Para começar, coloque lamínulas estéreis nos poços de placas de cultura de tecidos de seis poços e despeje um volume adequado de Poli-L-lisina e solução laminada nos poços para cobrir a lamínula. Em seguida, sele a placa com filme plástico para reduzir a evaporação e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, lave as tampas três vezes com PBS estéril.
Adicione dois mililitros de suspensão celular e meio de crescimento à placa 10.000 células em cada poço contendo a lamínula. Após lavar as lamínulas com PBS, fixar as células com uma solução de paraformaldeído a 4% e PBS por 18 minutos. Enxaguar as lamínulas três vezes com PBS por cinco minutos antes da imunomarcação.
Incubar as lamínulas imunocoradas e lavadas em um a cinco microgramas de corante Hoechst por 10 minutos. Em seguida, lave as tampas com PBS por mais cinco minutos. Monte as lâminas usando uma proporção igual de PBS e mistura de glicerol e capture as imagens usando um microscópio fluorescente.
Tratar as células com uma solução de dissociação celular não enzimática durante 30 segundos a um minuto. Em seguida, adicione cinco mililitros de DMEM para cada mililitro do reagente de dissociação celular não enzimática. Conte células usando um hemocitômetro.
Centrifugar as células no 5G por cinco minutos. Ressuspender as células em uma concentração de uma a duas vezes 10 das sextas células por 100 microlitros de DMEM. Coloque o animal de bruços e esterilize o local da injeção com etanol 70%.
Injetar uma a duas vezes 10 das sextas células por via subcutânea no flanco direito. Coloque o rato sozinho numa gaiola sem roupa de cama e deixe-o recuperar. Para evitar a hipotermia, coloque uma parte da gaiola sobre a almofada de aquecimento.
Imagens de baixa e alta potência de células MPNST P0 GGF beta 3 de passagem precoce são mostradas. As células mostraram-se tumorogênicas, formando colônias em ágar mole e enxertos em camundongos imunodeficientes.
