheaper than recombinant interleukin 2. 
Here, we show how to prepare TCGF from rat splenocyte culture supernatants. For this procedure, we harvest spleens from naive Lewis rats euthanized for thymus and blood collection. We prepare single-cell suspensions from the spleens, lyze the red blood cells by osmotic shock, and seed the splenocytes in culture medium. The cells are stimulated with concanavalin A, a mitogen that non-selectively activates all rat T lymphocytes, inducing the production of cytokines. The culture supernantant is collected 48 hours later andexcess concanavalin A is bound to alpha methyl mannoside to prevent it from activating T cell lines to which TCGF will be added. The TCGF is then sterile-filtered, aliquoted, and stored at -20&deg;C.

We describe the preparation of T cell growth factor used for the in vitro expansion of antigen-specific rat T lymphocyte lines.

랫 Splenocytes에서 T 세포 성장 인자 준비

Maintenance of antigen-specific T cell lines or clones in culture requires rounds of antigen-induced activation separated by phases of cell expansion 1,2. ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

의 준비 Aplysia 감각 - 모터의 연결을 셀 문화

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

에서 기본 셀 문화 Drosophila Gastrula의 태아

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Generation of Dispersed Presomitic Mesoderm Cell Cultures for Imaging of the Zebrafish Segmentation Clock in Single Cells

Segmentation is a periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic formation of blocks of tissue called somites along the body axis is evidence of a genetic oscillator patterning the developing embryo. In zebrafish, the intracellular clock driving segmentation is comprised of members of the Her/Hes transcription factor family organized into negative feedback loops. We have recently generated transgenic fluorescent reporter lines for the cyclic gene her1 that recapitulate the spatio-temporal pattern of oscillations in the presomitic mesoderm (PSM). Using these lines, we developed an in vitro culture system that allows real-time analysis of segmentation clock oscillations within single, isolated PSM cells. By removing PSM tissue from transgenic embryos and then dispersing cells from oscillating regions onto glass-bottom dishes, we generated cultures suitable for time-lapse imaging of fluorescence signal from individual clock cells. This approach provides an experimental and conceptual framework for direct manipulation of the segmentation clock with unprecedented single-cell resolution, allowing its cell-autonomous and tissue-level properties to be distinguished and dissected.

Somitogenesis is a rhythmic developmental process that spatially patterns the body axis of vertebrate embryos. Previously, we developed transgenic zebrafish lines that use fluorescent reporters to observe the cyclic genes that drive this process. Here, we culture dispersed cells from these lines and image their oscillations over time in vitro.

단일 세포의 Zebrafish의 분할 시계의 이미징을위한 분산 Presomitic 중배엽 세포 배양의 생성

Segmentation is a  periodic and sequential morphogenetic process in vertebrates. This rhythmic  formation of blocks of tissue called somites along the ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

설치류기도 상피의 섬모 운동성의 높은 해상도 이미지를위한 생체 방법

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and widely-utilized +TIPs for analyzing MT dynamics is the End-Binding protein, EB1, which binds all growing MT plus-ends, and thus, is a marker for MT polymerization1. Many studies of EB1 behavior within growth cones have used time-consuming and biased computer-assisted, hand-tracking methods to analyze individual MTs1-3. Our approach is to quantify global parameters of MT dynamics using the software package, plusTipTracker4, following the acquisition of high-resolution, live images of tagged EB1 in cultured embryonic growth cones5. This software is a MATLAB-based, open-source, user-friendly package that combines automated detection, tracking, visualization, and analysis for movies of fluorescently-labeled +TIPs. Here, we present the protocol for using plusTipTracker for the analysis of fluorescently-labeled +TIP comets in cultured Xenopus laevis growth cones. However, this software can also be used to characterize MT dynamics in various cell types6-8.

Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones

The MATLAB-based, open source software package, plusTipTracker, can be used to analyze image series of fluorescently-labeled +TIPs to quantify microtubule dynamics.

에 미세 소관 역학을 측정하는 plusTipTracker 소프트웨어를 사용<em&gt; 운송에 필요한 정보 미국 교통부</em&gt; 성장 콘

Microtubule (MT) plus-end-tracking proteins (+TIPs) localize to the growing plus-ends of MTs and regulate MT dynamics1,2. One of the most well-known and ...