Comece transferindo a suspensão de células tumorais pancreáticas previamente descongeladas para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros e adicione PBS para atingir um volume final de dois mililitros. Em seguida, use um hemocitômetro para avaliar a quantidade e a qualidade das células. Uma vez que o pellet celular é obtido através de centrifugação, usando pontas de pipeta progressivamente menores, decantar cuidadosamente o sobrenadante para minimizar a distribuição do pellet enquanto maximiza o fluido decantado.
Prepare o tampão de lise celular 1X e, em seguida, adicione 100 microlitros dele a 900 microlitros de tampão de diluição de lise celular previamente preparado para obter o tampão de lise celular 0,1X. Transfira 100 microlitros de tampão de lise celular 0,1X resfriado para o pellet da célula e pipete suavemente cinco vezes para garantir a reuspensão completa. Após a incubação no gelo por três minutos, adicione um mililitro de tampão de lavagem resfriado ao pellet ressuspendido e pipete-o suavemente cinco vezes.
Após a centrifugação, descarte o sobrenadante como demonstrado e repita esse processo de lavagem mais duas vezes. Carregar a suspensão corada com tripano azul em um hemocitômetro para contar o número de núcleos. Ressuspenda a pelota de núcleos em tampão de núcleos 1X com base na recuperação de núcleos alvo de meta.
Passe cuidadosamente os núcleos ressuspensos através de um filtro de células de ponta de pipeta de 40 micrômetros e, em seguida, mantenha-o no gelo. Agora conte os núcleos. Os núcleos obtidos por este método apresentaram tamanho e forma adequados.
Eventuais pontilhados leves do envelope nuclear podem ser observados e devem ser monitorados na avaliação nuclear final via hemocitômetro.
