CIRCLE-Seq para interrogatório de edição de genes fora do alvo

Resumo

Uma barreira significativa para tecnologias como o CRISPR são os eventos fora do alvo que podem interromper genes vitais. 'Circularização para relatórios in vitro de efeitos de clivagem por sequenciamento' (CIRCLE-seq) é uma técnica projetada para identificar locais de clivagem não intencionais. Este método mapeia a atividade de todo o genoma do CRISPR-Cas9 com alta sensibilidade e sem viés.

Resumo

Circularização para Relato In Vitro de Efeitos de Clivagem por Sequenciamento (CIRCLE-seq) é uma nova técnica desenvolvida para a identificação imparcial de locais de clivagem não intencionais de CRISPR-Cas9 por meio de sequenciamento direcionado de DNA clivado de CRISPR-Cas9. O protocolo envolve a circularização do DNA genômico (gDNA), que é posteriormente tratado com a proteína Cas9 e um RNA guia (gRNA) de interesse. Após o tratamento, o DNA clivado é purificado e preparado como uma biblioteca para o sequenciamento Illumina. O processo de sequenciamento gera leituras de extremidade emparelhada, oferecendo dados abrangentes sobre cada local de clivagem. O CIRCLE-seq oferece várias vantagens sobre outros métodos in vitro , incluindo requisitos mínimos de profundidade de sequenciamento, baixo fundo e alto enriquecimento para gDNA clivado por Cas9. Essas vantagens aumentam a sensibilidade na identificação de eventos de clivagem intencionais e não intencionais. Este estudo fornece um procedimento abrangente e passo a passo para examinar a atividade fora do alvo do CRISPR-Cas9 usando o CIRCLE-seq. Por exemplo, este protocolo é validado pelo mapeamento de locais de clivagem não intencionais em todo o genoma de CRISPR-Cas9 durante a modificação do locus AAVS1 . Todo o processo CIRCLE-seq pode ser concluído em duas semanas, permitindo tempo suficiente para o crescimento celular, purificação do DNA, preparação da biblioteca e sequenciamento Illumina. A entrada de dados de sequenciamento no pipeline CIRCLE-seq facilita a interpretação e análise simplificadas dos locais de clivagem.

Introdução

A engenharia do genoma teve avanços significativos nos últimos vinte anos, com um marco importante sendo a descoberta de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR)-Cas9 em 2012¹. Aproveitando a natureza programável das endonucleases de DNA bacteriano, a tecnologia CRISPR-Cas9 permite o direcionamento e a modificação precisos de quase todas as sequências de DNA. Desde a sua criação, o sistema foi otimizado para contar apenas com a endonuclease Cas9 e um RNA guia (gRNA) para editar regiões genômicas específicas. O potencial do CRISPR-Cas9 como terapia curativa foi demonstrado em ensaios clínicos para várias condições, como amaurose congênita de Leber, amiloidose por transtirretina e anemia falciforme, entre outras ^2,3,4.

O CRISPR-Cas9 induz quebras de fita dupla (DSBs), que normalmente são resolvidas por um dos dois mecanismos: a junção de extremidade não homóloga propensa a erros (NHEJ) ou o reparo direcionado por homologia mais preciso (HDR), desde que um DNA modelo esteja disponível. A tendência do CRISPR-Cas9 de causar inserções e deleções associadas ao NHEJ (indels), juntamente com clivagem em locais genômicos não intencionais, limita sua aplicação em ambientes clínicos 5,6,7,8,9,10. Além disso, modificações genômicas não intencionais podem criar locais de emenda crípticos, mutações sem sentido ou sem sentido, induzir cromotripse ou conferir potencial oncogênico às células - resultados que foram observados em vários ensaios de edição de genoma^{11 , 12 , 13 , 14 , 15}. Em conclusão, identificar com precisão a atividade fora do alvo do CRISPR-Cas9 é crucial para suas aplicações clínicas, particularmente em terapias genéticas sistêmicas que podem alterar bilhões de células.

Vários métodos podem ser empregados para identificar locais de clivagem fora do alvo CRISPR-Cas9, incluindo a Identificação Imparcial de Quebras de Fita Dupla em Todo o Genoma (GUIDE)-seq¹⁶, que usa oligodesoxinucleotídeos de fita dupla para marcar DSBs em células vivas. No entanto, uma crítica a esse método é que falsos positivos podem surgir de DSBs aleatórios ou de artefatos de PCR, que devem ser descartados excluindo locais capturados que apresentam baixa semelhança com os locais no alvo. O método baseado no uso de Integrase-Defective Lentiviral Vector (IDLV) é menos sensível e propenso a perder muitos locais fora do alvo¹⁷. Outros métodos in situ como DSBCapture, BLESS e BLISS 18,19,20 envolvem células fixas e rotulam DSBs diretamente, no entanto, são limitados por sua dependência da captura imediata de DSB e pela ausência de DNA exógeno. Digenome-seq²¹, um método in vitro, e Enriquecimento seletivo e identificação de extremidades de DNA genômico marcadas por sequenciamento (SITE-seq) ²² fornecem soluções de sequenciamento, mas têm suas limitações em ruído de fundo e análise de extremidade única, respectivamente. A descoberta de Cas in situ fora dos alvos e a verificação por sequenciamento (Discover-Seq)²³ oferecem identificação in vivo e in situ da atividade de Cas9 por meio da ligação MRE11, mas detecta apenas DSBs que existem no momento da preparação da amostra²⁴. Por fim, a Inferência de Edições CRISPR (ICE) usa uma abordagem de bioinformática para analisar de forma robusta as edições CRISPR usando dados Sanger²⁵.

Este artigo descreve um procedimento detalhado para Circularização para Relato In Vitro de Efeitos de Clivagem por Sequenciamento (CIRCLE-seq): uma técnica in vitro que mapeia de forma sensível e imparcial a atividade fora do alvo em todo o genoma da nuclease Cas9 em um complexo com o gRNA de interesse²⁶. Essa abordagem começa com a cultura das células de interesse e o isolamento do DNA, seguido de cisalhamento aleatório por ultrassom focalizado e, em seguida, tratamento com exonuclease e ligase. Em última análise, esse processo produz moléculas circulares de DNA de fita dupla, que são então purificadas por meio de tratamento DNase seguro para plasmídeos. Este DNA circular é então exposto ao complexo Cas9-gRNA, que cliva os locais de clivagem pretendidos e não intencionais, deixando para trás as extremidades expostas do DNA que atuam como substratos para a ligação do adaptador Illumina. Esse processo produz uma biblioteca diversificada de DNA genômico (gDNA) contendo ambas as extremidades de cada DSB induzido por nuclease, garantindo que cada leitura tenha todas as informações necessárias para cada local de clivagem. Isso permite o uso do sequenciamento Illumina com requisitos de cobertura de sequenciamento mais baixos, diferenciando o CIRCLE-seq de outros métodos semelhantes mencionados acima. É importante observar que, embora o CIRCLE-seq tenha maior sensibilidade fora do alvo do que outros protocolos como método in vitro , isso tem o custo de falsos positivos mais altos devido à ausência da paisagem epigenética presente em outros métodos, como o GUIDE-seq¹⁶. Além disso, o reparo do DNA DSB e seu maquinário associado não estão presentes no CIRCLE-seq, revogando indels ou reparos adequados que seriam observados de outra forma.

Além de descrever o protocolo passo a passo para realizar o CIRCLE-seq, o protocolo é validado pela identificação de locais de clivagem não intencionais em todo o genoma de CRISPR-Cas9 que ocorrem durante a modificação do locus AAVS1 , por exemplo. Este protocolo fácil de seguir fornece instruções detalhadas, desde a cultura de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e isolamento de gDNA até circularização de gDNA, clivagem de Cas9-gRNA, preparação de biblioteca, sequenciamento e análise de pipeline. Dados os baixos requisitos de cobertura de sequenciamento, o CIRCLE-seq está disponível para qualquer laboratório com acesso ao sequenciamento de última geração.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes, consumíveis e equipamentos usados para este estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Cultura celular (5 dias)

1. Inclua um controle negativo em todo este protocolo. Prepare células suficientes para 25 μg adicionais de gDNA (~ 2,0e⁷ células por amostra).
2. Cultura de iPSCs de acordo com o protocolo estabelecido²⁷. Colete as células e ressuspenda-as em 10 mL de PBS. Pipetar uma amostra de 6 μL de células e ressuspender na proporção de 1:1 com azul de tripano. Use o contador de células automatizado para contar a amostra.
3. Alíquota 2 x 10⁷ células por tubo e, em seguida, girar para baixo a 300 x g durante 3 min a 25 °C [temperatura ambiente (RT)]. Isso é suficiente para várias réplicas. Pipetar e rejeitar o sobrenadante.

2. Isolamento de DNA genômico (1 dia)

1. Use o kit de purificação de DNA disponível comercialmente para isolar o gDNA, seguindo as instruções do fabricante:
   1. Adicione 200 μL de PBS a um tubo cônico de 15 mL contendo o pellet celular e ressuspenda. Em seguida, pipete 3 mL de tampão de lise celular e 15 μL de proteinase K no tubo. Inverta o tubo 25 vezes para misturar bem. Coloque o tubo em um agitador em banho-maria regulado para 55 °C e 150 rpm por 3 h ou durante a noite para obter o rendimento ideal do DNA.
   2. Pipetar em 15 μL de RNase A. Inverter 25 vezes. Colocar em banho-maria a 37 °C durante 1 h.
   3. Refrigere a amostra no gelo por 5 min. Em seguida, adicione 1 mL de solução de precipitação de proteínas, vórtice em alta velocidade por 20 s e centrifugue a 2000 x g por 10 min em RT. As proteínas devem formar um pellet visível e compacto no fundo do tubo. Se o pellet não estiver visível, incube a amostra no gelo por mais 5 min e centrifugue novamente.
   4. Adicione 3 mL de isopropanol a 100% a um novo tubo cônico de 15 mL. Pipetar cuidadosamente o sobrenadante do passo 2.1.3 para o tubo. Inverter o tubo 50 vezes para misturar e, em seguida, centrifugue a 2000 x g e temperatura ambiente por 3 min. Sem perturbar o pellet de DNA, aspire cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta Pasteur conectada a uma armadilha de vácuo e inverta o tubo em um pano limpo e sem fiapos.
   5. Pipete 3 mL de etanol a 70% (v/v) no pellet de DNA e inverta 10 vezes para lavar. Centrifugue a 2.000 x g por 3 min em RT. Em seguida, despeje cuidadosamente o sobrenadante.
   6. Mantenha o tubo aberto e deixe o pellet de DNA resultante secar por 30 min, garantindo que todo o etanol tenha evaporado totalmente. Pipetar 50 μL de solução de hidratação de ADN e homogeneizar com pipetagem suave.
   7. Dissolver o ADN colocando a amostra num agitador em banho-maria a 65 °C durante 1 h e, em seguida, deixar a amostra em RT durante a noite. Centrifugue a amostra em RT e 2.000 x g por 1 min e use o kit de ensaio dsDNA BR com tubos associados para quantificar o DNA isolado com o fluorômetro.

3. Preparação de gRNA (7 dias)

1. Encomende o gRNA sintético de interesse de uma fonte comercial (consulte a Tabela de Materiais). Este protocolo também é compatível com crRNA/tracrRNA.

4. Teste de clivagem in vitro de gRNA

NOTA: Aqui, um alvo no gene AAVS1 é usado. Para atingir outros genes de interesse, projete primers (Tabela 1) para amplificar a região alvo e substitua os primers nas etapas a seguir por primers personalizados.

1. Prepare a reação de PCR: Misture 25 μL de Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix (Concentração Final 1x), 0,5 μL de AAVS1 F Primer (Concentração final 0,1 μM), 0,5 μL de AAVS1 R Primer (Concentração final 0,1 μM), 5 μL de gDNA (100 ng, 20 ng/μL, da etapa 2.1.6) e 19 μL de H₂O livre de nuclease (Volume total: 50 μL).
2. Use os seguintes parâmetros do termociclador: Desnaturação: 98 °C por 2 min (1 ciclo), Desnaturação: 98 °C por 10 s (10 ciclos), Recozimento: 72-62 °C (-1 °C/ciclo) por 15 s (10 ciclos), Extensão: 72 °C por 30 s (10 ciclos), Desnaturação, 98 °C por 10 s (30 ciclos). Recozimento: 65 °C por 15 s (30 ciclos), Extensão: 72 °C por 30 s (30 ciclos), Extensão final: 72 °C por 5 min (1 ciclo), Hold: 4 °C indefinidamente.
3. Use grânulos AMPure XP para purificar o produto da reação de PCR. Primeiro, pipete em volumes de 1,8x, ou 90 μL, de grânulos XP para o produto de PCR. Pipete dez vezes para misturar bem. Deixe a mistura em RT por 5 min para incubar.
4. Usando um rack magnético, separe as esferas da solução colocando a placa de reação de PCR no ímã por 3 min. Pipetar a solução limpa e eliminar. Adicione 200 μL de etanol a 80% (v / v) aos grânulos, incube por 30 s e remova o etanol. Repita esta etapa de lavagem duas vezes para garantir a remoção completa do etanol.
5. Deixe as amostras secarem naturalmente por 3 min, colocando a placa no ímã. Remova a placa do ímã e adicione 40 μL de tampão TE, pH 8,0. Misture pipetando para cima e para baixo dez vezes. Deixar a amostra repousar em RT durante 2 min.
6. Coloque a placa de reação de PCR no ímã por mais um minuto. Após 1 min, transferir o sobrenadante para uma nova placa. Meça o rendimento de PCR purificado usando um espectrofotômetro e analise-o em um TapeStation usando uma tira de tubo óptico com uma tampa de tira de tubo óptico, juntamente com os reagentes D1000 ScreenTape de alta sensibilidade e D1000 de alta sensibilidade (escada e tampão), seguindo as instruções do fabricante. Conservar a amostra preparada a -20 °C durante vários meses.
7. Dilua a proteína nuclease Cas9 a 1 μM da seguinte forma: Misture 2 μL de tampão Cas9 10x (concentração final 1x), 1 μL de nuclease Cas9, S. pyogenes (concentração final 1 μM) e 17 μL de H₂O livre de nuclease em um volume total de 20 μL.
8. Execute um procedimento livre de RNase para evitar a degradação do gRNA. Diluir o gRNA (da etapa 3.1) a 3 μM em H₂O até um volume total de 10 μL.
   NOTA: Use a seguinte fórmula para estimar o peso molecular do gRNA: Peso molecular do ssRNA (g/mol) = (comprimento do ssRNA (nt) x 321,47 g/mol) + 18,02 g/mol. Para referência, um gRNA de 104 nt de comprimento a 3 μM é de aproximadamente 100 ng/μL.

5. Cisalhamento de DNA (3 h)

1. Prepare o ME220 direcionando primeiro o braço de controle. Em seguida, encha o reservatório com H₂O deionizado purificado. No laptop da estação de controle, acesse Water Works e clique em Preencher. Ajuste a temperatura para 4.5 °C.
2. Transfira 25 μg de gDNA para um microtubo (microtubo-130 AFA Fiber Screw-Cap). Em seguida, encha o tubo até um volume total de 130 μL com 1x TE. Use as seguintes condições para cisalhar o DNA para um comprimento médio de aprox. 300 bp: defina Duração para 10 s; Potência de pico para 70; Fator de serviço % a 20; Ciclos/Burst para 50; tudo isso definirá automaticamente a potência média para 14,0.

6. Purificação do DNA genômico cortado (1 h)

1. Divida o DNA genômico cisalhado em duas porções de 65 μL cada. Purifique usando 1,8 vezes o volume de grânulos XP (117 μL), seguindo o procedimento descrito nas etapas 4.3-4.6. Transferir o sobrenadante para uma nova placa de PCR e medir a quantidade utilizando um espectrofotómetro.
2. Execute 1 μL do gDNA cisalhado eluído em um TapeStation, de acordo com as instruções do fabricante, para garantir que o gDNA seja cortado para uma ampla distribuição de aprox. 300 pb. Se necessário, armazene o gDNA cisalhado a -20 °C por vários meses.

7. Preparação da biblioteca CIRCLE-seq (3 dias)

1. Recozimento do adaptador Hairpin
   1. Ressuspenda oSQT1288 (Tabela 1), o adaptador de gancho de cabelo, a uma concentração final de 100 μM em 1x TE.
   2. Execute o recozimento do adaptador da seguinte forma: misture 40 μL de oSQT1288 (concentração final de 40 μM), 10 μL de 10x STE (concentração final 1x) e 50 μL de H₂O livre de nuclease para um volume total de 100 μL.
   3. Use os seguintes parâmetros de recozimento: 95 °C por 5 min, -1 °C por min por 70 ciclos, mantenha a 4 °C indefinidamente.
2. Execute o reparo final . Empregue o kit de preparação da biblioteca HTP sem PCR e prepare o Master Mix de reparo final.
   1. Misture 8 μL de H₂O livre de nuclease, 7 μL de tampão de reparo final 10x (concentração final 1x) e 5 μL de mistura de enzimas de reparo final (volume final de 20 μL de Master Mix de reparo final total).
   2. Pipetar 20 μL da mistura principal de reparação final para a amostra de gDNA cortada dos passos 4.3-4.6. Misture 20 μL de End-Repair Master Mix com 50 μL de gDNA cisalhado para um volume final de 70 μL.
   3. Coloque a mistura em um termociclador a 20 °C por 30 min e mantenha a 4 °C indefinidamente.
   4. Adicione volumes de 1,7x, ou 120 μL, de grânulos XP e siga as etapas de purificação das etapas 4.3-4.6. Eluir com 42 μL de TE, pH 8,0. Certifique-se de que as contas permaneçam em solução para a próxima etapa.
3. Execute A-tailing. Usando o kit de preparação de biblioteca HTP (sem PCR), prepare o A-tailing Master Mix.
   1. Misture 5 μL de tampão de cauda A 10x (Concentração Final 1x) e 3 μL de enzima de cauda A (volume final total de 8 μL de Master Mix de cauda A).
   2. Pipete 8 μL do A-tailing Master Mix em cada amostra de DNA contendo grânulos da etapa 7.2.4, misturando 8 μL de A-tailing Master Mix para 42 μL de grânulos contendo DNA reparado final (volume final total de 50 μL). Colocar num termociclador a 30 °C durante 30 min. Manter a 4 °C indefinidamente.
   3. Pipete 1,8 volumes, ou 90 μL, de solução de SPRI de PEG / NaCl (um componente do Kit de Preparação da Biblioteca HTP (sem PCR; 96 reações)) para o DNA de cauda A. Purifique o DNA de cauda A de acordo com as etapas 4.3-4.6. Eluir o DNA de cauda A em 30 μL de TE, pH 8,0. Mantenha as contas em solução para a próxima etapa.
4. Execute a ligação do adaptador. Usando o kit de preparação de biblioteca HTP (sem PCR), prepare o Master Mix de ligação do adaptador.
   1. Misture 10 μL de tampão de ligação 5x (concentração final 1x), 5 μL de DNA ligase e 5 μL de adaptador de grampo de cabelo recozido (40 μM) da etapa 7.1.3. Garanta a concentração final de 4 μM para um Master Mix de ligação do adaptador total de 20 μL.
   2. Pipetar 20 μL de Adapter Ligation Master Mix em cada amostra de ADN eluída contendo esferas do passo 7.3.3 (volume final total de 50 μL por amostra).
   3. Colocar num termociclador a 20 °C durante 1 h. Manter a 4 °C indefinidamente.
   4. Transfira 1x volumes, ou 50 μL, de solução de SPRI de PEG / NaCl para o DNA ligado ao adaptador e purifique de acordo com as etapas 4.3-4.6. Eluir com 30 μL de TE, pH 8,0, e decantar os sobrenadantes para uma nova placa de PCR semi-contornada. Combine e quantifique o DNA usando o ensaio dsDNA BR. Se necessário, armazene o DNA purificado ligado ao adaptador por até 1 mês a -20 °C.
5. Prepare o Master Mix de Exonuclease Lambda / Exonuclease I (E. coli) (funções na eliminação de DNA de fita simples ou dupla sem adaptadores ligados a ambas as extremidades).
   1. Pegue 1 μg de DNA ligado ao adaptador da etapa 7.4.4, diluindo-o para 40 μL. Misture 5 μL de tampão de reação 10x Exonuclease I (Concentração Final 1x), 4 μL de Exonuclease Lambda (Concentração Final 0,4 U/μL) e 1 μL de Exonuclease I (E. coli) (Concentração Final 0,4 U/μL) para um volume total de Lambda Exonuclease/Exonuclease I Master Mix de 10 μL.
   2. Pipetar 10 μL da Lambda Exonuclease / Exonuclease I Master Mix para 40 μL (1 μg) de DNA ligado ao adaptador (volume total de 50 μL). Coloque em um termociclador a 37 °C por 1 h e depois a 75 °C por 10 min. Manter a 4 °C indefinidamente.
   3. Pipete 1,8x volumes, ou 90 μL, de grânulos XP para o DNA tratado com Exonuclease Lambda / Exonuclease I. Purifique de acordo com as instruções fornecidas nas etapas 4.3-4.6. Eluir em 40 μL de TE, pH 8,0. Certifique-se de que as esferas permaneçam em solução para a próxima etapa enzimática.
6. Trate com enzima USER e T4 Polynucleotide Kinase (PNK). Prepare o USER/T4 PNK Master Mix (necessário para liberar as saliências de 4 pb e preparar as extremidades de DNA prontas para ligação necessárias para a reação de ligação subsequente).
   1. Misture 5 μL de tampão DNA ligase T4 10x (concentração final 1x), 3 μL de enzima USER (concentração final 0,05 U/μL) e 2 μL de T4 PNK (concentração final 0,4 U/μL), para um volume total da mistura master USER/PNK de 10 μL.
   2. Pipete 10 μL da enzima USER / T4 PNK Master Mix para 40 μL de amostra de DNA tratada com lambda e exonuclease I contendo grânulos da etapa 7.5.3 para um volume total de 50 μL. Colocar num termociclador a 37 °C durante 1 h. Manter a 4 °C indefinidamente.
   3. Pipetar 1,8x volumes, ou 90 μL, de solução de SPRI de PEG/NaCl para o DNA tratado com PNK USER/T4 e purificar de acordo com as etapas 4.3-4.6. Eluir em 35 μL de TE, pH 8,0. Transvase o sobrenadante para uma nova placa de PCR semi-contornada. Combine e quantifique o DNA usando o ensaio dsDNA HS.
7. Realize a circularização intramolecular. Prepare o Master Mix de Circularização.
   1. Misture 8 μL de H₂O livre de nuclease, 10 μL de tampão 10x T4 DNA ligase (Concentração Final 1x) e 2 μL de T4 DNA ligase (Concentração Final 8 U/μL), para um volume total do Master Mix de Circularização de 20 μL.
   2. Pipetar 20 μL do Master Mix de Circularização para 500 ng de DNA tratado com USER/PNK da etapa 7.6.3. Diluir 500 ng de DNA tratado com USER/PNK em 80 μL e, em seguida, adicionar 20 μL do Master Mix de Circularização (volume total de 100 μL). Incubar num termociclador a 16 °C durante 16 h (durante a noite).
   3. Adicione 1x volumes, ou 100 μL, de grânulos XP ao DNA circularizado e purifique de acordo com as etapas 4.3-4.6. Eluir em 38 μL de TE, pH 8,0. Transvase o sobrenadante para uma nova placa de PCR semi-contornada.
8. Trate com DNase dependente de ATP seguro para plasmídeo. Preparar a mistura mestra de DNase dependente de ATP segura para plasmídeos (necessária para a degradação do ADN linear residual).
   1. Misture 5 μL de tampão de reação seguro para plasmídeo 10x (concentração final 1x), 2 μL de ATP (concentração final 1 mM) e 5 μL de DNase dependente de ATP seguro para plasmídeo (concentração final 1 U/μL), para um volume total do Master Mix seguro para plasmídeo de 12 μL.
   2. Pipete 12 μL do DNase Master Mix dependente de ATP para 38 μL de DNA circularizado da etapa 7.7.3 (volume total de 50 μL). Incubar num termociclador a 37 °C durante 1 h e depois a 70 °C durante 30 min. Manter a 4 °C indefinidamente.
   3. Pipete 1x volumes, ou 50 μL, de grânulos XP no DNA tratado com DNase dependente de ATP seguro para plasmídeo e purifique de acordo com as etapas 4.3-4.6. Eluir em 15 μL de TE, pH 8,0. Transvase o sobrenadante para uma nova placa de PCR semi-contornada.
   4. Combine o DNA e quantifique usando o ensaio dsDNA HS. Se necessário, armazene o DNA circularizado a -20 °C por vários meses.

8. GDNA circularizado purificado enzimaticamente in vitro (2 h)

1. Realize clivagem in vitro com o complexo Cas9:gRNA. Prepare o Master Mix de clivagem in vitro . Misture 5 μL de tampão Cas9 10x (concentração final 1x), 4,5 μL de S. Pyogenes Cas9 (concentração final 90 nM) e 1,5 μL de gRNA (concentração final 90 nM) para um volume total de clivagem Master Mix de 11 μL.
2. Mantenha a mistura master de clivagem em RT por 10 min para formar complexos Cas9:gRNA RNP.
3. Diluir 125 ng de DNA tratado com DNase segura para plasmídeo da etapa 7.8.3 até um volume final de 39 μL. Em seguida, adicione 11 μL do Cleavage Master Mix a 39 μL de DNA tratado com DNase segura para plasmídeo para um volume total de 50 μL.
   NOTA: Inclua uma amostra de controle negativo nesta etapa, que compreende DNA circularizado misturado com tampão Cas9, sem o complexo Cas9: gRNA.
4. Incubar num termociclador durante 1 h a 37 °C. Manter a 4 °C indefinidamente. Adicione 50 μL (1x volume) de grânulos XP ao DNA clivado in vitro e purifique o DNA seguindo as etapas 4.3-4.6. Eluir em 42 μL de tampão TE, pH 8,0. Certifique-se de que as contas permaneçam em solução para a próxima etapa.

9. Preparação da biblioteca de sequenciamento de próxima geração (4 - 6 h)

1. Execute A-tailing. Prepare o A-tailing Master Mix.
   1. Misture 5 μL de tampão de cauda A 10x (concentração final 1x) e 3 μL de enzima de cauda A (o volume total da mistura mestre de cauda A é de 8 μL).
   2. Pipetar 8 μL do Master Mix de cauda A para 42 μL de amostra de DNA eluído contendo grânulos da etapa 8.4 (volume total de 50 μL). Colocar num termociclador durante 30 min a 30 °C. Manter a 4 °C indefinidamente.
   3. Pipete 1,8x volumes de solução de SPRI de PEG/NaCl, ou 90 μL, para o DNA de cauda A e purifique o DNA de acordo com as etapas 4.3-4.6. Eluir em 25 μL de TE, pH 8,0. Certifique-se de manter as contas em solução para a etapa seguinte.
2. Execute a ligação do adaptador. Prepare o Master Mix de ligação do adaptador.
   NOTA: Alíquotas de uso único de adaptadores NEB devem ser preparadas para evitar a formação de dímeros de adaptador causados pela hidrólise induzida por congelamento e descongelamento do 3' T'.
   1. Misture 10 μL de tampão de ligação 5x (concentração final 1x), 5 μL de DNA ligase e 10 μL de adaptador para sequenciamento (a concentração final é de 3 μM), para um total de 25 μL.
   2. Pipetar 25 μL do Adapter Ligation Master Mix para 25 μL de amostra de ADN com cauda em A contendo esferas do passo 9.1.3. Colocar num termociclador durante 1 h a 20 °C. Manter a 4 °C indefinidamente.
   3. Pipetar 1x volumes, ou 50 μL, de solução de SPRI de PEG/NaCl para o ADN ligado ao adaptador e purificar o ADN de acordo com os passos 4.3-4.6. Eluir em 47 μL de TE, pH 8,0. Certifique-se de que as esferas permaneçam em solução para a próxima etapa enzimática.
3. Realize o tratamento com enzima USER (gera uma lacuna de nucleotídeo único nos resíduos de uracila).
   1. Adicione 3 μL de enzima USER (incluída no Kit de Primers de Índice Duplo) à amostra de DNA ligada ao adaptador contendo grânulos da etapa 9.2.3. Incubar a 37 °C durante 15 min.
   2. Adicione 35 μL (0,7x o volume) de solução de SPRI de PEG/NaCl ao DNA tratado com enzimas do USUÁRIO e purifique de acordo com as etapas 4.3-4.6. Eluir em 20 μL de tampão TE, pH 8,0. Transferir o sobrenadante para uma nova placa de PCR semi-contornada e medir a concentração de ADN utilizando o ensaio dsDNA HS. A concentração esperada deve ser de aprox. 2-5 ng/μL.
4. (Opcional) Antes de prosseguir para a próxima etapa, a seleção do tamanho do DNA pode ser realizada usando PippinHT. Use o PippinHT de 1,5% com uma faixa de tamanho de 250-850 bp. As amostras resultantes podem ser utilizadas diretamente na PCR na próxima etapa.
5. Realize PCR para adição de código de barras
   NOTA: Certifique-se de que as combinações de sequência de primer escolhidas para cada amostra sejam exclusivas. Se possível, cada amostra deve ter códigos de barras i5 e i7 exclusivos.
   1. Prepare o PCR Master Mix para adicionar códigos de barras de índice emparelhado. Misture 5 μL de H₂O livre de nuclease, 25 μL de 2x HotStart Ready Mix (concentração final 1x), 5 μL de primer i5 (concentração final de 1 μM) e 5 μL de primer i7 (concentração final de 1 μM) (volume total da master mix de 40 μL).
   2. Pipetar 40 μL do PCR Master Mix para 10 μL de ADN purificado tratado com a enzima USER (aprox. 20 ng) do passo 9.3.2 (volume total de 50 μL).
   3. Escolha as seguintes condições de termociclagem de PCR: Desnaturação: 98 °C por 45 s por 1 ciclo, Desnaturação: 98 °C por 15 s por 20 ciclos, Recozimento: 65 °C por 30 s por 20 ciclos, Extensão: 72 °C por 30 s por 20 ciclos, Extensão final: 72 °C por 1 min por 1 ciclo, Hold: 4 °C indefinidamente.
   4. Adicione 0,7x volumes, ou 35 μL, de grânulos XP ao produto PCR e purifique de acordo com as etapas 4.3-4.6. Eluir em 30 μL de TE, pH 8,0. Transvase o sobrenadante para uma nova placa de PCR semi-contornada. Se necessário, armazene o DNA circularizado a -20 ° C por vários meses.
      NOTA: Execute uma amostra do PCR no Tapestation para controlar a qualidade da biblioteca e avaliar a formação de dímeros adaptadores. Se forem detectados dímeros adaptadores, repita a etapa 9.5.4.

10. Quantificação de bibliotecas CIRCLE-seq por PCR digital de gotículas (dd_PCR) (6 h)

NOTA: A quantificação também pode ser realizada usando qPCR, Tapestation ou um método semelhante.

1. Comece com 5 μL de DNA da biblioteca (etapa de PCR 9.5.4) bem misturado com 45 μL de TE livre de nuclease e, em seguida, faça diluições seriais 1:10 de cada amostra em volumes de 50 μL, variando de ^10-1 a ^10-8 diluição.
   1. Configure a solução de estoque dd_PCR Master Mix. Misture 11 μL de mistura de 2x dd_PCR para sondas (Concentração Final 1x), 0,055 μL de Sonda oSQT1310 (Concentração Final 250 nM), 0,055 μL de Sonda oSQT1311 (Concentração Final 250 nM), 0,099 μL de Primer oSQT1274 (Concentração Final 450 nM), 0,099 μL de Primer oSQT1275 (Concentração Final 450 nM) e 6,292 μL de H₂O livre de nuclease, para um volume total dd_PCR Master Mix de 17,6 μL. Prepare uma mistura principal para todas as amostras para garantir que os volumes sejam suficientes para uma pipetagem precisa.
   2. Analise as três diluições mais baixas (10-6,10-7 e ^10-8) em duplicata (em uma placa de 96 poços). Um controle não modelo (NTC) deve ser usado.
   3. Pipete 17,6 μL de dd_PCR Master Mix para cada amostra da seguinte forma: Misture 17,6 μL com 4,4 μL da amostra (adicionando H₂O livre de nuclease ao poço com NTC), para um volume total de 22 μL. Feche a placa e centrifugue a 2000 x g por 1 min em RT.
2. Realize geração, termociclagem e análise de gotículas. Usando um sistema de PCR Droplet Reader, transfira um cartucho DG8 (8 poços) para o suporte do cartucho. Na linha de óleo do cartucho, dispense 70 μL de óleo de geração de gotículas para sondas.
   NOTA: Pegue 20 μL da amostra da etapa 10.1.2. e adicione-o à linha de amostra do cartucho de 8 poços, cobrindo o cartucho com a junta de borracha DG8, colocando-o no gerador de gotículas e, em seguida, fechando-o para iniciar o processo (automático). Quando terminar, remova o cartucho e mova 40 μL da fileira de gotículas do cartucho de 8 poços para uma placa de PCR de 96 poços semi-saiada, certificando-se de pipetar lentamente.
   1. Coloque o bloco de calor no selador de placas PCR PX1. O selador começará a aquecer até 180 °C quando ligado. Coloque a vedação térmica da folha na placa, garantindo que a linha vermelha esteja no topo. Coloque a placa no PX1 e pressione Seal.
   2. Escolha as seguintes condições do termociclador: Ativação enzimática: 95 °C por 10 min por 1 ciclo, Desnaturação: 94 °C por 30 s por 40 ciclos, Recozimento/Extensão: 60 °C por 1 min por 40 ciclos, Desativação enzimática: 98 °C por 10 min por 1 ciclo, Hold: 4 °C indefinidamente.
   3. No leitor de gotículas, abra o software compatível e selecione quais poços devem ser lidos. Selecione ABS como o tipo de experimento e dd_PCR Supermix para sondas. Escolha Ch1 Desconhecido para o Alvo 1 e Ch2 Desconhecido para o Alvo 2. Selecione Aplicar e, em seguida, OK. Coloque a placa no leitor de gotículas. Para o conjunto de tinturas, escolha FAM/HEX e clique em Executar.
3. Analise os resultados dd_PCR. Bloqueie a população de gotículas duplamente positivas usando o controle negativo como referência. Calcular a média dos valores duplicados e multiplicar pelo factor de diluição e pelo factor de diluição de 5 vezes do dd_PCR.
   NOTA: O total de cópias por microlitro é calculado do seguinte modo: total de cópias por microlitro = valor médio × factor de diluição de 5 ×, em que o «valor médio» representa o valor médio de quantificação de Ch1 e Ch2.
4. Combine todas as amostras em uma única biblioteca em concentrações equimolares. A biblioteca agrupada 1x deve conter aprox. 4,5 x 10⁹ moléculas e ter um volume total de 5 μL.

11. Sequenciamento de última geração

1. Envie as amostras para sequenciamento a uma agência externa, garantindo que as sequências corretas do adaptador sejam anotadas.

12. Análise de dados CIRCLE-seq (1 - 3 h)

1. Instale o Python versão 2.7, Burrows-Wheeler Aligner (BWA) e SAMtools. Baixe o genoma de referência (por exemplo, hg38) do http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz.
   NOTA: Se o genoma da espécie-alvo não estiver disponível, o fluxo de trabalho computacional CIRCLE-seq pode ser executado em um modo independente de referência. Nessa situação, essa etapa pode ser ignorada.
2. Baixe e instale o pipeline CIRCLE-seq com os seguintes comandos: (1) git clone https://github.com/tsailabSJ/circleseq.git, (2) cd circleseq, (3) pip install -r requirements.txt.
3. Crie um arquivo de manifesto no formato YAML (.yaml). Abaixo está um manifesto de exemplo que pode ser usado com o conjunto de dados de exemplo fornecido no software CIRCLE-seq para testar o fluxo de trabalho.
   NOTA: (1) genoma de referência: dados / entrada / CIRCLEseq_test_genome.fa; (2) analysis_folder: dados/saída; (3) BWA: BWA; (4) Samtools: Samtools; (5) read_threshold: ; (6) window_size: ; (7) mapq_threshold: ; (8) start_threshold: ; (9) gap_threshold: ; (10) mismatch_threshold: ; (11) merged_analysis: Verdadeiro; (12) amostras: U2OS_EMX1; (13) alvo: GAGTCCGAGCAGAAGAAGAANGG; (14) read1: dados/entrada/EMX1.r1.fastq.gz; (15) read2: dados/entrada/EMX1.r2.fastq.gz; (16) controlread1: dados/entrada/EMX1_control.r1.fastq.gz; (17) controlread2: dados/entrada/EMX1_control.r2.fastq.gz; (18) descrição: U2OS. Os seguintes valores de manifesto foram usados: read_threshold: 4, window_size: 3, mapq_threshold: 50, start_threshold: 1, gap_threshold: 3, mismatch_threshold: 6
4. Defina o arquivo FASTA do genoma de referência, o diretório de saída para análise e os caminhos para os comandos BWA e SAMtools . Defina as sequências de destino e os caminhos para os arquivos FASTQ demultiplexados para as amostras clivadas por nuclease e controle. Vários experimentos podem ser processados simultaneamente no modo de lote, incluindo todos eles em um único arquivo de manifesto.
5. Execute o seguinte comando para análises baseadas em referência padrão: (1) python /path/to/circleseq.py all - manifesto; (2) /caminho/para/manifest.yaml.
6. Como alternativa, execute o seguinte comando para análises padrão não baseadas em referência: (1) Python /path/to/circleseq.py reference-free - manifesto; (2) /caminho/para/manifest.yaml.
7. Ao executar o pipeline completo, encontre os resultados de saída de cada etapa em um output_folder distinto designado para essa etapa específica.

Resultados

Aqui, o CIRCLE-seq é utilizado para investigar os locais de clivagem induzidos por nuclease de Cas9 em um complexo com o gRNA projetado para atingir o local de integração do vírus adeno-associado 1 (AAVS1) usando DNA isolado de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Este gRNA foi descrito anteriormente em nossa publicação²⁷. Aproximadamente 25 μg de gDNA foram isolados de iPSCs, cortados por ultrassom focalizado e o tamanho selecionado usando purificação de esferas AMPure XP para produzir fragmentos de aprox. 300 bps. A partir desses 25 μg de DNA, aprox. 2-5 ng de DNA foram circularizados com sucesso para clivagem in vitro de Cas9: gRNA. Todo o procedimento é representado na Figura 1.

Seguindo um procedimento e análise CIRCLE-seq usando nosso fluxo de trabalho de computação, uma visualização de todos os locais de clivagem dentro e fora do alvo detectados é apresentada na Figura 2A. O pipeline CIRCLE-seq também forneceu 'leituras mescladas', analisadas por meio de software estatístico R para produzir um gráfico de Manhattan mostrando os locais de clivagem induzidos por nuclease detectados mapeados ao longo de cada cromossomo (Figura 2B).

Figura 1: Esquemas de fluxo de trabalho CIRCLE-seq. As principais etapas do protocolo são indicadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Visualização CIRCLE-seq e Manhattan Plot. (A) Alinhamento de locais fora do alvo contra o alvo pretendido para o locus AAVS1. A sequência de destino é exibida na parte superior, onde os alvos fora são classificados por contagem de leitura em ordem decrescente. As diferenças nas sequências alvo originais são mostradas por nucleotídeos coloridos. Uma amostra dos principais locais de clivagem não intencionais para o locus AAVS1 é mostrada. (B) Gráfico de Manhattan ilustrando os locais de clivagem não intencionais detectados para o locus AAVS1. As alturas das barras representam contagens de leitura para cada posição cromossômica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Cartilha	Sequência (5'-3')	Comentários/Descrição
AAVS1 RNA guia único (sgRNA)	GGGGCCACUAGGGACAGGAU	Para AAVS1 Locus' Fluorescent Protein Knock-In
AAVS1 Primer Direto	GCTCTGGGCGGAGGAATATG	Para teste de clivagem in vitro de gRNA
AAVS1 Primer Reverso	ATTCCCAGGGCCGGTTAATG	Para teste de clivagem in vitro de gRNA
oSQT1288	/5Phos/CGGTGGACCGATGATC /ideoxyU/ATCGGTCCACCGaT	Adaptador de grampo de cabelo CIRCLE-seq
oSQT1274	AATGATACGGCGACCACCGAG	TruSeq F1
oSQT1275	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT	TruSeqF2
oSQT1310	/56-FAM/CCTACACGA/ZEN/CGCTCTTCCGATCT/3IABkFQ/	Sonda TruSeq
oSQT1311	/5HEX/TCGGAAGAG/ZEN/CACACGTCTGAACT/3IABkFQ/	Sonda TruSeq

Tabela 1: Sequências de gRNA e primers usados para análise CIRCLE-seq do locus AAVS1 .

Discussão

Aqui, o CIRCLE-seq demonstrou ser uma técnica imparcial e altamente sensível para identificar DSBs induzidos por nuclease em todo o genoma resultante do direcionamento do locus AAVS1 no gDNA derivado de iPSCs. O local AAVS1 dentro de iPSCs é conhecido como um locus de porto seguro que é frequentemente usado como um local de integração de genes exógenos usando CRISPR-Cas9²⁸. Nosso relatório recente estudou o potencial de iPSCs marcadas com EGFP realizando a integração mediada por CRISPR de um repórter EGFP expresso constitutivamente no local AAVS1 , o que permite a rotulagem e rastreamento de iPSCs e iPSCs diferenciados devido à persistência de EGFP em toda a linhagem^{da célula 27}. Esta linha iPSC pode ser usada in vivo para avaliar a distribuição do organismo de células derivadas de iPSC após o transplante. Como esta linha celular foi modificada por CRISPR e também está sendo usada para testar a aplicação clínica de iPSCs, é imperativo que os potenciais locais AAVS1 fora do alvo sejam conhecidos e interrogados para garantir segurança e eficácia, tornando-o um locus ideal para testar CIRCLE-seq.

Uma diferença notável entre Butterfield et al., estudo publicado anteriormente²⁷ e este foi o uso de um gRNA modificado para atingir o locus AAVS1. Um gRNA pode ser projetado para melhorar a precisão da edição do genoma²⁴. A sequência guia é o fator mais crítico que influencia as eficiências dentro e fora do alvo. Portanto, o gRNA escolhido foi testado em vários outros guias e apresentou fidelidade superior. Além disso, um artigo de métodos sobre a reprogramação de fibroblastos humanos comprovou a descoberta de que mRNAs sintéticos contendo nucleobases modificadas se beneficiam da baixa ativação de respostas antivirais^29,30. Embora a baixa imunogenicidade possa não ser relevante em um ensaio in vitro, ela se torna crucial quando o objetivo final é desenvolver uma terapia clinicamente relevante que possa ser usada em células vivas.

O CIRCLE-seq tem muitas vantagens sobre métodos semelhantes. Por exemplo, as sequências Digenome-seq clivado e não clivado gDNA, usando ~ 400 milhões de leituras²¹. Isso resulta em um fundo alto, dificultando a filtragem de locais de corte de boa-fé de baixa frequência. O CIRCLE-seq usa apenas ~ 3-5 milhões de leituras devido ao enriquecimento do gDNA clivado por nuclease, resultando em baixo fundo. Além disso, o Digenome-seq e um método semelhante, o SITE-seq, dependem do sequenciamento de uma única extremidade de DNA clivada por nuclease. Em contraste, as leituras CIRCLE-seq incluem ambas as extremidades do local de corte, permitindo a identificação de locais fora do alvo sem a necessidade de uma referência 21,22,26.

Uma vantagem do CIRCLE-seq é sua maior sensibilidade em comparação com os métodos que dependem de cultura de células, como o GUIDE-seq. Quando os dois métodos foram comparados, o CIRCLE-seq foi capaz de capturar todos os locais fora do alvo detectados pelo GUIDE-seq e descobriu locais de clivagem não intencionais adicionais que o GUIDE-seq havia perdido. No entanto, uma diferença notável é que o GUIDE-seq pode ser prejudicado pelo cenário epigenético, enquanto o CIRCLE-seq pode acessar todo o genoma.

Como ensaio in vitro , o CIRCLE-seq apresenta várias limitações, a primeira das quais é a detecção de falsos positivos. Enquanto a epigenética impedirá a atividade da nuclease em certos locais in vivo, a ultrassonografia remove esses obstáculos in vitro, permitindo a atividade fora do alvo em locais que normalmente não são acessíveis em um contexto celular. Além disso, Cas9 está presente em altas concentrações neste ensaio in vitro , permitindo clivagem que de outra forma não seria possível in vivo. Este ensaio também requer uma quantidade relativamente grande de gDNA inicial, o que, dependendo dos recursos disponíveis, pode anular o uso deste protocolo. Por fim, é possível que alguns locais fora do alvo sejam indetectáveis devido às limitações das atuais tecnologias de sequenciamento de última geração.

Um estudo recente usou uma abordagem in silico cujo algoritmo identificou uma série de parâmetros relevantes para comparar diferentes métodos de caracterização de nucleases, incluindo CIRCLE-seq e GUIDE-seq³¹. Dois dos parâmetros relevantes foram 'enriquecimento no local de corte' e '% de falsos positivos'. Curiosamente, a taxa de falso-positivos do CIRCLE-seq foi calculada em 88%, mas seu enriquecimento no local de corte foi maior do que os outros métodos in vitro . Análises comparativas de todos os métodos revelaram que o GUIDE-seq foi o melhor desempenho, pois demonstrou a maior especificidade no alvo com apenas uma taxa moderada de falso-positivos³². Isso não invalida o CIRCLE-seq, mas sugere a possibilidade de utilizar o CIRCLE-seq e o GUIDE-seq em conjunto, validando as descobertas do CIRCLE-seq com o GUIDE-seq, uma vez que o primeiro tem maior sensibilidade, enquanto o último é um método baseado em células com alto enriquecimento no local de corte. Os dados também indicam que o sequenciamento de próxima geração (NGS) baseado em amplicon deve ser o método preferido para identificar modificações genuínas fora do alvo em locais candidatos a potencial³¹. Esses dados sugerem uma estratégia potencial de usar CIRCLE-seq, seguido por GUIDE-seq e, em seguida, NGS baseado em amplicon para examinar efeitos fora do alvo.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2-mL Thin-walled Tubes and Flat Caps	ThermoFisher Scientific	AB1114
1.5% PippinHT cassette	Sage Science	HTC1510
10 mL Serological Pipettes	FisherScientific	12567603
15 mL Conical Tube	FisherScientific	339651
150 x 25 mm Tissue Culture Dish	FisherScientific	877224
25 mL Reagent Reservoir	FisherScientific	2138127C
2x Kapa KiFi HotStart Ready Mix	Kapa Biosystems	KK2602
5 mL Serological Pipettes	FisherScientific	170355
50 mL Conical Tube	FisherScientific	339653
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoFisher Scientific	B49
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3516
Agencourt AMPure XP Reagent, 60 mL	Beckman Coulter	A63881
Benchtop Microcentrifuge	Eppendorf	5400002
BsaI-HF	New England BioLabs
Buffer QX1	Qiagen	20912
Cas9 nuclease, Streptococcus Pyogenes	New England BioLabs	M0386M
CIRCLE-seq Library Preparation and NGS
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix	Corning	354277	Extracellular matrix (ECM) for culturing iPSCs
ddPCR SuperMix for Probes	Bio-Rad	1863010
DG8 Cartridge Holder	Bio-Rad	1863051
DG8 Cartridges	Bio-Rad	1864008
DG8 Gaskets	Bio-Rad	1863009
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144	Made by Invitrogen
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad	1863005
Droplet Reader Oil	Bio-Rad	1863004
EDTA (0.5 M)	ThermoFisher Scientific	15575020
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free	ThermoFisher Scientific	AM9260G	Made by Invitrogen
Eppendorf  ThermoMixer	Eppendorf	5384000020
Equipment
Ethyl Alcohol, Pure	Sigma-Aldrich	E7023
Exonuclease I	New England BioLabs	M0293L	E. coli
Filter Unit	FisherScientific	FB0875713
Filtered Sterile Pipette Tips
Focused Ultrasonicator	Covaris	ME220
Genomic DNA Isolation
Genomic DNA Shearing
Gentra Puregene Cell Core Kit	Qiagen	158043
gRNAs	Synthego
HCl	ThermoFisher Scientific	A144500
Heracell VIOS Tri-gas Humidified Tissue Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	51030411	Need for culturing and expanding iPSCs (37 °C/5% CO2/5% O2)
High Sensitivity D1000 DNA ScreenTape	Agilent	5067-5584
High Sensitivity D1000 Reagents	Agilent	5067-5585
HTP Library Preparation Kit	Kapa Biosystems	KK8235
HyClone Antibiotic Antimycotic Solution	Cytiva	SV30079.01
IDTE pH 8.0 (1x TE Solution)	Integrated DNA Technologies	11050204
Inverted Microscope			Need for imaging iPS colonies in bright-field and fluorescent channels
iPSC Culture
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Lambda Exonuclease	New England BioLabs	M0262L
Loading Tips, 10 pack	Agilent	5067-5599
Magnum FLX Enhanced Universal Magnet Plate	Alpaqua	A00400
Microcentrifuge Tube	Axygen	31104051
Microtube AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap	Covaris	520045
mTeSR-1 5x Supplement	StemCell Technology	85852
mTeSR-1 Basal Medium (400 mL)	StemCell Technology	85851	Media for maintaining iPSC in culture
Nanodrop 8000 Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-8000-GL
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina	New England BioLabs	E7600S	Dual Index Primers Set 1
Optical tube strip caps, 8x strip	Agilent	401425
Optical tube strips, 8x strip	Agilent	401428
Other Reagents
PCR Plate Sealer	Bio-Rad	PX1	Model Number PX1
PEG/NaCl SPRI Solution	Kapa Biosystems
Phusion Hot Start Flex 2x Master Mix	New England BioLabs	M0536L
Pierceable Foil Heat Seal	Bio-Rad	1814040
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase	Epicentre	E3110K
Primers, Adapters and Probes	IDT		Sequences are listed in Table 1
Proteinase K	Qiagen	19131
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QIAxcel Gel Analysis System	Qiagen	9001941
Qubit Assay Tubes	ThermoFisher Scientific	Q32856
Qubit dsDNA BR Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32853
Qubit dsDNA BR Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32853
Qubit dsDNA HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q32854
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33226
QX200 Droplet Digital PCR System	Bio-Rad	1864001	Contain a QX200 droplet generator and a QX200 droplet reader
RNase A	Qiagen	19101
Semi-skirted PCR Plate	ThermoFisher Scientific	14230244
SeqPlaque GTG Agarose	Lonza	50110
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102
T4 DNA Ligase	New England BioLabs	M0202L
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	New England BioLabs	M0201L
T-75 Flasks	FisherScientific	7202000
Tapestation 4150	Agilent	G2992AA
Thermocycler with programmable temperature-stepping functionality	Bio-Rad C1000 Touch
Tris base	ThermoFisher Scientific	BP1521
Twin.tec PCR Plate	Eppendorf	E951020346	96 wells, semi-skirted, green
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher Scientific	10977015
USER Enzyme	New England BioLabs	M5505L