Uma técnica simplificada para<em&gt; In situ</em&gt; Excisão de Córnea e evisceração de tecido da retina do globo ocular humano

Resumo

O artigo descreve uma técnica simplificada de córnea especiais de consumo e eviscerar os tecidos da retina do globo ocular de humanos doadores cadavéricos. A técnica descrita aqui vai ajudar a impostos especiais de consumo tecidos de boa qualidade para ser utilizados para transplantação, cirúrgicos ou de pesquisa, sem danificar outros tecidos do globo ocular.

Resumo

Enucleação é o processo de recuperação do globo ocular de um dador de cadáver deixando o resto do globo não perturbada. Excisão refere-se à recuperação de tecidos oculares, especialmente córnea, cortando-a separada a partir do globo ocular. Evisceração é o processo de remoção dos órgãos internos referidos aqui como retina. O globo ocular consiste na córnea, a esclerótica, o corpo vítreo, a lente, a íris, a retina, a coróide, etc músculos (Suppl. Figura 1). Quando um paciente está a sofrer de lesões da córnea, a córnea precisa de ser removido e um saudável deve ser transplantado por cirurgias keratoplastic. Doenças genéticas ou defeitos na função da retina pode comprometer a visão. Globos oculares humanos pode ser utilizado para vários procedimentos cirúrgicos, tais como bancos olho, o transplante da córnea humana ou esclerótica e investigação sobre os tecidos oculares. No entanto, há pouca informação disponível sobre a excisão da córnea e da retina humana, provavelmente devido ao lacessibilidade imited para os tecidos humanos. A maioria dos estudos que descrevem procedimentos semelhantes são realizados em modelos animais. Os cientistas da pesquisa depende da disponibilidade de tecidos oculares devidamente dissecadas e bem conservada, a fim de ampliar o conhecimento sobre a homeostase humana olho, desenvolvimento e função. Como recebemos grande quantidade de globos oculares, dos quais aproximadamente 40% (Tabela 1) deles são usados ​​para fins de pesquisa, somos capazes de realizar grande quantidade de experiências sobre esses tecidos, definindo técnicas para consumo e preservá-los regularmente.

A córnea é um tecido avascular, que permite a transmissão de luz na retina e para este propósito deve sempre manter um bom grau de transparência. Dentro da córnea, a região limbo, que é um reservatório das células estaminais, ajuda a reconstrução de células epiteliais e restringe o crescimento excessivo da conjuntiva manter a transparência da córnea e de clareza. O tamanho e th ickness da córnea são críticos para a visão clara, como alterações em qualquer um deles pode levar a distraído visão, claro. A córnea compreende de 5 camadas, a) epitélio, b) camada de Bowman, c) estroma, d) membrana de Descemet ee) endotélio. Todas as camadas devem funcionar corretamente para garantir uma visão clara ^4,5,6. A coróide é a túnica intermédia entre a esclerótica e da retina, delimitada no interior pela membrana de Bruch e é responsável para o fluxo de sangue no olho. A coróide também ajuda a regular a alimentação de temperatura e material para as camadas exteriores da retina ^5,6. A retina é uma camada de tecido nervoso, que cobre a parte de trás do globo ocular (Suppl. Figura 1) e consiste de duas partes: uma parte fotorreceptor e uma parte não receptivo. A retina ajuda para receber a luz a partir da córnea e do cristalino e converte-os em a energia química, eventualmente, transmitido para o cérebro, com a ajuda do nervo óptico ^5,6. ove_content "> O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo para a dissecção dos tecidos da córnea e da retina de globos oculares humanos. Evitar a contaminação cruzada com tecidos adjacentes e preservando a integridade do RNA é de fundamental importância como esses tecidos são indispensáveis ​​para fins de pesquisa voltadas em (i) caracterizar o transcriptoma dos tecidos oculares, (ii) o isolamento de células-tronco para projetos de medicina regenerativa, e (iii) avaliar diferenças histológicas entre os tecidos normais de / afetados assuntos. Neste artigo descrevemos a técnica que usamos atualmente para remover a córnea, a coróide e tecidos da retina de um globo ocular. Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a dissecção do globo ocular humano ea excisão dos tecidos da córnea e da retina. O vídeo que o acompanha vai ajudar os pesquisadores a aprender uma técnica adequada para a recuperação de preciosos tecidos humanos que são difíceis de encontrar regularmente.

Protocolo

1. Na excisão in situ da córnea de globos oculares

1. Ligue o câmara de fluxo laminar de ar de aproximadamente 15 minutos antes da utilização. Limpar a câmara de fluxo laminar usando 70% de álcool isopropílico. Coloque roupas de proteção pessoal, como touca cirúrgica e máscara. Esfregue as mãos e os antebraços e secar com uma toalha estéril. Usar luvas estéreis e vestido de mangas ou usando uma técnica asséptica.
2. Configure o campo estéril, colocando uma bandeja instrumento esterilizado assepticamente. Verifique se os instrumentos são esterilizados. Abra o pacote de instrumentos estéreis e virar para o campo estéril evitar qualquer contaminação.
3. Posicionar todos os materiais estéreis e instrumentos (Tabela 2) juntamente com garrafas (frascos oculares) contendo globos oculares de modo que eles são adjacentes à borda do campo estéril para facilidade de utilização.
4. Rotular as garrafas com preservação previamente preparada / meio de armazenamento, tal como indicado na Tabela 3 e colocar om sobre a superfície da câmara de fluxo laminar de ar, juntamente com I-PVP (polivinilpirrolidona-iodo), tiossulfato de sódio e uma solução salina estéril de PBS (fosfato de solução salina de tampão).
5. Permitir que os tecidos oculares e soluções para atingir a temperatura ambiente normal, tal como eles são preservados em frigoríficos, a 4 ° C. Evite a repetição de aquecimento / arrefecimento ciclos. Manter as tampas da solução e os frascos oculares com lado interior virada para cima ao lado de seus respectivos frascos.
6. Remover gazes e esponjas do frasco olho usando uma pinça estéril. Mergulhe o globo em estéril I-PVP 0,5% para 2 minutos para descontaminar os globos oculares. Colocar as duas pinças na tampa do tabuleiro estéril, fora do campo esterilizado. Transfira o mundo em sódio% de tiossulfato 0,1 para 1 minuto usando um par de pinças esterilizadas. Usando as mesmas fórceps, transferir o globo para o frasco contendo uma solução salina estéril (PBS) e deixá-la até que é operado. Repita o mesmo procedimento para o outro globo ocular de tele mesmo dador.
7. Trabalhando por baixo da câmara de fluxo laminar de ar, envolva o globo com gaze estéril (ligaduras) deixando a córnea e cerca de 5 mm a partir de esclerótica da córnea descoberto. A lâmpada olho poderia ser simplesmente realizada na mão, mantendo a pressão adequada. O tecido deve ser mantido úmido durante toda a cirurgia.
8. Pinças são usadas junto com uma tesoura para remover todos os restos eventuais da conjuntiva. Mantenha os instrumentos utilizados para a operação acima separada de outros instrumentos. Usar uma lâmina de bisturi para realizar uma incisão escleral de 3-4 mm a partir da região limbo, em seguida, estender a incisão por ° 360, evitando a perfurar o tecido subjacente uveal ou causar qualquer deformação da curvatura normal da córnea. Corte quatro grandes incisões, deixando quatro pequenos espaços, evitando a secreção do corpo vítreo. Todos os quatro aberturas são cortadas garantir a ausência de remoção de qualquer outro tecido.
9. Presença de pequenas placas esclerais pode dificultar o corte, então certifique-se de compnar a excisão escleral com uma tesoura de microcirurgia. Esta operação deve ser realizada sem danificar o corpo retina coróide e vítreo.
10. Inspecione a incisão para garantir que ele está completo. Se a incisão foi efectuado correctamente os adere córneo-esclerais aro para os corpos ciliares apenas no ponto em correspondência com a córnea.
11. Ajuste o globo ocular enrolado para baixo perto do centro do campo esterilizado. Completar a remoção da córnea utilizando fórceps para segurar o aro escleral estacionária ea mão usado para a excisão para puxar o corpo ciliar coróide-baixo e para longe do botão córneo-escleral.
12. Gentilmente separe as adesões restantes do botão córneo-escleral. Nem puxar o aro córneo-escleral de uma maneira que poderia causar transversal da córnea tensão nem permitir que a cair de volta para a câmara anterior.
13. A densidade de células endoteliais da córnea é verificada utilizando uma solução hipotónica e da mortalidade das células é verificada utilizando um trypuma coloração azul para cerca de 1 min e as células são então contadas sob um microscópio óptico e medido como células / mm ^2. A câmara anterior deve enfrentar a tampa enquanto a parte posterior deve enfrentar o fundo da placa de Petri. A densidade de células endoteliais podem ser contados manualmente, utilizando uma grade no objetivo em aumento de 100X. A contagem de células mínimo aceito para transplante na Itália é de 2200 células endoteliais / mm ^2.
14. Transferir o aro córneo-escleral usando uma garra da córnea para meio de armazenamento corneal previamente preparada preservada a RT (temperatura ambiente), como mostrado na Tabela 3.
15. Examinar a câmara posterior para uma lente natural cristalino. Se a esclerótica é preparado, remover todos os resíduos de úvea e humor vítreo do globo. Com cuidado, desembrulhe e devolver o restante segmento posterior ao seu respectivo jar olhos, utilizando técnica asséptica. Repita o procedimento para o mundo outro utilizando novos instrumentos. Fixe o humor córneah garra da córnea e preservar sob a mídia de armazenamento (cultura de órgão) em 31 ° C. A córnea excisado, como mostrado na Figura 1a, pode então ser utilizado para ceratoplastia ou investigação.
16. Descarte os materiais desnecessários e bio-resíduos perigosos em lixeiras apropriadas. Limpe a área de trabalho uma vez que o trabalho seja concluído usando spray de álcool isopropílico a 70%.
17. Se, depois de 28 dias a córnea mantém todos os parâmetros de avaliação [tais como morfologia, contagem de células, a transparência, a espessura e testes de microbiologia - bactérias e fungos usando instrumento Bactec 9240 (Becton Dickinson, Milão, Itália)], então ele pode ser transportado para os hospitais, utilizando o meio de transporte mostrada na Tabela 4. A córnea deve ser removido e colocado a partir do armazenamento para transportar meio sob laminar câmara de fluxo de ar.
18. Como, durante o armazenamento, a córnea se torna mais espesso do que o seu tamanho habitual necessária para o transplante, os bancos oculares usar de-inchaço agentes para reduzir a espessura. Nósusar 6% dextrano T500 para obter a córnea volta a seu tamanho normal em meio de transporte. Embora 4-8% de dextrano T500 poderia ser utilizado, 6% tem melhor servidas por nós. Isto torna mais fácil para os cirurgiões para transplantar a córnea, logo que o recebe.

2. A evisceração de Retina do globo ocular após o corte da Córnea

1. Após a excisão, a córnea é seleccionado para transplante ou pesquisa com base na sua morfologia e da densidade de células endoteliais e é colocado no armazenamento ou meio de preservação a 31 ° C. O restante do globo ocular é então processado para utilização posterior, tais como isolamento esclerótica para fins cirúrgicos, a retina para a pesquisa etc
2. Antes de excisão da retina, certifique-se que o globo ocular está intacto e apenas a córnea com uma parte da esclera é removido. Se o corpo vítreo gelatinosa é secretando para fora, torna-se difícil de remover um tecido da retina.
3. Se o dador é inferior a 65 anos de idade, a esclerótica épreservada sob PBS estéril para fins cirúrgicos após o teste sorológico. Neste caso, a esclerótica não é cortado, apenas o corpo vítreo é removido ea esclerótica inteira é preservada.
4. Para a excisão da retina, começar com um pequeno corte ou incisão do lado da córnea da esclera movendo em direção ao nervo óptico usando uma pinça e tesouras estéreis. Segure a parte da esclera com a pinça e corte com a tesoura reta em direção ao nervo óptico cortando parte por parte evitando danos ao corpo vítreo.
5. Placas coróide deve ser separada da esclerótica como eles estão presos em conjunto. Cortar o esclera inteiro para expor o tecido coróide. Uma vez que a esclerótica é completamente cortado, separar a esclerótica com o restante do corpo vítreo, cortando-a perto do nervo óptico. Uma bola de todo o corpo vítreo coberto com coróide será visível, como mostrado na Figura 2a.
6. Usando duas pinças estéreis remover a camada coróide suavemente por pegá-la com umpar de pinças e removê-lo com o outro. Alternativamente, a camada coróide pode ser removida utilizando uma tesoura, mas isso deve idealmente ser evitado uma vez que pode causar danos na retina. Retirar a camada coróide parcialmente e cortá-la para facilitar a remoção.
7. Uma vez que a camada coróide é removida, uma camada transparente de retina irá ser visto claramente como mostrado na Figura 2b. A camada coróide tem uma membrana de Bruch interior do qual pode também ser eliminado, mas é difícil de identificá-lo com um olho nu.
8. Do mesmo modo, utilizar duas pinças para remover a camada da retina, como mostrado na Figura 2c. É fácil isolar quantidade elevada de retina se excisado perto do nervo óptico. Todas as camadas do olho pode ser visto agora como mostrado na Figura 2d.
9. Uma vez que o tecido da retina foi removido, pode ser utilizado para fins diferentes e, portanto, os passos subsequentes e condições utilizadas para a preservação podem diferir em conformidade. Por exemplo,o tecido da retina podem ser colocados em tubos contendo RNA estabilização reagentes (tais como RNAlater) ou tampão de lise (para a extracção de RNA ou DNA), dispase / tripsina (para o isolamento de células), as soluções de fixação (antes de incorporar os tecidos em parafina ou outubro para imuno-histoquímica).
10. Limpar toda a área de trabalho e limpe a área usando spray de álcool isopropílico a 70%.

3. Os resultados representativos

O aro córneo-escleral como visto na Figura 1a é uma córnea adequadamente excisado com a quantidade necessária de aro escleral e morfologia endotelial, este tipo de córnea é geralmente utilizado para transplante de córnea. Se o estroma anterior da córnea excisado está danificado com a presença de opacidade, a córnea poderiam ser usados ​​para ceratoplastia endotelial / queratoplastia lamelar posterior (endotélio com uma parte de estroma). Considerando que, se a camada endotelial é danificado ou se a densidade de células endoteliais é menor que 2200 células / mm ² (Italian padrão), a córnea poderiam ser usados ​​para queratoplastia lamelar anterior (epitélio com uma parte de estroma anterior). Se a contagem de células endoteliais é menor que o requerido, a córnea poderiam ser usados ​​para queratoplastia lamelar anterior ou de investigação que, se a córnea é danificado completamente, ela pode ser usada para pesquisa, como mostrado na Figura 1b, 3b e 3c ou descartados. O dano pode ser uma causa de mau uso do tecido, cirurgias de catarata antes que conduzem a estromais ou endoteliais Descemet cicatrizes, o desenvolvimento de lesões corporais durante etc de vida do paciente Portanto, torna-se necessário verificar todos os tecidos com lâmpada de fenda e, em seguida, ao microscópio óptico para cicatrizes finas dobras / / destacamentos. A córnea é geralmente preservada em duas condições diferentes, tais como a cultura de órgãos (aproximadamente 31 ° C) normalmente utilizados em países europeus ou condições hipotérmicos (aproximadamente 4 ° C) normalmente usado nos EUA. Usamos a cultura de órgãos, pois ajuda a regenerar a barragemidade células epiteliais, para revitalizar a seleção de células endoteliais com um alto tempo post mortem, um período de armazenamento de 4 semanas que dá janela suficiente para o planejamento de uma cirurgia, dá tempo suficiente para os testes microbiológicos (bactérias e fungos) e sorológico, etc A córnea pode ser bem preservado no meio de transporte durante 7 dias.

A esclera pode ser cortada parte por parte assegurar a remoção suave de todas as placas da coróide. O líquido pode excretar vítreo quando o nervo óptico coróide, ou retina é cortado acentuadamente como mostrado na Figura 4. Retinas se excisadas para análise de RNA deve ser preservada, RNAlater logo que os tecidos são excisados. Geralmente 1X1 cm da coróide e camada da retina é excisada e depois, mantendo-o em RNAlater durante 24 horas a 4 ° C é preservada sob -80 ° C em tubos de Eppendorf frescos (segura-bloqueio tubos, 2 ml) até ser utilizado ou transportado com seco gelo. O tecido da retina deve ser excisada utilizando duas pinças de perto do nervo óptico de distância a partir de írisou margem ciliar para evitar a contaminação com outras estruturas pigmentadas e deve ser transferido para o recipiente de preservar imediatamente como RNA obtém instável durante a recuperação da retina.

Figura 1 Comparação entre uma boa e uma má qualidade da córnea:. A) A córnea adequadamente excisadas. Tal córnea é geralmente um preservados sob cultura de órgãos durante 4 semanas. Microbiológica (usando Bactec instrumento 9240) e morfológicas exame (coloração das células com azul de tripano para a determinação da mortalidade das células e observando as células sob um microscópio óptico com uma ampliação de 100X) é realizada antes transportá-lo para o hospital (Figura 3a), b) uma córnea dobrada , que eventualmente leva à rejeição do enxerto devido a dobras de Descemet alta e os danos célula endotelial alta examinadas em um microscópio com lâmpada de fenda. Tal córnea é usualmente utilizada para research ou é descartado.

Figura 2. Método usado para assegurar uma excisão precisa do tecido da retina. A) Dissecting a esclerótica do globo ocular usando lâmina 24 milímetros com 95 milímetros curvo ou tesoura rombas estéreis e 100 mm 11X2 governado por 0,70 mm fórceps estéreis dentes. A esclera deve ser cortado por um lado, segurando com a pinça de corte em linha reta em direção ao nervo óptico usando a tesoura. A camada coróide vai agora ser facilmente visto, b) utilizando dois 100 11X2 mm governados por 0,70 mm dentes pinças estéreis, coróide é removido por desmanchá-lo, o que revela a camada transparente subjacente da retina; c) camada da retina transparente é retirado com muito cuidado perto o nervo óptico sem excreção de fluido vítreo usando as mesmas fórceps. Tanto os fórceps deve segurar cada lado da retina e no tecido deve ser removido suavemente starting perto do nervo óptico movendo no sentido da córnea, para se obter uma boa quantidade de tecido da retina. O tecido pode ser cortada em tamanhos diferentes e utilizados para experiências de análise; d) diferentes camadas do olho após a remoção da córnea pode ser visto nesta figura. O corpo coróide é removido primeiro seguido por retina sem danificar as outras partes do olho.

Figura 3. Comparação dos diferentes tipos de densidade celular e morfologia visualizada sob a ampliação de 100X de um microscópio óptico. A) densidade celular endotelial Bom (> 2200 células / mm ²⁾ e morfologia (menos polimorfismo, degeneração baixo, nenhum distrofia e 0% mortalidade) de uma córnea, que é adequado para o transplante, b) densidade celular endotelial Pobre (aproximadamente 1200 - 1400 células / mm ²⁾ e morfologia (polimorfismo muito elevada e Degenperação de células), juntamente com aproximadamente 30-40% de mortalidade global são observados após coloração com azul de tripano, c) Uma parte das células endoteliais são danificados devido ao descolamento de uma folha de endotelial durante a recuperação da córnea de globo ocular. Isto é confirmado pela observação da mortalidade das células na região manchada por azul de tripano, d) pregas O Descemet são formados devido ao uso incorrecto da córnea por flexão, criar uma tensão da córnea cruz, utilizando os instrumentos intensamente etc, no momento da excisão. A figura mostra as grossas dobras desenvolvidos iatrogênicas encontrados entre a periferia e zona óptica da córnea.

Figura 4. Danos na coróide e tecidos da retina, enquanto excisão da córnea, eventualmente, leva à excreção de fluido vítreo. A retina fica implicada no corpo vítreo tornando difícil para excisar um boa qualidade do tecido wiThout contaminação.

Tabela 1. Resumo da gama de atividades realizadas com globos oculares humanos ao longo de 2009 e 2010, Fondazione Banca Degli Occhi (Venezia, Itália). Aproximadamente 60% dos tecidos foram utilizados para o transplante, deixando assim um elevado número de globos oculares (cerca de 40%) de investigação científica e médica.

Figura Suplementar 1. Anatomia do olho humano ^5. Diferentes partes olho humano são indicadas nesta figura, utilizado para seguir a posição exacta dos tecidos.

Discussão

Tanto a excisão, correta e boa conservação dos tecidos da córnea e da retina são críticos como defeitos menores, tais como lesão endotelial ou elevado número de dobras de Descemet pode levar à falência do enxerto da córnea enquanto que alterações de temperatura ou manuseio incorreto pode comprometer a integridade dos tecidos da retina. O objetivo deste trabalho é mostrar como os tecidos da córnea e da retina pode ser isolado da melhor maneira, sem induzir danos ou alterações que possam comprometer sua u...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Descrição do produto	Dimensões	Empresa / Instituto
Guardado descartável bisturi	Tamanho de lâmina 15	Swann-Morton
Ataduras estéreis	5 cm x 5 cm, 8 camadas, 5 unid	Artsana
Toalha descartável estéril médica	35 X 50 cm	U.Jet
Tesoura estéril	Blades 24 mm / comprimento total. 95 mm curvo, sem corte	e.janach
Pinças esterilizadas	Aço inoxidável de 11 mm -100 X 2 governado por 0,70 mm de dentes	e.janach
Garra da córnea - dispositivo médico descartável		NIIOS (Hippocratech)
	Preparativos
PBS	100 ml de PBS [10x] em 900 ml d / w (água destilada)	Sigma-Aldrich
Na-tiossulfato	1 gm de Na-tiossulfato em 1 litro de PBS [1x]	Sigma-Aldrich
I-PVP	5 gm I-PVP em 1 litro d / w	Sigma-Aldrich

Componentes	Fornecedor	Número de catálogo	Concentração	Quantidade
MEM(1X) líquido	Invitrogen	32360-034		1900 ml
Piruvato de sódio	Invitrogen	11360-039	1 mM (10 ml / l)	20 ml
L-glutamina	Invitrogen	25030-032	2mM (10 ml / l)	20 ml
Antibiótico / antimicótico	Sigma-Aldrich	A5955-20ML	10 ml / l	20 ml
De soro de vitelo recém-nascido	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml / l)	40 ml

Componentes	Fornecedor	Número de catálogo	Concentração	Quantidade
MEM líquido (1X)	Invitrogen	32360-034		1800 ml
Piruvato de sódio	Invitrogen	11360-039	1 mM (10 ml / l)	20ml
L-glutamina	Invitrogen	25030-032	2mM (10 ml / l)	20ml
De soro de vitelo recém-nascido	Invitrogen	26010-74	2% (20 ml / l)	40 ml
Dextran t500	Pharmacosmos	551005004007	6% (60 g / litro)	120 g / l