Uma tarefa comportamental modelando a 'memória cotidiana' em uma arena de eventos para promover representações alocêntricas para roedores

Resumo

O objetivo desse protocolo otimizado de 'memória cotidiana' em uma arena de eventos era empregar uma base estável que incentivasse o uso de representações espaciais alocêntricas. Este modelo animal fornece um banco de testes eficaz para pesquisas futuras sobre a formação e retenção de memórias de eventos usando técnicas comportamentais e fisiológicas.

Resumo

A arena de eventos fornece uma plataforma ideal para investigar o aprendizado e a memória. A tarefa de memória cotidiana apetitiva descrita neste artigo fornece um protocolo robusto para a investigação da memória episódica e espacial em roedores, que promove especificamente a representação da memória alocêntrica. Os ratos são treinados para encontrar e cavar em busca de comida durante a fase de codificação e, após um atraso de tempo, os ratos têm a opção de encontrar o pellet de comida de recompensa no local correto. Existem dois elementos-chave que promovem o uso de uma estratégia alocêntrica neste protocolo: 1) os ratos partem de diferentes locais de partida dentro e entre as sessões, 2) uma base estável é implantada onde os ratos precisam carregar sua comida para comer. Por meio dessas modificações, encorajamos efetivamente os roedores a usar representações espaciais alocêntricas para realizar a tarefa. Além disso, a tarefa fornece um bom paradigma para o projeto experimental dentro do sujeito e permite que os experimentadores manipulem diferentes condições para reduzir a variabilidade. Usado em conjunto com técnicas comportamentais e fisiológicas, o modelo de roedor resultante fornece um banco de testes eficaz para pesquisas futuras sobre formação e retenção de memória.

Introdução

Para investigar a neurobiologia da aprendizagem e da memória, são necessárias técnicas invasivas, que geralmente não são viáveis em humanos. Assim, por mais de um século, protocolos comportamentais foram projetados para animais de laboratório para modelar várias formas de memória humana. O design e a escolha da tarefa e do aparato são fundamentais para o sucesso de modelos eficazes da memória humana. Numerosos paradigmas foram desenvolvidos com complexidade diversa, variando de simples protocolos de condicionamento clássico e instrumental ^1,2,3 a labirintos como o labirinto em T⁴, labirinto de braço radial⁵, labirinto de Barnes⁶, labirinto aquático⁷ e labirinto de tábua de^{queijos 8}. No entanto, embora essas tarefas capturem facetas da aprendizagem associativa e da navegação espacial, elas não podem ser usadas de forma inequívoca para estudar a representação da memória de eventos momentâneos (ou seja, memória episódica). E, embora o novo reconhecimento de objetos⁹ e as permutações dessa tarefa de memória espontânea, como a memória de lugar de objeto¹⁰, tenham fornecido informações valiosas sobre a memória de reconhecimento, eles não testam a lembrança explícita de eventos. Para atender a essa demanda, a arena de eventos foi desenvolvida especificamente e seu uso permitiu a pesquisa de codificação e recordação de memória associada emparelhada de longo prazo 11,12,13, bem como a codificação e recordação de eventos discretos que acontecem em um espaço familiar 14,15,16,17,18. O último tema é o foco deste manuscrito.

A arena de eventos é uma área grande, quadrada e de campo aberto onde ocorrem eventos para roedores. O tamanho da arena pode ser dimensionado para acomodar ratos ou camundongos, e os roedores são incentivados a entrar e explorar. Um exemplo típico de um evento que ocorre dentro da arena é encontrar e recuperar alimentos de um poço de areia em um local específico. A arena do evento é projetada para essas tarefas apetitosas, nas quais ratos ou camundongos são treinados para procurar, encontrar e desenterrar comida. Ele capitaliza sua tendência natural de levar comida de volta para um ambiente escuro, que neste caso está localizado ao lado da arena, onde eles a comem. Após um treinamento mínimo para cavar em busca de comida, os roedores realizam essa tarefa naturalmente e têm um bom desempenho no teste de codificação e no teste de escolha de recall, que segue os testes de codificação após um curto atraso de 30 minutos. Em um teste de escolha, vários poços de areia (ou seja, locais para cavar) estão disponíveis, mas apenas um é recompensado.

Diferentes tarefas podem ser realizadas dentro da arena de eventos (por exemplo, memória espacial, memória episódica e aprendizagem associada a pares). Dado o interesse em desenvolver modelos eficazes de memória episódica, foi desenvolvido o seguinte protocolo, no qual o local onde o alimento pode ser encontrado é alterado diariamente. Nesta tarefa, os roedores são obrigados a lembrar onde o evento de cavar e recuperar com sucesso uma recompensa alimentar aconteceu mais recentemente na arena do evento. O protocolo descrito abaixo envolve um teste de codificação no qual os ratos procuram um poço de areia em um novo local a cada dia, seguido, após um atraso, por um teste de escolha de recall, onde a localização do poço de areia recentemente codificada é recompensada, enquanto os outros poços de areia alternativos em diferentes locais não contêm alimentos acessíveis. Lembrar onde a comida estava no dia anterior não ajuda: o local correto deve ser codificado e lembrado, pelo menos por um tempo, todos os dias. Assim, introduzimos o termo 'memória cotidiana' para capturar a forma de memória modelada nesta tarefa, que nós, como humanos, usamos diariamente. Um exemplo humano de memória cotidiana é lembrar onde alguém estacionou o carro no shopping (Figura 1A) ou colocou os óculos pela casa. Neste protocolo, todas as pistas intra e extra-arena são estáveis, assim como nas configurações de nossas vidas cotidianas (ou seja, casas, escritórios, estacionamentos, etc.). Assim, os roedores devem se lembrar de onde algo aconteceu mais recentemente em um ambiente familiar (Figura 1B). A tarefa é análoga, mas uma melhoria, à tarefa de correspondência atrasada para o local (DMP) no labirinto aquático¹⁹. Por ser uma tarefa apetitosa, explora o comportamento natural dos roedores para procurar comida²⁰, em vez de seu desejo de escapar da água. No entanto, como no labirinto aquático⁷, não há pistas locais diferenciando locais corretos de incorretos; Os animais devem usar a recordação em vez do reconhecimento para localizar a localização correta do Sandwell após diferentes durações de atraso de memória.

Figura 1: Memória cotidiana. (A) Memória cotidiana humana. Esquema mostrando um carro verde estacionado em um estacionamento. Após um atraso, o motorista tenta lembrar exatamente onde estacionou o carro. (B) Memória cotidiana animal. Esquema mostrando um rato cavando e recuperando uma pelota de um poço de areia em um local dentro da arena do evento. Após um atraso, o rato recebe um teste de escolha com vários poços de areia incorretos (cinza) e um poço de areia correto (verde). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A arena de eventos já foi utilizada com sucesso em investigações da 'memória cotidiana'. Essas são memórias que são codificadas automaticamente a cada dia, retidas na memória de longo prazo, mas muitas vezes esquecidas após períodos de tempo relativamente curtos. Bast et ^al.14 mostraram memória monotônica de eventos dependentes de atraso, que varia de memória excelente após intervalos curtos a nível de chance após 24 h. A retenção de memória pode, no entanto, ser aprimorada com sucesso pela novidade pós-codificação ou, com várias tentativas de codificação, com espaçamento de tentativa estendido ^15,17.

A arena de eventos é versátil e relativamente não estressante; nenhum estímulo aversivo é usado. O tamanho da arena e as tarefas que ela acomoda podem ser adaptados tanto para ratos^14,15 quanto para camundongos¹⁶. Além disso, como uma tarefa terrestre, é passível de registro fisiológico e estudos de imagem de cálcio, ao contrário do labirinto aquático²¹. Além disso, de acordo com os princípios dos 3Rs (redução, refinamento, substituição), os estudos que empregam a arena de eventos requerem menos animais para obter poder estatístico, pois os projetos experimentais dentro do sujeito são viáveis (nos quais cada animal serve como seu próprio controle para intervenções farmacológicas, estímulos optogenéticos, etc.) e nenhum estímulo aversivo é necessário para a motivação. Embora o treinamento inicial exija mais tempo e ocorra em mais sessões do que, por exemplo, em tarefas de reconhecimento de novidades, uma vez que os animais atinjam um nível estável e assintótico de desempenho na tarefa, manipulações como drogas, controle de veículos ou estimulação optogenética podem ser intercaladas com um número relativamente pequeno de sessões de treinamento adicionais¹⁷. Além disso, facetas distintas da representação estão sob controle experimental direto na arena do evento, como a natureza da representação espacial empregada ao resolver a tarefa.

A questão da representação diz respeito ao arcabouço mental empregado pelos ratos ao lembrar onde os eventos recentes acontecem¹⁸. Eles se lembram de onde a comida está localizada ou apenas se lembram de como chegar até a comida? Os ratos podem usar representações espaciais alocêntricas (semelhantes a mapas) ou egocêntricas (centradas no corpo) para resolver uma tarefa apetitosa dentro da arena¹⁸. No entanto, para controlar e identificar a estratégia espacial empregada por cada sujeito experimental na execução da tarefa, existem protocolos de treinamento distintos que são capazes de promover seletivamente o uso de apenas uma representação espacial. Normalmente, uma representação baseada em egocentrismo é empregada quando os ratos levam sua recompensa alimentar de volta ao mesmo local de onde iniciaram o teste do dia, o que permite várias oportunidades de lembrar o local da recompensa durante as corridas para frente e para trás. Essa estratégia espacial pode ser empregada independentemente de o local inicial ser alterado de um dia para o outro ou mantido constante. Em contraste, uma representação alocêntrica é favorecida quando os ratos são obrigados a carregar a recompensa alimentar para um local fixo de base ao lado da arena, que é diferente dos locais de partida variáveis. Existem inúmeras vantagens das representações alocêntricas em relação à capacidade de armazenamento do cérebro.

Neste artigo, descrevemos o protocolo de base doméstica, que incentiva o emprego apenas de uma representação alocêntrica. Fornecemos resultados representativos para esta tarefa, que ilustram claramente as vantagens de usar esse modelo de roedor de 'memória cotidiana' na investigação de aprendizagem e memória e destacam como representações alocêntricas de memória espacial episódica podem ser promovidas.

Protocolo

Os métodos descritos neste artigo foram aprovados pelo Comitê de Revisão Ética da Universidade de Edimburgo; estão em conformidade com a Lei dos Animais (Procedimentos Científicos) do Reino Unido de 1986 e com a Directiva do Conselho das Comunidades Europeias de 24 de Novembro de 1986 (86/609/CEE) que rege a manutenção de animais de laboratório e a sua utilização em experiências científicas.

NOTA: O objeto experimental do protocolo descrito abaixo são os ratos com capuz de Lister, mas pode ser adaptado para outras linhagens de roedores.

1. Manuseio, alojamento e controle de alimentos de animais

1. Aguarde 1 semana para que os ratos machos com capuz de Lister se acomodem após a chegada. Durante esse período, manuseie-os diariamente, acariciando-os suavemente e fazendo cócegas em suas gaiolas. Depois de assentados, comece a buscá-los por aproximadamente 5 minutos por dia.
2. Registre o peso de cada rato na chegada e a cada 2-3 dias por semana. Adapte sua ingestão de alimentos, de modo que o peso de cada rato seja gradualmente reduzido para aproximadamente 85% -90% de seu peso corporal de alimentação livre; Isso pode ser estimado usando uma curva de crescimento estabelecida para ratos de alimentação livre. Mantenha os ratos dentro dessa faixa de peso com restrição alimentar durante todo o experimento.
3. Alojar os ratos em um ciclo de luz de 12 h (luz acesa) / 12 h (luz apagada) e realizar todos os experimentos durante a fase de luz (7h-7h).

2. Configurando o aparelho

1. Salas experimentais, salas de controle e arena de eventos
   1. As salas experimentais e de controle são uma sala separada em duas partes ou duas salas adjacentes separadas por uma cortina ou porta e são necessárias para este experimento.
      NOTA: Essa separação impedirá que os experimentadores influenciem ou interrompam os animais enquanto eles executam e aprendem essa complexa tarefa comportamental.
   2. Dedique uma sala à arena do evento, às pistas ambientais estáticas e aos procedimentos experimentais (ou seja, a sala experimental) e use a outra sala para registrar o desempenho dos ratos pelos experimentadores (ou seja, a sala de controle).
      NOTA: Uma arena de eventos é uma área de campo aberto em forma de quadrado onde as associações evento-local podem ser estudadas (Figura 2A). O nome 'arena de eventos' deriva do fato de que esse aparato é uma arena (ou seja, um espaço aberto, mas restrito) no qual 'eventos' acontecem (por exemplo, desenterrar pelotas de comida enterradas em poços de areia; Figura 2B)^17,18. Para evitar excesso de trabalho e lesões (ou seja, tensão nas costas) para o experimentador, a arena é elevada acima do chão (~ 1 m).
   3. Usando Plexiglass transparente, construa uma arena quadrada (160 cm x 160 cm). O piso da arena é composto por uma grade 7 x 7 de 49 ladrilhos móveis de acrílico branco (20 cm x 20 cm; Figura 2A, B). Modifique cinco ladrilhos adicionais com um orifício central (6 cm de diâmetro): eles manterão os poços de areia dentro da arena. Os cinco locais desses blocos modificados são organizados na configuração descrita no mapa de poço de areia de cada sessão.
      NOTA: A configuração dos cinco locais de poço de areia muda a cada nova sessão (consulte a etapa 4.2).
   4. Coloque a arena do evento na sala experimental designada. Configure os tacos intra-arena: posicione dois pontos de referência distintos com superfícies táteis distintas (por exemplo, uma pilha colada de bolas de golfe (30 cm (a) x 11 cm (l) x 11 cm (l)) e uma garrafa de água preta (22 cm (a) x 9 cm (p))) em dois locais dentro da arena: linha 4, coluna 2 e linha 4, coluna 6 (Figura 2C).
   5. Mantenha os objetos usados para as pistas intra-arena e sua posição constantes durante todo o experimento, mas limpe-os diariamente com etanol a 70%.
   6. Configure as dicas extra-arena 3D: posicione pontos de referência distintos (por exemplo, lanterna esférica padronizada (40 cm (d)); lanterna estrela vermelha (60 cm (w)); lanterna azul (70 cm (h) x 35 cm (w))) e padrões ao redor do perímetro da arena do evento - que está posicionada no centro da sala experimental (Figura 2D).
   7. Mantenha os objetos usados para as pistas extra-arena e sua posição constantes durante todo o experimento.
2. Caixas pretas
   1. Para permitir o acesso dos animais à arena, construa quatro caixas pretas idênticas de acrílico preto (comprimento: 30 cm, largura: 25 cm, altura: 35 cm por caixa; Figura 2E). Cada caixa preta deve ter uma porta deslizante com controle remoto em uma superfície de comprimento único. Isso dará ao experimentador controle sobre a entrada dos ratos na arena.
      NOTA: O acrílico preto cria um interior escuro, que é preferido pelos ratos em vez do ambiente claro da arena de eventos em campo aberto.
   2. Coloque essas caixas pretas no meio de cada uma das quatro paredes da arena. Essas caixas pretas serão identificadas por sua localização em relação à parte superior do feed de vídeo ao vivo - capturado pela câmera e recebido pelos computadores na sala de controle - usando os pontos cardeais Norte (superior), Leste (direita), Sul (inferior) e Oeste (esquerda) da arena do evento.
   3. Permita que os ratos entrem na arena por uma das três caixas pretas, que é chamada de caixa inicial (por exemplo, Leste, Sul e Oeste; Figura 2A, retângulos laranja). Use a caixa preta restante (por exemplo, Norte; Figura 2A, retângulo azul) como uma base, na qual os ratos entrarão para comer a recompensa alimentar (ou seja, pellets) que recuperam da arena.
      NOTA: Qualquer local de caixa preta (ou seja, Norte, Leste, Sul, Oeste) pode ser designado como base, mas deve ser mantido constante durante todo o experimento: a estabilidade de sua localização é crítica para o incentivo bem-sucedido de representações espaciais alocêntricas.
   4. Nas caixas iniciais e na base, coloque dois poços pequenos, transparentes e planos, um para água e outro para pellets de comida (no caso da base, isso é usado como recompensa apenas no estágio de habituação) e coloque serragem em cada caixa inicial e na base.
3. Poços de areia
   1. Use plástico acrílico transparente, com um diâmetro interno (d) de 6 cm e uma profundidade total (h) de 6 cm para fazer poços de areia usados para esconder a recompensa alimentar que os ratos recuperam (ou seja, localizar, desenterrar e levar para a base para comer). Insira uma tigela de plástico esférica perfurada a 4 cm do topo. Insira os poços de areia nas peças adaptadas dentro da arena.
      NOTA: A tigela de plástico cria uma parte acessível (6 cm (d) x 4 cm (h)) para pellets recompensados, aos quais os ratos têm acesso, e uma seção inacessível (6 cm (d) x 2 cm (h)), à qual os ratos não têm acesso (Figura 3A, B).
   2. Nos poços de areia recompensados, para testes de codificação e escolha de recall, coloque quatro pellets de 0,5 g na seção acessível e oito pellets de comida na seção inacessível ( Figura 3C ). Nos poços de areia não recompensados, coloque doze pellets na seção inacessível (Figura 3C).
      NOTA: Tanto os poços de areia recompensados quanto os não recompensados contêm um total de 12 pellets e são preenchidos com areia especialmente preparada, que esconde os pellets nos sandwells.
   3. Encha os poços de areia com uma mistura de areia e pó de masala (2,5 g de masala/2,5 kg de areia) para mascarar qualquer odor que emane dos pellets de alimentos. Prepare a mistura de areia / masala no início de cada sessão (Figura 3D).
      NOTA: As etapas 2.3.2 e 2.3.3 são projetadas para mascarar quaisquer artefatos olfativos que emanem dos poços de areia durante os testes de codificação e escolha. Isso garantirá que a busca dos ratos pela localização correta do poço de areia e o desempenho da tarefa resultante sejam guiados apenas por sua memória do local onde a comida foi desenterrada, e não por qualquer sinal de odor que emane do poço de areia recompensado, que poderia revelar a presença de recompensa alimentar.
   4. Durante um teste de sonda, que testa a memória dos ratos para a localização do único poço de areia previamente recompensado (ou seja, contém bolinhas de comida), faça com que todos os cinco poços de areia presentes na arena sejam não recompensados (ou seja, não há bolinhas de comida disponíveis na seção acessível); incluindo a localização correta do poço de areia.
      NOTA: Todos os poços de areia presentes dentro da arena contêm o mesmo número de pellets (n = 12) em sua seção inacessível.
4. Configuração geral e software
   1. Manter a iluminação da sala experimental a um nível moderado de luminosidade utilizando lâmpadas de halogéneo de parede (115-125 lux) e manter uma temperatura ambiente entre 19 e 23 °C.
   2. Instale uma câmera de dispositivo de carga acoplada acima da arena de eventos na sala experimental para registrar e monitorar os movimentos e o comportamento do rato (Figura 4A). A câmera fornece uma transmissão ao vivo para a sala de controle adjacente para captura de vídeo personalizada e software de computador personalizado (desenvolvido por PA Spooner, Universidade de Edimburgo).
   3. Monitore os movimentos dos ratos usando o software de computador personalizado usado para cronometrar os ratos (Figura 4B). Este programa controla a porta de cada caixa preta, permitindo que os experimentadores gerenciem remotamente o acesso dos ratos de e para a arena a partir de sua sala de controle adjacente. Registre a latência de cada animal para localizar o poço de areia correto e o tempo gasto cavando em cada poço de areia durante um teste de escolha e sonda.

Figura 2: A arena do evento e as pistas. (A) Esquema mostrando a arena do evento (Abreviaturas: N = Norte, E = Leste, S = Sul, W = Oeste). (B) A arena do evento com pistas intra e extra-arena. (C) As duas pistas 3D intra-arena (da esquerda para a direita): pilha de bolas de golfe e garrafa preta cilíndrica. (D) Várias dicas extra-arena 3D (da esquerda para a direita): lanterna esférica padronizada; lanterna estrela vermelha; lanterna azul. (E) Uma das quatro caixas pretas está posicionada no meio de cada parede da arena do evento. Três dessas caixas-pretas servem como caixas de partida, que fornecem uma posição inicial para os ratos no início de cada teste. A quarta caixa preta é uma base onde os ratos consomem a recompensa alimentar que recuperam da arena. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Poços de areia. (A) Esquema mostrando um poço de areia vazio com as seções acessíveis e inacessíveis rotuladas. (B) Um poço de areia vazio com uma seção acessível e uma seção inacessível. (C) Esquema ilustrando o arranjo de pelotas em um poço de areia recompensado (esquerda) e não recompensado (direita). Tanto os poços de areia recompensados quanto os não recompensados contêm um total de 12 pellets e são preenchidos com areia especialmente preparada, que esconde os pellets nos poços de areia. (D) Série de fotografias mostrando a preparação de um poço de areia recompensado, incluindo a colocação correta dos pellets na seção acessível (etapa 1-4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: A configuração experimental da arena do evento. (A) Esquema mostrando a configuração experimental das salas experimental e de controle. (B) Captura de tela mostrando uma transmissão ao vivo da sala experimental visualizada por meio do software de computador personalizado. O software de computador personalizado permite que os experimentadores controlem as portas da caixa de partida remotamente e fornece outras medições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Protocolo de habituação

NOTA: Durante a habituação, os ratos são treinados para procurar poços de areia, cavar em busca de uma recompensa alimentar e explorar a arena do evento.

1. Aprendendo a cavar para obter uma recompensa alimentar
   1. Coloque um pequeno recipiente cheio de areia em uma gaiola individual. Para a primeira sessão (ou seja, H1), adicione três pellets de alimentos de 0,5 g logo abaixo da superfície da areia e coloque um pellet de alimentos por cima. Em seguida, coloque todos os quatro pellets sob a superfície (Figura 5).
   2. Coloque cada rato na gaiola individual com um poço de areia, refrescando o poço de areia para cada rato. Deixe o rato na gaiola individual até que ele cave e recupere com sucesso todos os quatro pellets do poço de areia.
2. Sessão de Habituação 1
   1. Coloque um rato em uma das caixas iniciais (por exemplo, Sul) por 30 s e coloque um pellet (0,5 g) no poço pequeno e plano da base (por exemplo, Norte) designado para alimentação. O pellet de comida colocado atua como uma recompensa e incentiva os ratos a irem para a base para comer.
   2. Abra a porta da caixa inicial (por exemplo, Sul). Feche a porta quando o rato sair da caixa de partida, entrar na arena e começar a explorar esse novo ambiente.
   3. Se o rato não sair da caixa de partida em 5 minutos, intervenha de uma das duas maneiras. Incentive o rato a entrar na arena segurando um pincel do lado de fora da porta da caixa de partida. Quando o rato estiver interessado, mova a escova mais para dentro da arena, deixando o rato segui-la. Quando o rato estiver na arena e a uma distância segura da porta da caixa inicial, feche a porta da caixa inicial.
   4. Alternativamente, tire o rato da caixa de partida, feche a porta da caixa de partida e coloque o rato na arena, diretamente do lado de fora da porta da caixa de partida pela qual ele teria entrado. Se um rato estiver desmotivado e não executar bem a tarefa (por exemplo, deixar a caixa de partida sem ajuda, cavar com eficácia, etc.), verifique o peso do rato e calcule seu peso de alimentação livre (%).
      NOTA: Se o peso de alimentação livre estiver bem acima de 85%, o rato pode não estar com fome; Nesse caso, sua ingestão diária total de alimentos (g) pode exigir restrições adicionais.
   5. Depois que o rato explorar a arena por 10 minutos, abra a porta da caixa preta norte (ou seja, base). Se o rato não entrar dentro de 5 minutos após a abertura da porta, tire-o da arena, feche a porta da caixa-preta norte e coloque-o na base.
   6. Depois que o rato terminar de comer o pellet colocado na base no início da sessão, devolva o rato à sua gaiola de origem.
3. Sessão de Habituação 2
   1. Coloque um poço de areia, com todos os quatro pellets de comida (0,5 g/pellet) enterrados sob a superfície da areia, na arena do evento. Mude a localização deste poço de areia recompensado a cada sessão a partir de agora.
      NOTA: Tendo grandes pellets de comida (0,5 g), os ratos preferem carregá-los para um ambiente que considerem seguro (ou seja, ambiente escuro) para comê-los²².
   2. Coloque um pellet no poço de base plana, designado para alimentação, na caixa inicial escolhida (ou seja, Leste), seguido por um rato.
   3. Quando o rato terminar de comer o pellet do taco - após aproximadamente 45 s - abra a porta da caixa de partida (por exemplo, Leste).
   4. Feche a porta da caixa inicial assim que o rato entrar na arena e estiver a uma distância segura da porta. Se o rato não sair da caixa de partida, consulte as etapas 3.2.3 a 3.2.4.
   5. Deixe o rato procurar o primeiro pellet no poço de areia. Para recuperar com sucesso a recompensa alimentar, ele deve cavar no único poço de areia agora presente na arena.
   6. Assim que o rato recuperar o primeiro projétil, abra a porta da base (ou seja, Norte). O rato deve então localizar e entrar na base para comer sua recompensa. Se o rato começar a comer o pellet dentro da arena, guie-o suavemente de volta à base para comer o pellet.
      NOTA: Isso é crítico, pois cada rato deve ser incentivado a comer em casa; Sem treinamento adequado, eles tendem a retornar à caixa de partida do teste, de onde entraram na arena, para comer.
   7. Depois que o rato terminar o primeiro projétil na base, deixe-o sair da base e entrar novamente na arena para recuperar o segundo projétil.
   8. Ao recuperar o segundo pellet, deixe o rato localizar a base novamente para comer a recompensa alimentar. Assim que o rato entrar na base, feche a porta da caixa preta do Norte.
   9. Depois que o rato terminar de comer o segundo pellet na base, remova-o suavemente da base e devolva o rato à sua gaiola.
4. Sessões 3-7
   1. Repita a sessão de habituação 2 (etapas 3.3.1-3.3.9) cinco vezes, enterrando os pellets no poço de areia mais profundamente a cada sessão (Figura 5). No final da habituação, incentive todos os ratos a correr rapidamente para o poço de areia recompensado presente na arena, coletando sucessivamente os pellets de comida disponíveis e carregando-os de volta à base para comer.

Figura 5: O desenho das sessões de habituação. Da coluna da esquerda para a coluna da direita: a sessão de habituação (H1-H7); a caixa de partida usada para cada sessão (por exemplo, H1: caixa de partida sul (SB)); o local onde os ratos são obrigados a comer sua recompensa alimentar (ou seja, a base norte); a posição dos pellets acessíveis no poço de areia recompensado (na forma escrita e ilustrada; p = pelota), que será colocado no local designado de cada sessão; a posição dos pellets no poço de areia de base plana na gaiola única (na forma escrita e ilustrada), que visa promover o comportamento de escavação e fortalecer a associação dos ratos entre cavar em um poço de areia e receber uma recompensa alimentar. As duas últimas colunas referem-se a poços de areia nas gaiolas individuais (fora da arena). Abreviatura: N/A= não aplicável Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Protocolo de treinamento principal

NOTA: Cada sessão de treinamento principal consiste em duas tentativas de codificação de memória (E1, E2) seguidas, após um curto intervalo de tempo (~ 30 min), por uma tentativa de escolha de recordação (C1). Durante todos os testes, os ratos são obrigados a recuperar sucessivamente dois pellets do poço de areia recompensado. Depois de localizar cada pellet, os ratos devem localizar e entrar na base para comer essa recompensa alimentar. A localização do poço de areia correto (ou seja, recompensado) é contrabalançada entre as sessões para todos os ratos (Figura 5).

1. Medidas de contrapeso
   1. Contrabalanceie cuidadosamente a sequência dos locais dos poços de areia e a ordem da caixa inicial usada nas sessões (Figura 6). Antes de cada sessão, prepare o mapa de localização (Figura 6A); decida a localização correta do poço de areia para cada rato, que deve mudar notavelmente entre as sessões (Figura 6B); e criar o contrabalanço patrimonial (Figura 6B,C) e a folha de registro (figura suplementar 1).
   2. Produza três conjuntos de poços de areia, com cinco poços de areia por conjunto (Figura 6C). Cada conjunto requer cinco poços de areia porque cinco locais de poços de areia (um correto e quatro incorretos) são usados na arena durante cada teste de escolha de recall, e três conjuntos de poços de areia são necessários para que os poços de areia usados para cada teste possam ser alternados em cada sessão.
   3. Durante cada sessão, use um conjunto de poços de areia para os testes de codificação de um rato (Figura 6B, C; Codificação 1: Conjunto 1, Poço A; Codificação 2: Conjunto 1, Poço B) e outro conjunto de poços de areia diferente (Figura 6B, C; Escolha de recall: Conjunto 2, Poço C) para o teste de escolha de recall.
   4. Em cada sessão, use uma combinação diferente de conjuntos de poços de areia para cada rato (Figura 6B, C) e, entre as sessões, alterne as combinações de conjuntos de poços de areia usadas para cada rato.
2. Testes de codificação
   1. Coloque um poço de areia recompensado no local correto de acordo com o mapa de localização e o balanço patrimonial (Figura 7). Nunca use os locais de sinalização intra-arena, o bloco central ou os três blocos diretamente na frente das quatro caixas iniciais como um local de poço de areia.
   2. Colocar um projétil, seguido de um rato, na caixa de arranque (por exemplo, Leste) designada para codificar o ensaio 1 (E1); O pellet funcionará como uma sugestão para a tarefa. Dê tempo suficiente (~ 30 s) para o rato comer este pellet antes de iniciar o teste.
   3. Pressione o botão Iniciar na tela para gravar o teste no sistema interno de captura de vídeo.
      NOTA: É importante manter um registro dos ensaios de codificação dos ratos para (1) transparência da pesquisa (ou seja, evidência bruta do desempenho da tarefa de cada animal), (2) repontuação e (3) referência futura (ou seja, para explorar e coletar os dados para outras medidas de desempenho).
   4. Abra a porta da caixa de partida remotamente usando o software de computador personalizado (Figura 4B).
   5. Inicie o cronômetro no software de computador personalizado quando o rato entrar na arena e feche a porta da caixa de partida.
   6. Dê ao rato 200 s para procurar o poço de areia correto, cavar e recuperar seu primeiro pellet. Se o rato ainda não localizou o poço de areia correto ou seu primeiro pellet após 200 s, recupere um dos pellets abaixo da areia e coloque-o em cima. Se o rato não conseguir visitar o poço de areia correto e recuperar este pellet após mais 200 s, use uma escova para guiá-lo suavemente até o poço de areia correto.
   7. Uma vez que a recompensa alimentar tenha sido encontrada, o rato deve carregá-la para a base (por exemplo, caixa preta norte) e comê-la uma vez dentro. Se o rato não localizar e entrar na base, e optar por comer sua primeira bolinha dentro da arena, pegue rapidamente o rato da arena e coloque-o na base.
   8. Depois de comer seu primeiro pellet na base, deixe o rato entrar na arena pela base e localize seu segundo pellet no poço de areia correto.
   9. Depois de recuperar seu segundo pellet, deixe o rato localizar e entrar na base para comê-lo.
   10. Feche a porta da base quando o rato estiver em segurança dentro e dê-lhe tempo suficiente para comer o segundo pellet.
   11. Pare a gravação de captura de vídeo personalizada e o temporizador no software de computador personalizado. Pressione o botão Parar na tela no software de captura de vídeo personalizado. Em seguida, clique no botão Parar no cronômetro na tela do software de computador personalizado.
   12. Enquanto o rato está comendo, limpe o chão da arena com um pano embebido em solução de etanol a 70%. Faça isso entre cada tentativa.
   13. Prepare o poço de areia correto para o teste de codificação 2 (E2) e coloque-o no local correto dentro da arena do evento.
   14. Pegue o rato da base e coloque-o na caixa inicial (por exemplo, Oeste) designada para E2.
       NOTA: O uso de uma caixa de partida alternativa é fundamental para o incentivo efetivo dos ratos a usar apenas uma solução espacial alocêntrica para realizar a tarefa, pois os ratos não podem confiar em um ponto de vista estático da arena ou seguir seu caminho anterior para localizar com sucesso o poço de areia correto. Em vez disso, eles precisam atender às pistas intra e extra-arena, o que promove a codificação alocêntrica.
   15. Repita as etapas 4.3.2 a 4.3.12 e, em seguida, retorne o rato à sua gaiola de origem.
3. Julgamento de escolha de recall
   NOTA: O teste de escolha de recall de cada rato é executado 30-40 min após o segundo teste de codificação (E2) e apresenta aos ratos uma arena contendo cinco poços de areia.
   1. Coloque o poço de areia recompensado no local correto designado para a sessão, enquanto os quatro poços de areia não recompensados são colocados nos quatro locais incorretos alocados para a sessão e o rato em questão (Figura 8A). O mapa de localização do poço de areia para os cinco poços de areia no teste de escolha de recall é alterado para cada sessão e contrabalançado entre as sessões.
   2. Coloque o poço de areia contendo quatro pellets acessíveis no local correto. Coloque quatro poços de areia adicionais - cada um sem recompensa e sem pellets na seção acessível - nos locais incorretos definidos pelo mapa de localização do poço de areia da sessão.
   3. Coloque o chue chu e o rato na caixa inicial para o teste de escolha de recall (por exemplo, Sul). Certifique-se de que esse local inicial (por exemplo, C1: Oeste) seja diferente daqueles usados nas duas tentativas de codificação (por exemplo, E1: Leste, E2: Sul).
   4. Comece a gravar o teste usando o sistema interno de captura de vídeo.
      NOTA: É importante manter um registro dos ensaios de escolha de recall dos ratos para (1) transparência da pesquisa (ou seja, evidência bruta do desempenho da tarefa de cada animal, que pode ser enviada como parte do material suplementar de um artigo), (2) repontuação e (3) referência futura (ou seja, para explorar e coletar os dados para outras medidas de desempenho).
   5. No software de computador personalizado, selecione os temporizadores correspondentes aos poços de areia (temporizadores de poços de areia) a serem usados nesta sessão específica (Figura 4B).
   6. Depois que o rato tiver comido o chu Quando o rato sair da caixa de partida, feche a porta da caixa de partida e inicie o cronômetro no software de computador personalizado.
   7. Quando o rato cavar em um poço de areia, clique nos ícones do Sandwell na tela para registrar o tempo gasto cavando em cada poço de areia. Continue a registrar o tempo de escavação do rato em cada poço de areia visitado até o final do teste de escolha de recall.
   8. Permita que o rato localize e entre na base para comer essa recompensa alimentar.
   9. Utilizar o mesmo procedimento que o indicado para os ensaios de codificação (ver passo 4.2) para a recuperação do segundo sedimento do poço de areia correcto no ensaio de escolha de recall.
   10. Não clique e registre o tempo de escavação do rato em cada poço de areia visitado durante sua busca pelo segundo pellet. Registre apenas a ordem dos poços de areia (usando o número 1-5 alocado para cada local de poço de areia) visitados antes que o rato localize com sucesso o poço de areia recompensado e recupere seu segundo pellet. Isso requer concentração.

Figura 6: Contrapeso representativo. (A) Esquema ilustrando como o mapa de localização do poço de areia e a localização correta do poço de areia encontrados pelos ratos (por exemplo, Rato 1) mudam ao longo das sessões. (B) Exemplo de uma tabela de contrapeso para uma sessão (por exemplo, Sessão 1). Uma caixa de início diferente é usada para cada tentativa dentro de uma única sessão (ou seja, codificando a tentativa 1 (E1) iniciada a partir da caixa de partida Sul (SB)), mas sua ordem de uso foi a mesma para cada animal (por exemplo, Rato 1-3). Os poços de areia usados para o local correto (por exemplo, local 2, 4, 3) e seus conjuntos associados, usados na íntegra durante o teste de escolha de recall, foram contrabalançados entre os testes de cada sessão (por exemplo, codificação 1, codificação 2, escolha de recall) e os animais que executam a tarefa (por exemplo, Rato 1-3). (C) Tabela descrevendo os conjuntos de poços de areia contrabalançados dentro e entre as sessões. Existem 15 poços de areia no total e três conjuntos (conjunto 1-3) de poços de areia, cada um contendo cinco poços (A-E). Cada rato usa poços diferentes em cada tentativa de codificação e escolha de recall. Por exemplo, conforme mencionado na Figura 6B, o Rato 1 usará Sandwell 1A na tentativa de codificação 1, Sandwell 1B na tentativa de codificação 2 e Sandwell 2C na tentativa de escolha de recall. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Teste de sonda de recall

1. Use a mesma configuração para um teste de escolha de recall, exceto que não há pelotas acessíveis em nenhum dos cinco poços de areia, incluindo a localização correta do poço de areia previamente recompensada da sessão (Figura 8A, B).
   NOTA: Como no teste de escolha de recall, todos os cinco poços de areia estão disponíveis durante o teste de sonda e os ratos são livres para cavar qualquer poço de areia que escolherem; no entanto, nenhum dos poços de areia contém uma recompensa alimentar acessível - em vez disso, todos os 12 pellets estão presentes na seção inacessível de cada poço de areia (Figura 3C).
2. Coloque os cinco poços de areia que não contêm pellets acessíveis na arena nos locais fornecidos no mapa de poços de areia da sessão (Figura 8).
3. Coloque o rato na caixa de partida com uma bolinha de sugestão. Use a posição inicial não empregada em nenhuma das duas tentativas de codificação da mesma sessão.
4. Defina os temporizadores de poço de areia no software de computador personalizado para corresponder ao mapa de poço de areia da sessão (Figura 4B). Certifique-se de que os temporizadores de poços de areia definidos no software de computador personalizado correspondam corretamente ao mapa de poços de areia da sessão.
5. Comece a gravar o teste de sonda no sistema interno de captura de vídeo.
   NOTA: É importante manter um registro dos ensaios de sonda de recall de ratos para (1) transparência da pesquisa (ou seja, evidências brutas do desempenho da tarefa de cada animal, que podem ser enviadas como parte do material suplementar de um artigo), (2) repontuação e (3) referência futura (ou seja, para explorar e coletar os dados para outras medidas de desempenho).
6. Assim que o rato terminar o pellet, abra a porta da caixa de partida remotamente usando o software de computador personalizado (Figura 4B).
7. Assim que o rato entrar na arena e estiver a uma distância segura da porta, feche a porta da caixa de partida e inicie o cronômetro no software de computador personalizado.
8. Registre o tempo de escavação e a latência do rato para cada um dos poços de areia visitados durante o teste de sonda de 120 s, clicando em cada poço de areia visitado e segurando enquanto o rato continuar a cavar. Esta contagem regressiva de 120 s começa quando o rato cava o primeiro poço de areia.
9. Registre os tempos de escavação e latências em 60 s e 120 s fazendo uma captura de tela do software de computador personalizado na marca de tempo de 60 s e 120 s.
10. Após o teste de sonda de 120 s, coloque três pellets no poço de areia correto (ou seja, a localização do poço de areia recompensado no teste de codificação) para evitar o declínio da memória. O rato é obrigado a recuperar dois desses três pellets. Uma vez que um pellet é recuperado, o rato é obrigado a localizar e entrar na base para comê-lo.
11. Pressione o botão Stop na tela no software de computador personalizado após o teste de sonda de 120 s. Limpe o nome do arquivo e observe apenas a latência do rato para recuperar o primeiro e o segundo pellet colocados no local correto do poço de areia agora recompensado.
    NOTA: A escavação preferencial no local correto é usada como um índice de memória: boa memória para o evento cotidiano, experimentada nos testes de codificação (ou seja, encontrar a localização correta do poço de areia da sessão), é indicada por um tempo maior gasto cavando no local correto do que o tempo médio gasto cavando nos locais incorretos.
12. Agende um teste de sonda de recall no início do treinamento para verificar se o desempenho está no nível do acaso. Depois disso, agende testes de sonda em intervalos específicos (por exemplo, a cada sexta sessão) ou agende apenas quando os ratos atingirem um desempenho estável na tarefa: para justificar um teste de sonda, seu índice médio de desempenho (%) precisa ser de 60% ou mais por três sessões consecutivas. O índice de desempenho médio é definido na etapa 7.3.1.

6. Teste de controle sem codificação

NOTA: Um teste sem codificação é uma medida de controle usada para determinar se os ratos estão usando artefatos olfativos, em vez de sua memória da localização correta do poço de areia, para realizar a tarefa. Como o nome sugere, o 'teste de controle sem codificação' significa que não há testes de codificação realizados antes do teste de escolha de recall; apenas o estudo de escolha de recall é realizado. A expectativa é que, sem permissão para codificar a localização do evento de memória cotidiana, o desempenho dos ratos no teste de escolha seja no nível do acaso. Se este não for o caso, e os ratos tiverem um bom desempenho no teste de controle sem codificação, pode ser necessário um redesenho dos poços de areia e seus compartimentos acessíveis e inacessíveis.

1. Realize um teste de escolha de recall conforme descrito na seção 4.3 (etapas 4.3.1 a 4.3.10).

7. Medição de desempenho

NOTA: Vários parâmetros são medidos e a Figura Suplementar 1 mostra um exemplo de folha de dados.

1. Escolha de poços de areia
   NOTA: A escolha é definida como o número de poços de areia que os ratos cavam, até e incluindo o poço de areia correto, durante os testes de escolha de recall e sonda de recall. O valor máximo possível da escolha é 5, pois existem cinco poços de areia no total.
   1. Durante cada tentativa do experimento (teste de escolha de recall e teste de sonda de recall), determine o número de escolhas feitas por um rato: se ele coloca sua (s) pata (s) dianteira (s) em ou em um poço de areia. Se um rato passou correndo, ou apenas farejou rapidamente nas proximidades de um poço de areia, isso não é considerado uma escolha.
   2. Em casos raros, quando é difícil dizer pelos monitores de vídeo se os ratos fazem uma escolha (conforme definido acima), verifique no final do teste se há vestígios de escavação: ou seja, se a areia é deslocada ao redor do (s) poço (s) de areia. Se houver evidências de escavação, por menores que sejam, considere isso uma escolha. Parar em um poço de areia e não cavar é considerado apenas uma visita e não deve ser contado como uma escolha.
2. Erros
   NOTA: O erro é definido como o número de poços de areia incorretos (não recompensados) que os ratos visitam antes de localizar o poço de areia correto. A escolha é definida como o número de poços de areia que os ratos cavam, até e incluindo o poço de areia correto, durante os testes de escolha de recall e sonda de recall. O número máximo de erros é quatro, pois há cinco poços de areia no total.
   1. Calcule o erro usando a seguinte fórmula:
      Erro = (Escolha - 1)
   2. Quando um rato revisita o poço de areia incorreto, não conte isso como outro erro, pois o número máximo de erros é quatro devido ao fato de haver cinco poços de areia no total.
3. Índice de desempenho (PI)
   NOTA: O índice de desempenho é definido como o número de erros cometidos antes que os ratos localizem o poço de areia correto em um teste de escolha de recall. Com cinco poços de areia, podem ocorrer até quatro erros. O nível de chance entre cinco poços de areia é, portanto, de dois erros (ou seja, 50%).
   1. Calcule o índice de desempenho usando a seguinte fórmula:
      
   2. Quando um rato revisita o poço de areia incorreto, não conte isso como outro erro, pois o número máximo de erros é quatro devido ao fato de haver cinco poços de areia no total.
4. Latência
   NOTA: A latência é definida como o tempo decorrido antes do início da escavação no(s) poço(s) de areia correto(s).
   1. Meça a latência desde o momento em que o rato sai da caixa de partida até chegar ao poço de areia correto. Monitore e registre a latência usando o software de computador personalizado.
5. Tempo de escavação
   1. Meça o tempo de escavação dos ratos em cada poço de areia (poços de areia corretos e incorretos) no teste de sonda de recall.
      NOTA: Uma boa memória para o evento cotidiano é definida pela escavação dos ratos no poço de areia correto (n = 1) por uma proporção maior do teste de sonda de 120 s do que o tempo médio que eles gastam cavando nos poços de areia incorretos (n = 4).
   2. Calcule o correto e o incorreto usando as seguintes fórmulas:
      
      

8. Evitar vieses não intencionais

NOTA: As seguintes medidas de controle são implementadas em todo o protocolo para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade dessa tarefa diária de memória.

1. Contrabalanceie os locais dos poços de areia entre as sessões. Isso evita obter qualquer viés de recompensa para um lado específico da arena do evento.
2. Contrabalanceie os conjuntos de poços de areia, bem como os poços de areia dentro desses conjuntos usados na posição correta, entre as sessões e os ratos dentro de cada sessão. Isso desencoraja os ratos de tentar seguir qualquer teste de odor residual remanescente dos testes do(s) rato(s) anterior(es).
3. Limpe o chão da arena do evento entre cada prova com um pano embebido em solução de etanol a 70%; Isso impedirá que o caminho de um (s) RAT(s) anterior influencie o desempenho da tarefa subsequente.

Resultados

Este protocolo de base doméstica estável tem sido usado para treinar ratos com sucesso para aprender essa tarefa diária de memória usando representações alocêntricas. Existem dois elementos importantes neste protocolo. Primeiro, os animais partem de diferentes caixas pretas (por exemplo, Leste, Sul e Oeste) dentro e entre as sessões (Figura 7A). Existem dois ensaios de codificação e um ensaio de escolha de recall por sessão (ou teste de sondagem e...

Discussão

Os humanos codificam automaticamente eventos únicos na vida cotidiana. Lembramos prontamente de alguns eventos e esquecemos outros. O protocolo de memória cotidiana episódica descrito acima fornece um método robusto para pesquisadores que desejam investigar esse tipo de memória (memória episódica) em roedores. Como a tarefa envolve o ato diário de encontrar e recuperar pellets de comida de um local definido, o instinto natural dos roedores de procurar comida é explorado. A taref...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	CCTVFirst	N/A
Event Arena	University of Edinburgh (designed and built in house)	University of Edinburgh (designed and built in house)	Event arena for everyday memory task
Lister-hooded rats	Charles River UK	603
Multitimer Labview	University of Edinburgh (designed and built in house)	University of Edinburgh (designed and built in house)
Pneumatics, frames, screws of event arena	RS Components Ltd.	University of Edinburgh (P. Spooner)	Tools for building event arena
Sandwells	Adam Plastics (http://www.adamplastics.co.uk)	University of Edinburgh (P. Spooner)	Sandwells for arena
Startboxes	Adam Plastics (http://www.adamplastics.co.uk)	University of Edinburgh (P. Spooner)
Video recording	Windows 10 computers with OBS software, Blackmagic Decklink Mini Recorder cards	N/A