Comece colocando os embriões dissecados da rata fêmea prenha eutanasiada de dois a seis meses de idade em meio completo frio com 1% de soro fetal bovino. Após a remoção do tecido endometrial, placenta e saco vitelínico do embrião em aumento de 5X, dissecar os progenitores cardíacos da região cardíaca embrionária usando pinças. Puxe todas as regiões cardíacas dissecadas de cinco embriões de camundongo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e centrifugue-os em um balde oscilante, pré-resfriado a quatro graus Celsius.
Remova o sobrenadante e lave o tecido com um mililitro de PBS grau de cultura de tecido. Centrifugar os tubos a 300G por um minuto a quatro graus Celsius. Em seguida, retire o sobrenadante e repita duas lavagens com um mililitro de PBS.
Uma vez feito, substitua o PBS por 0,05% de tripsina-EDTA. Centrifugar e repetir duas lavagens com EDTA-Tripsina 0,05%. Para digerir o tecido, adicione 50 microlitros de 0,05% de tripsina-EDTA e aqueça por 10 minutos a 37 graus Celsius.
Em seguida, aplique uma dissociação mecânica suave após cinco minutos, aspirando a suspensão para cima e para baixo usando uma ponta de filtro de orifício largo. Inative a atividade de digestão de tripsina adicionando 350 microlitros de meio completo às células dissociadas. Passe a suspensão da célula através de um filtro de células de 40 micrômetros.
Prepare as células para congelamento centrifugando a suspensão celular recém-dissociada. Retire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio congelante refrigerado. Transfira a suspensão celular para um frasco para injetáveis de crio pré-refrigerado e coloque o frasco para injetáveis de crio num recipiente de congelação pré-refrigerado.
Coloque o recipiente de congelamento a 80 graus Celsius negativos por quatro a oito horas antes de transferi-lo para nitrogênio líquido para experimentos de sequenciamento.
