Mapeando a organização espacial emergente de células de mamíferos usando Micropatterns e imagens quantitativas

Resumo

O método aqui apresentado utiliza micropadronização em conjunto com a imagem quantitativa para revelar a organização espacial dentro das culturas de mamíferos. A técnica é fácil de estabelecer em um laboratório de biologia celular padrão e oferece um sistema tratável para estudar padronização in vitro.

Resumo

Um objetivo fundamental na biologia é entender como os padrões surgem durante o desenvolvimento. Vários grupos demonstraram que a padronização pode ser alcançada in vitro quando as células estaminais são confinadas espacialmente em micropadrões, estabelecendo assim modelos experimentais que oferecem oportunidades únicas para identificar, in vitro, os princípios fundamentais da biologia biológica Organização.

Aqui nós descrevemos nossa própria implementação da metodologia. Nós adaptamos uma técnica Photo-patterning para reduzir a necessidade para o equipamento especializado para facilitar estabelecer o método em um laboratório padrão da biologia de pilha. Também desenvolvemos uma estrutura de análise de imagem livre, de código aberto e fácil de instalar, a fim de medir precisamente o posicionamento preferencial de subpopulações de células dentro de colônias de formas e tamanhos padrão. Este método torna possível revelar a existência de eventos de padronização mesmo em populações aparentemente desorganizadas de células. A técnica fornece insights quantitativos e pode ser usada para desacoplar influências do ambiente (por exemplo, sinais físicos ou sinalização endógena), em um determinado processo de padronização.

Introdução

Nos sistemas de mamíferos, a padronização é uma propriedade emergente do comportamento coletivo das células e, portanto, os padrões podem formar in vitro se forem fornecidas indicações apropriadas às células^{1,2,3,4, 5. º , 6}. uma maneira de revelar a capacidade intrínseca das células de se AutoOrganizar in vitro é forçar as células a formar grupos/colônias de formas e tamanhos definidos^7,8,9,10 . Uma técnica que permita isto é micropatterning¹¹. A micropadronização possibilita a definição precisa do local onde as moléculas de matriz extracelular (ECM) são depositadas em uma superfície. Isso, por sua vez, determina onde as células podem aderir e, portanto, controla como as células se organizam espacialmente.

A micropadronização é uma técnica com inúmeras aplicações, por exemplo, a micropadronização possibilita padronizar as condições iniciais antes da diferenciação¹². Importante, micropatterning faz possível controlar facilmente o tamanho, a forma e o afastamento de colônias da pilha e esta propriedade pode ser usada para conceber os experimentos visados interrogar a resposta coletiva das pilhas ao What ou às pistas físicas^{7 , 8} . º ^{, 10} de ^{, 13} anos de ^{, 14} anos de ^{, 15 anos} de ^{, 16 anos} de ^, a ¹⁷.

Vários métodos de micropadronização foram desenvolvidos¹¹. Técnicas de photopatterning são talvez os métodos mais fáceis para estabelecer¹⁸. Essas abordagens também têm a vantagem da precisão, pois podem ser usadas para controlar a forma das células individuais^18,19,20. Entretanto, igualmente exigem o equipamento especializado caro que inclui um Coater da rotação, uma câmara do plasma e um líquido de limpeza de UVO (UV-ozônio) que não são geralmente prontamente-disponíveis em laboratórios padrão da biologia. Para facilitar a adoção da técnica, adaptamos o protocolo para exigir apenas a lâmpada UVO. Nós começamos das corrediças plásticas comercialmente disponíveis que podem ser cortadas com tesouras ou com um perfurador de furo ao formato desejado.

Uma utilidade importante dos micropatterns é a habilidade de padronizar colônias a fim comparar colônias individuais através das repetições múltiplas. Isso possibilita perguntar em que medida a formação de padrões dentro dessas colônias é reprodutível e explorar fatores que influenciam a robustez do processo de padronização. É importante ressaltar que a quantificação de padrões "de média" em várias colônias padronizadas também pode revelar processos de padronização que, de outra forma, não seriam aparentes. A vantagem de ser capaz de quantificar padronização em colônias padronizadas depende de ser capaz de medir com precisão a expressão protéica, idealmente no nível de célula única. No entanto, as células em micropatterns são muitas vezes firmemente embalados, tornando-os difíceis de segmento com alta precisão. As células também costumam se organizar em três, em vez de duas dimensões, e pode ser desafiador para detectar e preservar as informações tridimensionais (3D) durante a segmentação. Depois que as células tiverem sido segmentadas com êxito, os métodos computacionais são necessários para extrair informações de padronização dos conjuntos de dados resultantes.

Desenvolvemos ferramentas de segmentação e análise de imagem para ajudar a superar esses problemas. Este método de análise só usa software livre e de código aberto e não requer conhecimento de linha de comando ou programação para implementar. Para ilustrar o método aqui, utilizamos células da haste embrionária do rato (mES) que expressam espontaneamente um marcador de brachyury de diferenciação precoce (tbra)^21,22. Embora nenhum arranjo espacial aparente seja visualmente detectável, o método permite a criação de um mapa do posicionamento preferencial de células T + em colônias. Nós igualmente mostramos que o padronização de tbra contrasta com a ausência de uma localização preferencial das pilhas que expressam Id1, um leitura direto da via de Proteína morfogenética do osso (BMP)²³. Também discutimos as limitações atuais do método e como essa técnica pode ser adaptada a outros sistemas experimentais.

Protocolo

Observação: uma visão geral do método é fornecida na Figura 1.

1. projeto da máscara

1. Projete a Fotomáscara de acordo com as diretrizes descritas em Azioune et al.¹⁸. Consulte a tabela de materiais para obter uma referência ao fabricante de software e máscara usado para este estudo.
   Observação: várias geometrias, tamanhos ou espaçamento entre formas podem ser criados em uma máscara. A lâmpada UV pode caber um Fotomáscara de 15 cm que possa conter até 49 projetos diferentes (supor 2 microplaquetas do cm x 2 cm).

2. micropattern processo de fabricação

1. Prepare os materiais necessários.
   1. Prepare uma solução de 0,1% de POLOXAMER 407 (10 mg por 10 mL) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e deixe em uma coqueteleira à temperatura ambiente. O POLOXAMER 407 levará cerca de 20 min para dissolver.
   2. Coloque a película do laboratório (veja a tabela dos materiais) na parte inferior de um prato de Petri quadrado de 10 cm. Isto será usado como a câmara para o depósito da matriz.
   3. Limpe a superfície da Fotomáscara, primeiro com 100% acetona, em seguida, com 100% isopropanol e, finalmente, com ddH₂o. Se possível, secar o ar a máscara fotográfica ou secar a máscara com uma toalha de papel limpa.
   4. Prepare uma peça quadrada, rígida e opaca de plástico com o mesmo tamanho exato que a máscara fotográfica (mais tarde referida como "titular").
      Nota: este será usado para manter as coberturas plásticas em contato com a Fotomáscara durante a etapa de iluminação.
   5. Gire a lâmpada de UVO sobre e funcione uma iluminação de aquecimento por 10 minutos.
2. Criar chips fotomodelados.
   Nota: é possível adaptar o procedimento para criar chips de qualquer tamanho desejado. Para simplificar, descrevemos aqui o procedimento para gerar um chip micromodelado redondo de 12 mm.
   1. Usando um perfurador de furo de 12 milímetros, corte corrediças plásticas hydrofóbicas para criar os COVERSLIP redondos de 12 milímetros e coloc os em um prato de Petri novo limpo.
      PRECAUÇÃO: use luvas em todos os tempos para evitar o contacto da pele com a superfície do plástico, uma vez que pode danificar o tratamento de superfície.
   2. Retire cuidadosamente a película protetora dos lamínulas com pinças.
      Nota: Evite danificar a superfície de plástico, pois isso pode influenciar a colocação das células no chip durante o procedimento de semeadura (seção 3).
   3. Coloque a máscara fotográfica numa superfície limpa e estável (por exemplo, caixa de máscara fotográfica), lado cromado virado para cima e adicione uma gota de 2 μL de ddH₂o na posição do desenho de chip pretendido.
   4. Coloque uma lamínula na gota de ddH₂o e pressione suavemente.
      Nota: Certifique-se de que o lado plástico que enfrenta a máscara fotográfica é o lado que foi protegido pelo filme que foi removido na etapa anterior.
   5. Coloque o suporte em cima das lâminas de plástico e fixar cuidadosamente este sanduíche com grampos, a fim de manter as peças plásticas em contato com a máscara fotográfica.
      Nota: Coloque as braçadeiras o mais próximo possível da localização das lâminas de plástico, a fim de garantir que as lâminas de plástico são perfeitamente mantidas em contacto com a superfície da máscara fotográfica.
   6. Coloque a montagem na lâmpada UVO a cerca de 2 cm da fonte de luz e ilumine durante 10 min.
      Nota: estima-se que o poder da luz seja de 6 mW/cm² a 254 nm de comprimento de onda quando o chip é colocado a uma distância de 2 cm da fonte.
   7. Segure o sanduíche com a máscara fotográfica na parte inferior e Retire cuidadosamente as braçadeiras, mantendo a pressão com uma mão para evitar que as lâminas se movam enquanto desmonta o sanduíche. Retire o suporte, assegurando que todas as peças plásticas ainda estejam na máscara e não presas ao suporte.
   8. Adicione ddH₂o em cima das fichas e retire suavemente as fichas da máscara fotográfica.
      Nota: se a microplaqueta plástica é furada ao photomask, retire a microplaqueta usando uma ponta plástica da pipeta para empurrar a microplaqueta ao prender pinças ligeiramente acima da microplaqueta caso que o chip desanexa de repente.
   9. Finalmente, coloque os chips fotomodelados dentro da câmara de deposição da matriz.
      Nota: Certifique-se de que o lado iluminado do chip está virado para cima.
3. Deposite a matriz.
   Nota: todo o procedimento nesta seção deve ser executado em uma capa da cultura do tecido.
   1. Filtre a solução POLOXAMER 407 através de um filtro de polietersulfona (PES) de 0,22 μm.
   2. Prepare a solução de revestimento ECM misturando 500 μg/mL de POLOXAMER filtrado estéril 407 e 1 mg/mL de gelatina.
      Nota: Consulte também a tabela 1 para obter informações adicionais sobre outras possíveis moléculas de ECM.
   3. Adicione 200 μL da solução de revestimento em cada chip iluminado. A película do laboratório impedirá que a gota caia fora do chip.
   4. Adicionar um prato de Petri de 3 cm preenchido com ddH₂o a fim de limitar a evaporação e colocá-lo com o chip a 4 ° c durante a noite.

3. procedimento de semeadura

Nota: as etapas descritas abaixo foram otimizadas para células-tronco embrionárias do rato CGR8 (mESC)²⁴ usando meio padrão mesc (ver também a tabela de materiais). No entanto, é possível, em princípio, adaptar o procedimento para qualquer tipo de célula. Anote também que a cultura de pilha convencional de pilhas de haste embrionário do rato não é descrita aqui como a documentação extensiva pode ser encontrada em outra parte²⁵.

1. Aspirar a solução de revestimento e incubar os chips duas vezes por pelo menos 5 min com PBS estéril.
2. Entretanto, prepare uma suspensão celular de 5,5 x 10⁵ células/ml em meio morno.
3. Pipet 200 μL de suspensão celular para cada chip (~ 100.000 células/cm²).
4. Feche a câmara de semeadura e deixe as células aderentes por 1 h na incubadora.
5. Após 1 h, encha os poços de uma placa de (placa 4-well ou 24-well dependendo do número de microplaquetas) com 500 μl/poço do meio morno e transfira as microplaquetas na placa com as pinças estéreis.
6. Agitar vigorosamente a placa de forma a separar as células não aderentes. Aspirar o meio e imediatamente substituir com o meio morno fresco. Verifique o microscópio para ver se a padronização é visível (Figura 2a).
   Observação: o tempo de adesão pode precisar ser otimizado ao usar linhas de células que não sejam mESC ou outras proteínas de matriz (consulte também a tabela 2).
7. Repita esta etapa até que os padrões fiquem claramente visíveis, como mostrado na Figura 2a.
   Nota: esta etapa é crítica e determina o sucesso do procedimento. Um procedimento de lavagem que é muito intenso pode separar as células, em contraste a lavagem insuficiente pode resultar em células restantes presas entre os padrões (Figura 2C, d).

4. fixação

Nota: após 48 h na cultura as células devem formar colônias densas que seguem rigorosamente a forma dos padrões (como mostrado na Figura 2b).

1. Deixando os chips na placa, remover ~ 90% do meio, deixando apenas o suficiente médio para evitar que os chips de secagem.
   Nota: é importante que a microplaqueta nunca seque para evitar manchar artefactos e para impedir o destacamento da pilha da superfície. Devido ao hidrofobicidade da superfície da microplaqueta entre testes padrões adesivos, a microplaqueta pode ter uma tendência a de-molhado. Nesta fase, o fixador pode causar grandes colônias abobadadas para separar do chip. As lavas devem ser muito suaves, idealmente realizadas por pipetagem líquida no lado do poço e não diretamente sobre o chip.
2. Adicionar pelo menos 500 μL de solução de fixação à base de paraformaldeído (PFA) por poço e incubar durante 10 min.
   Nota: se as colônias aparecem particularmente grossas (mais de 5 camadas de células), pode ser necessário ajustar o tempo de fixação para 20 min.
3. Após a fixação, lave 3 vezes com a solução de lavagem (PBS com 0, 1% POLOXAMER 407). Uma lavagem extra com 50 mM NH₄CL diluído em solução de lavagem pode ser intercalada para extinguir a atividade de cross-linking residual de PFA.
4. Incubar as amostras durante pelo menos 30 min na solução de bloqueio.
   Nota: nesta fase, as amostras podem ser armazenadas a 4 ° c durante cerca de uma semana antes da coloração. Se assim for, selar a placa com filme de laboratório para evitar a evaporação.

5. imunocoloração

1. Prepare uma câmara de coloração colocando uma folha de filme de laboratório na parte inferior de um prato de Petri quadrado de 10 cm.
2. Prepare soluções de anticorpos (ver tabela 3 para uma lista de anticorpos e diluições utilizadas neste artigo).
3. Coloque o chip na câmara de coloração com o lado suportando as células voltadas para cima e adicione imediatamente 100 μL de solução de anticorpos primários no chip.
   PRECAUÇÃO: nesta fase, as fichas não devem ser facilmente molhadas como no passo 4,1. Entretanto, o cuidado deve ainda ser tomado porque é importante que os chips não secam. Se vários chips tiverem que ser processados, aplique a etapa 5,3 em cada chip sequencialmente.
4. Incubar durante 1 h numa plataforma rotativa à temperatura ambiente.
   Nota: se as células formaram grandes estruturas 3D, pode ser necessário um tempo de incubação mais longo para permitir a coloração uniforme da amostra. O tempo de incubação pode ser aumentado até 24 h. No entanto, a câmara de coloração deve conter um prato de 3 cm preenchido com água e a câmara de coloração deve ser selada com filme de laboratório para evitar a evaporação.
5. Transfira os chips para uma placa de fresca e lave 3 vezes com a solução de lavagem.
6. Realize incubação com anticorpos secundários, conforme descrito na etapa 5,3 e 5,4.
7. Monte a microplaqueta em uma corrediça da microscopia usando 20 μL de todo o meio de montagem padrão (por exemplo, Mowiol).

6. imagem latente

Nota: a imagem latente pode ser executada em um microscópio confocal padrão. Aqui só fornecemos recomendações para garantir uma qualidade de imagem que será suficiente para a análise quantitativa subsequente.

Cuidado: para evitar qualquer viés do operador, as colônias para a imagem só deve ser escolhida usando o sinal de envelope nuclear (para ver se uma colônia segue corretamente a forma do padrão). Evite verificar o sinal de marcadores de juros, exceto ao ajustar as configurações do microscópio.

1. Assegure-se de que a profundidade de bits de aquisição seja 12 ou 16 bits.
2. Identifique as configurações apropriadas para maximizar o intervalo dinâmico para cada canal de imagem. Em particular, evite recorte de imagem.
3. Inclua um canal para a imagem da autofluorescência do micropadrão (consulte a Figura 3).
4. Ajuste o tamanho da imagem e o fator de zoom para obter tamanhos de VOXEL variando entre 0,1 e 0,6 μm nos eixos x e y e variando entre 0,2 e 2 μm no eixo z.
   Nota: por exemplo, neste estudo, utilizamos um microscópio confocal de varredura invertida com um objetivo de 40x (abertura numérica igual a 1,3), um tamanho de imagem de 1024 x 1024 pixels sem zoom digital e um tamanho z-Step de 0,5 μm. Isso resultou em um tamanho de VOXEL de 0,38 μm x 0,38 μm x 0,5 μm.
5. Para cada colônia, defina a posição mínima e máxima ao longo do eixo z para garantir que toda a colônia seja adquirida. Pelo menos um avião com baixo a nenhum sinal deve ser incluído abaixo e acima da colônia.
6. Assegure-se de que as orientações da pilha z sejam adquiridas consistentemente (sempre de cima para baixo ou sempre de baixo para cima)
7. Ajuste a velocidade de digitalização, a resolução da imagem, a média do quadro e os ganhos do detector para identificar um ótimo entre a qualidade da imagem e o tempo de criação. Como indicação, o tempo de imagem para uma colônia, como mostrado na Figura 3 , foi de aproximadamente 2 – 3 min. Realize a aquisição da imagem.
   Atenção: todas as imagens, a fim de serem comparáveis, devem ser adquiridas no mesmo microscópio com o mesmo objetivo e configurações de aquisição.
8. No final da aquisição, salve todas as imagens e atribua uma Convenção de nomenclatura exclusiva para identificar a condição experimental que cada imagem representa.
   Observação: consulte a Figura 4 como um exemplo, esta Convenção será usada posteriormente durante o procedimento de análise. Observe que as imagens podem ser salvas em qualquer formato suportado pelo BioFormats ²⁶. Se as colônias são maiores do que o campo de visão, o plugin de costura de ImageJ pode ser usado²⁷. Note também que em caso de costura, iluminação roll off correção pode ser necessário.

7. análise de imagem

Nota: as especificações de computador recomendadas para este procedimento são: 16 GB de RAM, uma CPU multi-core de 3,33 GHz e pelo menos 50 GB de espaço em disco (ou mais, dependendo do número de fichas que foram fotografadas). O software foi testado em Linux, Windows e MacOS. PickCells é um aplicativo de análise de imagem multi-plataforma com uma interface gráfica de usuário dedicada à análise da organização coletiva das células em imagens multidimensionais complexas (Blin et al, em preparação). Note que mais informações sobre PickCells, bem como documentação para os módulos específicos mencionados aqui podem ser encontradas online: https://pickcellslab.frama.io/docs/. Note também que a interface está sujeita a alterações à medida que continuamos melhorando o software. Se a interface difere do que é mostrado na figura ou vídeo, por favor, consulte o manual on-line.

1. Instale e execute PickCells seguindo a documentação disponível online.
2. Importe imagens e verifique a exatidão das informações fornecidas (Figura 4-1).
3. Documente o nome de cada canal.
4. Núcleos do segmento baseados no sinal do envelope nuclear usando o módulo²⁸ de nessys (Figura 4-2) e forneça um prefixo ("núcleos" por exemplo) que será usado para nomear as imagens segmentadas geradas.
   Observação: as documentações sobre o uso e os ajustes de parâmetro podem ser encontradas em https://framagit.org/pickcellslab/nessys.
5. Inspecionar e editar segmentações, se necessário, usando o módulo editor de segmentação (Figura 4-3)
   Nota: se por algum motivo o processo de segmentação não fornecer resultados satisfatórios, exclua manualmente as imagens na pasta do banco de dados e também exclua o nó ' resultado de segmentação ' no modo de exibição MetaModel . Em seguida, repita o passo 7,4 e 7,5. Se a segmentação de apenas um pequeno subconjunto de imagens não fornecesse resultados satisfatórios, use o aplicativo autônomo Nessys (Veja o link em 7,4), tente segmentação nas ' imagens defeituosas ' e substitua o arquivo correspondente na pasta do banco de dados).
6. Segmentar o sinal de autofluorescência padrão usando o módulo básico de segmentação (Figura 4-4)
   1. Forneça um prefixo ("padrão" por exemplo) que será usado para nomear as imagens segmentadas geradas.
   2. Selecione o canal que contém o sinal de autofluorescência.
   3. Aplicar redução de ruído; geralmente usando um filtro Gaussian com um tamanho de kernel de 10 x 10 x 0,5 voxels dá resultados satisfatórios.
   4. Defina o limite inferior para que o plano de fundo apareça em azul enquanto o primeiro plano for exibido em branco. Defina também o limiar superior para o seu valor máximo para evitar altas intensidades que estão sendo excluídas do resultado final (áreas vermelhas).
   5. Selecione pular para a última etapa.
   6. Clique em concluir e aguarde até que todas as imagens sejam processadas.
7. Quanto aos núcleos, os resultados da segmentação agora podem ser inspecionados visualmente e corrigidos, se necessário, usando o módulo editor de segmentação (Figura 4-5).
8. Crie objetos de núcleos e calcule recursos básicos do objeto.
   1. Inicie o módulo de recursos intrínsecos da barra de tarefas à esquerda da interface principal (Figura 4-6).
   2. Feche os painéis Ellipsoid Fitter e extrator de superfície para manter apenas o painel recursos básicos aberto.
   3. Escolha Nucleus como o tipo de objeto e escolha o prefixo dado na etapa 7,4 para "imagens segmentadas".
   4. Pressione Compute e aguarde até que todas as imagens tenham sido processadas.
      Nota: após esta etapa, não será possível editar as segmentações de núcleos novamente.
9. Crie objetos de padrão e calcule recursos de objeto básico. Repita as etapas 7.8.1 para 7.8.4, apenas desta vez escolha tipo personalizado como tipo de objeto e o prefixo fornecido na etapa 7.6.1 para imagens segmentadas.
   Nota: após esta etapa, não será possível editar as segmentações de padrão novamente.
10. Armazene o nome da imagem que cada núcleo pertence como um atributo de núcleo.
    1. Clique em dados ≫ novo atributo e selecione Nucleus na caixa de diálogo pop-up e clique em OK.
    2. Selecione coletar dados de outros objetos conectados ao nó e clique em Avançar.
    3. No painel esquerdo, selecione imagem e, em seguida, clique duas vezes na marca de interrogação o sinalizador de conclusão no painel de definição de caminho para definir o nó de imagem como destino do caminho.
    4. Expanda o painel atributos disponíveis no painel esquerdo e selecione o atributo Name .
    5. Expanda o painel de operação de redução e selecione obter um, em seguida, clique no botão alterar e clique em Avançar.
    6. Digite "nome da imagem", pressione a tecla Tab e clique em OK.
11. Crie um atributo "coordenada normalizada" em objetos de núcleos (Figura 4-7).
    1. Adapte os passos 7.10.1 para 7.10.6 para armazenar as coordenadas do centróide de padrão como um atributo de núcleo. Nomeie esse novo atributo "coordenar padrão".
    2. Em seguida, clique em dados ≫ novo atributo, selecione Nucleus e clique em OK.
    3. Selecione definir uma função entre vetores espaciais ou direcionais do nó e clique em Avançar.
    4. Para o tipo de função selecione a operação de matriz, para v1 selecione o vetor de Item e, em seguida, Centroide para v2 selecione o vetor de item e, em seguida, padrão coordinate.
    5. Clique em Avançar, digite "coordenada normalizada" no campo nome e clique em concluir.
12. Exporte os dados para um arquivo de valor de tabulação separado.

8. análise R

1. Baixe e instale o RStudio.
   Nota: as informações de software e os links de download estão disponíveis em https://www.rstudio.com/.
2. Faça o download dos scripts R necessários para esta análise.
   Nota: os scripts podem ser transferidos a partir do repositório GitLab: https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr.
3. Abra o RStudio.
   Nota: se executar os scripts pela primeira vez, instale os pacotes R necessários (ggplot2 e escalas).
4. De RStudio, abra o binnedmap_template. Script R.
5. Defina o diretório de trabalho para o local do arquivo de origem.
6. Siga as instruções fornecidas no script para adaptar o script a qualquer dado conjunto de dados para obter mapas espaciais, como mostrado na Figura 5.
7. Execute o script para gerar mapas de densidade.

Resultados

O método Photo-patterning descrito aqui torna possível organizar precisamente as células cultivadas em colônias de formas e tamanhos definidos. O sucesso deste procedimento deve claramente ser evidente imediatamente depois que o procedimento de semeadura da pilha (etapa 3,7) como as pilhas aderentes aglomerará de acordo com o projeto do Fotomáscara segundo as indicações do Figura 2a. Em 1 h após a semeadura celular, padrões individuais podem não ser totalmente confluentes (apenas algumas células por padrão), no entanto, como as células proliferam ao longo do tempo, os padrões se tornarão totalmente colonizados com apenas muito poucas células fora das superfícies adesivas (Figura 2b). A aparência exata da cultura será dependente da linha de célula. Por exemplo, mESC formam colônias de forma abobadada¹⁰. Uma microplaqueta onde o padronização não é desobstruído 1 a 2 h depois que a semeadura da pilha indica a falha do procedimento (Figura 2C, d).

As colônias grandes e grossas podem às vezes ser desafiantes manchar homogeneamente. Nós sugerimos fixar e permeabilize as pilhas em uma etapa (seção 4) porque esta pode melhorar a penetração do anticorpo²⁹. Esta é a razão pela qual a solução fixador escolhida contem um detergente. A Figura 3 mostra o sinal de fluorescência que se espera após a imunocoloração. Observe que células positivas de Id1 brilhantes são encontradas em regiões densas (regiões NPC brilhantes) das colônias (Figura 3a). Dicas como esta são úteis para avaliar a qualidade do procedimento de coloração de anticorpos. Observe também que os micropadrões criados com a técnica atual são autofluorescentes. Este sinal (Figura 3a, B à esquerda a maioria das imagens) é útil durante a fase de análise para registrar espacialmente colônias uns com os outros e criar os resultados mostrados na Figura 5. O sinal do autofluorescence é geralmente o mais brilhante quando a amostra é excited com um laser de 405 nanômetro e este canal deve ser deixado sem manchar para esta finalidade. A Figura 3 também mostra como as células são restritas com precisão em padrões de formas diferentes.

A análise dos dados de imagem é realizada em PickCells, um software livre e de código aberto desenvolvido em nosso laboratório (Blin et al., em preparação). Este software inclui os módulos de análise de imagem para ler e ordenar imagens confocais (Figura 4-1), parasegmentar (Figura 4-2,4-4) e curar objetos segmentados (Figura 4-3,4-5), para calcular o objeto características como coordenadas ou intensidade média (Figura 4-6) e exportar os dados (Figura 4-7, 4-8). É importante ressaltar que desenvolvemos um robusto método de segmentação nuclear chamado Nessys²⁸ , que é particularmente adequado para populações densas e heterogêneas de células, como células cultivadas em micropadrões (Figura 3). Figura 4 -2 mostra uma saída representativa do módulo de nessys onde cada pilha individual é dada exatamente uma identidade original da cor. Somente a edição mínima deve ser necessária, no entanto a edição é viável se o usuário decidir isso (Figura 4-3). Finalmente PickCells fornece um número de módulos de visualização para visualizar os dados. Um exemplo é dado na Figura 4-6: uma colônia em forma de anel é renderizada em 3D, onde os núcleos são codificados por cores de acordo com sua posição ao longo do eixo z. Uma vez que a análise é validada em PickCells, os dados podem ser exportados para criar os mapas espaciais em R usando os scripts disponíveis em (https://framagit.org/pickcellslab/hexmapr) como mostrado na Figura 5³⁰.

Nós mostramos recentemente que o confinamento espacial de mesc em micropatterns pequenos (30.000 μm²) do disco ou da elipse orienta o padronização de uma subpopulação das pilhas que expressam o marcador Mesodermal tbra¹⁰. Assim, para ilustrar nosso método aqui, perguntamos se a padronização de Tbra pode ser influenciada pela sinalização de BMP em colônias maiores (90.000 μm²). A Figura 5a mostra que quando o mesc é cultivado em grandes micropadrões de disco, as células tbra + são preferencialmente restritas à periferia do padrão (mapa de densidade de tbra +), onde a densidade da célula local é a mais baixa (Veja o mapa azul à esquerda da Figura 5a ). Este padronização de tbra é confirmado pelo mapa da intensidade média de tbra.

Esses dados demonstram que o método pode revelar informações subvisuais. De fato, a partir da Figura 3, a inspeção visual de uma colônia não é suficiente para identificar qualquer forma de organização espacial na expressão de tbra. Isto é explicado notavelmente pela colônia importante à variabilidade da colônia que é quantificada e mostrada no painel mais à direita da Figura 5a.

A técnica igualmente mostra que nenhum padronização detectável existe para Id1 (um alvo da sinalização do BMP) que pode indicar que a padronização de T não é conduzida pela sinalização de BMP neste contexto.

Micropatterning torna possível forçar colônias a adotar quase toda a geometria desejada. Isso é particularmente útil para interrogar como o sistema responde a várias geometrias. Por exemplo, podemos raciocinar que se um gradiente morfogênico se acumula no centro da colônia, criar um furo na colônia interromperia esse gradiente. Curiosamente, ainda observamos padronização em um micropadrão de anel, embora de forma menos robusta (Figura 5b).

Figura 1: visão geral do método. O diagrama que mostra as etapas principais do método. Para cada etapa, a quantidade estimada de tempo é indicada o nome da tarefa e um esquema ilustra a finalidade do procedimento. Uma referência a um valor relevante também é fornecida quando disponível. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: aparência da cultura 1 h e 48 h após a semeadura das células em micropadrões. Imagens de brightfield de mESC semeadas em micropatterns. (a) aorganização celular esperada 1 h após a semeadura, os padrões devem ser claramente identificáveis. (b) resultado esperado após 48 h de culturas. o mesc proliferaram e é limitado ainda estritamente às formas do teste padrão. (c – d) Possíveis resultados não-ideais, ou muito poucas células aderir ao plástico, exceto na periferia da lâmina (c) ou as células aderir entre os padrões (d). Consulte a tabela 2 para obter um guia de solução de problemas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: imagens confocais representativas de colônias imunomanchadas cultivadas em micropadrões.
Colônias representativas de mESC após A imunofluorescência para (A) Id1 e complexo de pore nuclear ou (B) tbra e LaminB1. Para cada coloração, uma colônia cultivada em um micropadrão de disco e uma colônia cultivada em um micropadrão de anel é mostrada. Os canais individuais são fornecidos como imagens em escala de cinza. Repare o sinal desobstruído da auto-fluorescência do micropadrão (excitação do laser de 405 nanômetro). A barra de escala representa 50 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: fluxograma do procedimento de análise de imagem. Uma lista de imagens 3D confocais é importada para PickCells para análise (1). Este exemplo mostra um experimento com duas formas distintas (discos e anéis como na Figura 2). A Convenção de nomenclatura de imagem é mostrada à esquerda e a interface PickCells à direita. Em seguida, o módulo Nessys é usado para segmentar automaticamente núcleos (2). No screenshot, cada núcleo individual é dado uma cor original que indica a segmentação exata. A autofluorescência do padrão também é segmentada, desta vez, utilizando o módulo de "segmentação básica" (4). O fundo aparece no sinal azul e branco será definido como a forma do padrão. As formas segmentadas são então inspecionados visualmente para garantir uma segmentação precisa e editadas, se necessário, usando o módulo editor de segmentação (3 – 5). As capturas de tela mostram o contorno das formas detectadas. As formas rosa e amarela foram editadas. Finalmente, os recursos de objetos são computados e exportados para o arquivo para serem processados posteriormente em R (6 – 7). Uma captura de tela de uma colônia renderizada como uma vista 3D é fornecida (6). Para as etapas 2 a 6, os ícones encontrados na interface PickCells no momento da gravação deste artigo são fornecidos ao lado do índice da etapa. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: resultados representativos para dois fatores de transcrição diferentes e formas de micropadrão
Mapa espacial de Binned para o mESC crescido para 48 h em (a) micropatterns dados forma disco ou (B) micropatterns dados forma anel. Para cada forma de micropadrão, o mapa da densidade celular, independentemente do fenótipo celular, é mostrado à esquerda com uma escala de cor azul. Então para cada marcador (Tbra na fileira superior e Id1 na fileira inferior), três mapas distintos são fornecidos, da esquerda para a direita: mapa da densidade da pilha do marcador que expressa pilhas somente (análise baseada limiar), o mapa da intensidade média do marcador (log2) e o mapa do desvio padrão da intensidade do marcador. As intensidades são dadas como unidades arbitrárias de fluorescência. Para cada mapa, a forma de micropadrão é fornecida como um contorno branco. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

	Tipo do ECM	Gelatina	Fibronectina	Matriz da membrana do porão
Concentração	Concentração de ECM	1 mg/mL	20 μg/mL	200 μg/mL
	Concentração de POLOXAMER 407	500 μg/mL	400 μg/mL	1 mg/mL
Testado com	mESC	Sim	Sim	Sim
	o mEpiSC	Não	Sim	Sim
	Meio livre de soro	Não	Sim	Sim

Tabela 1: concentrações testadas de POLOXAMER 407 e ECM. Esta tabela fornece uma visão geral das concentrações de ECM e POLOXAMER 407 que testamos em nosso laboratório. Para cada combinação de ECM/POLOXAMER 407, o tipo de célula para o qual a padronização foi alcançada com êxito é mostrado, bem como se a cultura continha soro ou não. mESC = célula-tronco embrionária do rato, mEpiSC = célula de tronco epiblasto do rato.

Procedimento	Observação	Possível problema	Solução
Micropadronização	Baixo acessório da pilha	relação de concentração inadequada de ECM/POLOXAMER 307	Aumente a relação da concentração de ECM/POLOXAMER 307
		Tempo de fixação da célula muito curto	Aumente o tempo de incubação para dar tempo suficiente às células para aderir adequadamente aos padrões (etapa 3,4). Para optimizar esta etapa, a verificação das células um microscópio pode ajudar a detectar uma alteração na morfologia celular, indicando que as células começaram a aderir.
		Lava muito intenso (passo 3,6)	Ao substituir o meio, evite pipetar o meio diretamente sobre as fichas. Em vez disso, gentilmente Pipet o meio nas paredes do poço em vez
	As células aderem entre os padrões	relação de concentração inadequada de ECM/POLOXAMER 307	Diminua a relação de concentração de ECM/POLOXAMER 407
		Tempo de fixação da célula muito longo	Diminua o tempo de incubação (etapa 3,4).
		Washes ineficaz (passo 3,6)	Agitar a placa vigorosamente geralmente é suficiente para separar as células em excesso. Para os tipos de células que tendem a aderir fortemente ao chip, pipetagem diretamente sobre o chip pode melhorar o resultado. Aumentar o número de lavas também pode ajudar, especialmente para garantir que nenhuma célula permaneça flutuando no meio após esta etapa.
	As pilhas não seguem estritamente a forma do teste padrão	Tipo de célula ' incompatível ' e geometria de padrão	Planejar/projetar várias geometrias/tamanhos a serem adicionadas na máscara fotográfica para poder testar e identificar o tamanho ideal do padrão para uma determinada forma de padrão e tipo de célula. Por favor, consulte a seção "limitações" na discussão
		Foto-padronização não-óptima, isto pode ser diagnosticado observando a agudeza do sinal do autofluorescence. Os limites do padrão devem parecer nítidos como na Fig. 2. Se as bordas dos padrões aparecem borradas então a etapa Photo-patterning precisa de ser melhorada.	As bordas borradas do teste padrão indicam que a corrediça plástica não estava perto bastante à superfície da máscara durante a etapa da iluminação. Assegure-se de que as peças que mantêm os slides na Fotomáscara sejam mesmo e que uma pressão constante e suficiente seja aplicada à montagem durante o procedimento de iluminação.
Mancha	Coloração não homogênea	tempo de incubação do anticorpo demasiado curto	Aumente o tempo de incubação de anticorpos (até 24h à temperatura ambiente)
		colônias achatado durante o procedimento de montagem	O micropadrão da montagem desliza em uma câmara tal como o chamlide ou cytoo-Chambers para executar a imunocoloração e a imagem latente sem a necessidade para montar as pilhas. Isto preservará melhor as colônias 3D-Structure.
	Desanexação de colônias durante o procedimento de coloração	Dewetting do chip	Deixe meio suficiente ou use 2 pipetas, um para remover o meio e o outro para adicionar a solução fresca
	As colônias aparecem cortadas o microscópio	as colônias foram cortadas ao montar a microplaqueta na corrediça da microscopia	Seja muito gentil ao montar as fichas. Alternativamente, os micropatterns da montagem deslizam em uma câmara tal como o chamlide ou os cytoochambers para executar a imunocoloração e a imagem latente sem a necessidade para montar as pilhas. Isso também preserva a ultraestrutura da colônia.

Tabela 2: guia de resolução de problemas. Esta tabela fornece uma visão geral dos possíveis resultados subideais. As potenciais fontes dos problemas também são listadas juntamente com as soluções recomendadas.

Discussão

Aqui nós descrevemos um método para analisar o padronização emergente nas culturas das pilhas. Uma abordagem simplificada de micropadronização é usada para padronização da forma e tamanho das colônias celulares, e apresentamos ferramentas de análise de imagem e scripts R que possibilitam a detecção e quantificação de padrões dentro dessas colônias.

O pipeline que propomos é semelhante, em certa medida, com um método publicado anteriormente³¹ , onde os autores se concentram nas condições de cultura, utilizando micropadrões comercialmente disponíveis, para obter a formação de camada germinativa reprodutível em colônias ESC para o estudo de eventos de gastrulação precoce in vitro. Nosso objetivo é mais focado em fornecer um pipeline generalizável para a descoberta da formação de padrões in vitro, onde a organização coletiva das células só pode se tornar aparente após a análise estatística. Por esse motivo, fornecemos um fluxo de trabalho de análise de imagem robusto que permite a identificação e análise precisas da posição nuclear no espaço 3D em várias colônias (ver também a seção "vantagens e limitações do método de detecção de padrões" deste discussão). Também decidimos desenvolver uma abordagem de micropadronização em casa simples, que oferece uma alternativa mais flexível e mais barata às soluções comercialmente disponíveis a longo prazo que esperamos que sejam úteis para a Comunidade.

Por fim, notamos que, durante a revisão deste manuscrito, foi lançado um novo pacote para a análise de padronização in vitro semelhante aos nossos scripts R³². Este novo pacote aceita tabelas de recursos de célula como entrada que pode ser obtida a partir de plataformas de imagens de alta taxa de transferência. Nós acreditamos que a tabela de características dos núcleos geradas na etapa 7 de nosso protocolo poderia no princípio servir como uma entrada a este pacote novo embora nós não testamos esta possibilidade nós mesmos.

Adaptabilidade do método a outros tipos de células e geometrias de colônias

Nós Apresentamos esta aproximação no contexto de estudar a emergência de fatores Mesodermal da transcrição nas culturas de pilhas pluripotentes na presença de soro. No entanto, o método é prontamente adaptável a outros tipos de células e a culturas sem soro, embora possa ser necessário otimizar as concentrações de ECM/POLOXAMER 407 (ver tabela 1 para concentrações testadas e tabela 2 para um guia de solução de problemas). O método pode igualmente ser adaptado aos tamanhos maiores ou menores dos micropatterns e a uma escala larga das formas de acordo com as necessidades do usuário. No entanto, ao estabelecer o método, é importante estar ciente de que nem todas as combinações de forma/célula tipo são ideais. Por exemplo, mesc expressar altos níveis de E-cadherin^33,34 permitindo que essas células para formar estruturas coletivas abrangendo áreas que são desprovidos de ECM. Estas pilhas não seguem estritamente geometrias com ângulos afiados ou que incluem furos pequenos no teste padrão. Observe, por exemplo, que no anel da Figura 3B, as células estão no processo de colonizar a área central. Em nossas mãos, uma área central menor não forçaram mESC a formar colônias em forma de anel. É conseqüentemente altamente-recomendado incluir uma diversidade das geometrias ao projetar o Fotomáscara para poder testar e identificar os tamanhos e as curvaturas ideais que serão seridos para o tipo da pilha de escolha.

Outro fator importante a ser considerado é o comprimento do experimento e a taxa de proliferação das células. Para alguns tipos rapidamente proliferating da pilha (que incluem pilhas pluripotentes) pode ser difícil manter pilhas em micropatterns sobre muitos dias (para o mESC três dias é um máximo). Além disso, a semeadura de células em micropadrões nem sempre ocorre de forma otimizada para cada colônia, por isso é aconselhável para sementes um excesso de colônias, a fim de ter peças sobressalentes.

Vantagem e limitações do método de detecção de padrões

Uma vantagem particular do método é a capacidade de detectar padrões "média" combinando resultados de análise de imagem de várias colônias replicadas (Figura 5). Isso pode revelar eventos de padronização que não são aparentes da inspeção de colônias individuais. Uma desvantagem desta abordagem ' média ' é que ele pode perder certos tipos de padrões repetitivos, por exemplo, pequenos pontos ou listras estreitas. No entanto, esses tipos de padrão podem, em vez disso, ser revelados com uma combinação de tamanhos de padrão cuidadosamente escolhidos⁸. Além disso, o pipeline de análise de imagem aqui descrito fornece dados quantitativos em uma única célula e resolução de colônia, oferecendo a possibilidade de investigar o nível de variabilidade intercolônia (Figura 5) ou para realizar a análise vizinha em vários escalas¹⁰.

Outra vantagem importante do método de média é que ele oferece a oportunidade de mapear a localização preferencial de muitos marcadores sem ser limitado por fluoróforos disponíveis de canais de detecção. Na verdade, apesar de fazermos uso de apenas dois marcadores de diferenciação no trabalho aqui apresentado, a capacidade de padronizar colônias e extrair padrões "de média" possibilita comparar os mapas de distribuição de diferentes conjuntos de colônias em conjunto, a fim para revelar as relações espaciais generalizadas de marcadores entre si.

Além disso, embora nosso foco tenha sido estudar marcadores de diferenciação, o método de análise pode ser estendido para estudar outros processos biológicos para os quais estão disponíveis marcadores nucleares. Por exemplo, a micropadronização de uma linha celular contendo um indicador de ciclo de células de ubiquitinação por fluorescência³⁵ (Fucci) tornaria possível estudar como a geometria do nível de colônia pode influenciar os eventos do ciclo celular no grupo.

Direções futuras

O método é passíveis à análise de imagem da taxa de transferência média, entretanto, a aquisição da imagem não é atualmente inteiramente automatizada e pode tornar-se limitando para experimentos muito grandes. Os arranjos regulares das colônias devem tornar possível criar rotinas de aquisição totalmente automatizadas semelhantes às que foram desenvolvidas para uma única célula com média de²⁰. No entanto, porque o tamanho do campo exigido para a imagem de uma colônia é grande, possivelmente exigindo mosaicking, e porque as colônias são tridimensionais, é altamente desejável para reduzir o tamanho do conjunto de dados e tempo de aquisição por imagem apenas colônias relevantes. Portanto, esforços futuros podem ser dedicados a desenvolver um microscópio "inteligente" capaz de identificar colônias relevantes e adaptar as coordenadas de imagem para cada amostra. Isso não só reduzirá o tempo e o esforço, mas também evitará potenciais vieses do operador.

Os pipelines de análise também podem ser tornamentos mais eficientes, reduzindo o número de etapas que o usuário precisa tomar. Temos planos para construir um mecanismo de construção de pipeline e para integrar R diretamente em nosso software (ver também questões pickcells-API # 3 e pickcells-rjava # 1 no rastreador de problemas de nossos repositórios de código [https://framagit.org/groups/pickcellslab/-/issues]). A automatização completa do procedimento de análise reduzirá o tempo e o esforço e limitará erros potenciais do usuário.

Por fim, notamos que nosso método de análise ainda não capturou totalmente a natureza dinâmica da padronização celular. Algumas informações dinâmicas limitadas podem ser extraídas examinando uma série temporal de imagens de snapshot^8,10,36. No entanto, ser capaz de registrar a história da população celular é altamente desejável se desejarmos entender melhor como a padronização emerge. Uma limitação é que o rastreamento exato de células individuais em uma população de células 3D densa permanece uma tarefa muito desafiadora³⁷. Nosso método da deteção da pilha usa o envelope nuclear e executa particularmente bem em populações densas e sobrepostas da pilha²⁸. Os repórteres vivos do envelope nuclear estão prontamente-disponíveis^28,38 e uma vantagem da técnica do micropatterning é que pode ser usado para impedir que as pilhas movam fora do campo de visão durante a imagem latente a longo prazo. Globalmente, estamos confiantes de que o rastreamento automatizado de células será alcançável usando uma combinação de ferramentas recém-estabelecidas^28,39,40 e que isso deve trazer novos insights sobre o fundamental princípios da autoorganização.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010	handle in fume hood
1× Master quartz anti-reflective chromium photomask	Toppan Photomask	Custom design
24-well plates	Corning	3526
4-well plates	Nunclon Delta	176740
5% Donkey Serum	Sigma	D9663
Anti Nuclear pore complex	Abcam	ab24609	Mouse monoclonal, use 1:1000
Anti-Id1	Biocheck	37-2	Rabbit polyclonal, use 1:200
Anti-Lamin B1	Abcam	ab16048	Rabbit polyclonal, use 1:1000
Anti-Tbra	R&D	AF2085	Goat ployclonal, use 1:400
Blocking Solution	NA	NA	0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 5% Donkey Serum 0.003% Sodium Azide In PBS
CGR8 mESC	NA	NA	Reference: Mountford et al. PNAS, 1994
Fixation solution	NA	NA	4% PFA diluted in washing solution
Foetal bovine serum	Gibco	10270-106	Serum batches must be tested to ensure compatibility with ESC maintenance
Gelatin	Sigma	G1890
Glasgow Minimum Essential Medium	Sigma	G5154
Laboratory Film	VWR	291-1212
Layout Editor Software	LayoutEditor	NA	https://layouteditor.com/
Layout Editor Software	Klayout	NA	https://www.klayout.de/
L-glutamine	Gibco	25030-024
LIF	Millipore	ESG1107
MEM NEAA	Gibco	11140-035
mESC Culture medium	NA	NA	GMEM 10% FCS 100 U/ml LIF 100 nM 2-mercaptoethanol 1× non-essential amino acids, 2 mM L- glutamine 1 mM sodium pyruvate
NH4Cl 50mM	Sigma	9718
Paraformaldehyde	Sigma	158127	CAUTION: Toxic, handle undiluted stocks in fume hood and wear protective equipment
PBS (immunostaining)	Sigma	P4417	Dilute in 200ml of ddH2O
PBS (tissue culture)	Gibco	11140-035
Plastic slides	Ibidi	IB-10813
Poloxamer 407	Sigma	P2443
ProLong Gold Antifade Mountant	Molecular Probes	P36930
Sodium Azide	Sigma	8591	CAUTION: Toxic, handle in fume hood and wear protective equipment
Sodium pyruvate	Gibco	11360070
TritonX-100	Sigma	T8532
Trypsin	Gibco	25200056
UVO cleaner	Jetlight, USA	42-220	CAUTION: Follow manufacturer’s safety recommendations
Washing Solution	NA	NA	0.1% TritonX-100 0.01% Pluronic F-127 In PBS