Comece colocando a suspensão de células cardíacas embrionárias dissociadas congeladas contendo frascos de crio em banho-maria de 37 graus Celsius por um a dois minutos. Adicione um mililitro de meio completo, pré-aquecido a 37 graus Celsius à suspensão descongelada e misture três vezes com uma pipeta. Em seguida, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros, contendo 10 milímetros de meio completo quente.
Passe toda a suspensão da célula sobre um filtro de 30 micrômetros e lave o filtro com um a dois mililitros de meio quente e completo. Colete o fluxo através do mesmo tubo cônico. Em seguida, centrifugar os tubos a 300 G por cinco minutos.
Após a remoção do sobrenadante, lave o pellet com PBS e transfira a suspensão celular para um microtubo de 1,5 mililitro. Centrifugar a suspensão celular e adicionar 100 microlitros das microesferas magnéticas fornecidas às células peletizadas. Homogeneizar a suspensão cinco vezes com uma ponta larga de pipeta de javali antes de 15 minutos de incubação à temperatura ambiente.
Enquanto isso, enxágue a coluna de separação magnética com 500 microlitros de tampão de ligação. Uma vez concluída a incubação, diluir a mistura de suspensão de células de microesferas usando 500 microlitros de tampão de ligação. Em seguida, adicione 0,6 mililitros da suspensão da célula à coluna de separação magnética.
Coletar o efluente de células vivas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Em seguida, enxágue o microtubo de 1,5 mililitro que continha a suspensão celular usando um mililitro de tampão de ligação. Após o enxágue, transfira o tampão de ligação do microtubo de 1,5 mililitro para a coluna e colete o efluente no mesmo tubo de 15 mililitros.
Repita o enxágue do tubo de 1,5 mililitro usando um mililitro de tampão de ligação. Depois de centrifugar o efluente a 300 G por cinco minutos, remova o sobrenadante sem interromper o pellet celular. Adicione um mililitro da solução PBS BSA e misture suavemente por pipetagem usando uma ponta de pipeta de orifício largo.
Em seguida, transfira a suspensão celular para um microtubo de 1,5 mililitro. Novamente, centrifugar a suspensão celular e remover o sobrenadante sem interromper a pastilha celular. Repita as duas lavagens de um mililitro de PBS BSA.
Após remover um mililitro de PBS BSA, ressuspenda as células em 100 microlitros de solução PBS BSA. Misture pipetando 10 vezes. Determinar a concentração realizando um ensaio de azul de tripano para garantir uma contagem de células maior ou igual a 100.000 células e realizar uma avaliação baseada em fluorescência para a viabilidade das células.
A etapa adicional de triagem e remoção das células mortas após o descongelamento permitiu a obtenção de uma suspensão de células mais limpas com viabilidade celular significativamente maior e melhorou a qualidade da amostra inicial. Para maior precisão, dois diferentes métodos de contagem foram usados para quantificar as células e núcleos, incluindo o azul de tripano e a avaliação da viabilidade baseada em fluorescência. Nesse protocolo, observou-se que a viabilidade celular passou de 80 a 90% antes do isolamento dos núcleos para menos de 5% após o isolamento dos núcleos.
