이 연구는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소(R01 NS048353 및 R01 NS109655 SLC의 보조금으로 지원되었습니다. R01 NS109655-03S1 - D.P.J.), 국립 암 연구소(R01 CA122804 - S.L.C.) 및 국방부(X81XWH-09-1-0086 및 W81XWH-12-1-0164 - S.L.C.).

P 0-GGFβ3 마우스 모델에서 PN-MPNST 진행의 병리학 평가

<ol>
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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

여기에 제시된 조직학적 및 생화학적 방법은 신경섬유종 및 MPNST 발병기전의 GEM 모델을 진단하고 특성화하기 위한 프레임워크를 제공합니다. 수년에 걸쳐, 우리는 이러한 방법론이 GEM 모델 21,25,26에서 발생하는 말초 신경초 종양의 병리학을 평가하는 데 매우 유용하다는 것을 발견했다. 그러나 여기에 설명된 프로토콜은 GEM 모...

지난 30년 동안 수많은 실험실에서 인간 암 관련 돌연변이를 마우스 게놈에 도입하거나 인간 암에서 과발현되는 유전자 산물을 과발현하여 인간 암의 마우스 모델을 만들려고 시도했습니다. 그 결과 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 새로 도입된 게놈 변형이 종양 형성을 시작한다는 것을 확립하고, 종양 진행에 기여하는 다른 후속 유전적 또는 후성유전학적 변화를 식별하고, 종양 시작 및 진행을 유도하는 주요 신호 전달 경로를 정의하는 등 다양한 목적으로 사용할 수 있습니다. 면역 결핍 마우스의 사용에 의존하는 orthotopic 이종이식 모델과 달리 GEM 암 모델은 완전한 기능을 갖춘 면역 체계를 가지고 있으므로 후보 치료제에 대한 반응을 보다 정확하게 모델링할 수 있습니다. 그러나 이와 같은 목적으로 GEM 암 모델을 사용할 때는 조사관이 GEM 신생물로 관찰한 것이 인간 신생물과 관련이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 검증에는 GEM 신생물의 병리학에 대한 철저한 평가와 GEM 신생물의 병리학적 특징이 해당 인간 종양 유형의 병리를 재현하는지 여부에 대한 결정이 포함되어야 합니다.
종양 감수성 증후군 신경섬유종증 1형(NF1)은 인간 신경계에 영향을 미치는 가장 흔한 유전 질환으로, 출생아 3,000-3,500명당 약 1명꼴로 발생합니다 1,2,3. NF1에 감염된 개인은 피부(피부 신경 섬유종)와 큰 신경 및 신경총(망상 신경 섬유종)에 신경 섬유종으로 알려진 여러 양성 말초 신경초 종양이 발생합니다. 진피 신경섬유종과 망상신경섬유종은 모두 신체적, 행동적, 사회적 장애를 일으켜 환자의 삶의 질을 악화시키지만, 망상신경섬유종(PN)은 특히 위험하다 4,5. 이는 PN이 생존율이 매우 낮은 공격적인 방추세포 신생물인 악성 말초신경초종양(MPNST)으로 자주 변형되기 때문입니다 1,2. 이러한 낮은 생존율은 대부분 현재 MPNST를 치료하는 데 사용되는 방사선 및 화학 요법이 효과가 없기 때문입니다. 그러나 새롭고 더 효과적인 치료법을 개발하는 것은 어려운 일이었습니다. 이는 NF1 환자에서 MPNST가 얼마나 흔하게 발생하는지에도 불구하고 여전히 희귀한 신생물이기 때문입니다. 결과적으로, 연구를 위해 많은 수의 인간 종양을 얻는 것은 매우 어렵습니다. 임상시험을 위해 MPNST를 가진 충분한 환자를 모집하는 것도 어렵습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 신경섬유종 발병기전 및 PN-MPNST 진행을 유발하는 이상에 대한 추가 통찰력을 얻고 후보 치료제에 대한 전임상 시험을 촉진하는 것을 목표로 여러 GEM 모델이 생성되었습니다.
NF1 환자는 NF1 유전자의 한 사본에 불활성화 돌연변이가 있습니다. 신경섬유종 발병기전은 Schwann 세포 계통의 세포에서 나머지 기능적 NF1 유전자의 불활성화 돌연변이가 발생할 때 유발됩니다. 그러나 놀랍게도, 생식세포가 Nf1 돌연변이를 비활성화한 마우스를 생성했을 때, 그들은 신경섬유종 6,7을 개발하지 않았다. 다른 모든 세포 유형에서 Nf1-null Schwann 세포 및 Nf1 하플로불충분을 가진 마우스(Krox20-Cre;Nf1flox/- 마우스)가 발달한 망상형 신경섬유종(plexiform neurofibromas)은 신경섬유종 발병기전을 위해 추가적인 세포 유형에서 감소된 Nf1 유전자 투여량이 필요하다는 것을 시사했다8. 그럼에도 불구하고 Krox20-Cre의 망상 신경 섬유종; Nf1flox/- 마우스는 MPNST로 진행되지 않았으므로 인간 마우스의 생물학을 부분적으로만 모방했습니다. MPNST 발병기전은 Nf1 돌연변이가 Trp539 또는 Cdkn2a10과 같은 추가 종양 억제 유전자의 돌연변이와 짝을 이룰 때 발생했지만, 이러한 GEM 모델의 MPNST는 기존의 양성 신경총형 신경섬유종(benign plexiform neurofibromas)이 아닌 불확실한 생물학적 전위(ANNUBP)의 비정형 신경섬유종 신생물(atypical neurofibromatous neoplasm)에서 발생하거나 발생했다(13,14 참조). Suz12 및 Pten15와 같은 유전자에서 추가적인 MPNST 관련 기능 돌연변이를 도입하는 다른 모델뿐만 아니라 이러한 모델에 대한 우수한 검토를 위해).
이러한 마우스 모델은 NF1, TP53 및 CDKN2A와 같은 유전자가 NF1 관련 말초 신경계 신생물의 발병기전에서 수행하는 역할을 규명하고 후보 치료제를 테스트하는 전임상 시험에 매우 중요합니다. 그러나 우리는 여전히 망상형 신경섬유종이 불확실한 생물학적 잠재력(ANNUBPs16)의 비정형 신경섬유종성 신생물이 된 다음 MPNST가 되는 과정에 대해 불완전하게 이해하고 있습니다. Nf1 및 Arf에서 결실이 있는 마우스가 MPNST로 진행되는 ANNUBP를 개발한다는 최근 보고와 함께 이 과정을 이해하는 데 약간의 진전이 있었습니다11. 그러나 인간에서 볼 수 있는 망상형 신경섬유종-MPNST 진행 과정을 완전히 재현하는 Nf1 돌연변이 기반 마우스 모델은 아직 존재하지 않습니다. 또한 MPNST의 개발로 이어지는 여러 가지 뚜렷한 경로가 있는지 여부도 명확하지 않습니다. 이를 감안할 때, 위에서 설명한 GEM은 신경섬유종-MPNST 진행 및 MPNST 발병기전으로 이어지는 여러 다른 경로의 하위 집합만 모델링할 수 있습니다. 이 점은 MPNST가 또한 산발적으로 발생한다는 사실과 일부 산발적인 MPNST는 명백히 NF1 돌연변이를 가지고 있지 않다는 사실에 의해 강조된다17,18.
NF1 돌연변이가 결핍된 적어도 일부 산발성 MPNST는 흑색종 또는 다른 유형의 육종이라는 Magollon-Lorenz et al.의 최근 제안에 의해 이 후자의 주장에 도전받았지만, 우리는 최근에 산발적인 MPNST와 NF1 야생형20인 이 종양(2XSB 세포)에서 유래한 세포주를 보고했습니다. 모종양과 2XSB 세포주를 특성화하는 동안, 흑색종 및 산발성 악성 말초신경초 종양의 감별 진단에서 일상적으로 고려되는 여러 다른 육종 유형을 포함한 대체 진단 가능성을 체계적으로 배제했다20. 또한, Magollon-Lorenz 등은 그들이 연구한 3개의 산발적인 MPNST 세포주에서 발견한 결과가 산발성 MPNST로 확인된 모든 종양이 MPNST가 아니라는 것을 나타내기 위해 일반화할 수 없다는 것을 인정했습니다.
신경섬유종과 MPNST 발병기전이 특정 종양 억제 유전자 돌연변이에 반드시 의존하지 않는 GEM 모델을 구축하기 위해, 슈반(Schwann) 세포 특이적 미엘린 단백질 제로(P0) 프로모터(P 0-GGFβ3 마우스)에 의해 강력한 슈반(Schwann) 세포 미토겐 뉴레굴린-1(NRG1)의 과발현이 유도되는 형질전환 마우스를 생성했습니다.21. 우리는 이전에 인간 신경섬유종, MPNST 및 MPNST 세포주가 NRG1 신호전달을 매개하는 erbB 수용체 티로신 키나아제(erbB2, erbB3 및 erbB4)와 함께 여러 NRG1 동형을 발현하고 이러한 erbB 수용체가 구성적으로 활성화됨을 보여주었습니다22. 또한 erbB 키나아제의 약리학적 억제제가 MPNST 증식22, 생존23 및 이동을 강력하게 억제한다는 것을 입증했다24. 인간에 대한 우리의 관찰에 따라, P 0-GGFβ3 마우스는 고주파 21,25에서 MPNST로 진행되는 망상형 신경섬유종(plexiform neurofibroma)25을 발달시킨다. P0-GGFβ3 MPNST는 인간과 마찬가지로 일반적으로 Trp53 및 Cdkn2a의 돌연변이뿐만 아니라 종양형성에 잠재적으로 기여할 수 있는 수많은 다른 유전체 이상을 발생시킨다는 것을 보여주었다25. P 0-GGFβ3 마우스에서 발생하는 MPNST는 비활성화 Nf1 돌연변이를 갖지 않습니다. 그러나, 유전자 보완을 이용하여, NRG1이 Nf1 손실에 의해 변경되는 동일한 신호전달 캐스케이드를 통해 주로 P 0-GGFβ3 마우스에서 종양형성을 촉진한다는 것을 보여주었다26; 이 결론은 Trp53 하플로인부전(haploinsufficiency)이 있는 상태에서 Nf1 손실을 NRG1 과발현으로 대체한다는 우리의 발견에 근거한다(P0-GGFβ3;Trp53+/- 마우스)는 cis-Nf1+/-에서 볼 수 있듯이 MPNST가 de novo로 발달하는 동물을 생산합니다. Trp53+/- 마우스27.
P 0-GGFβ3 마우스가 NF1을 가진 인간에서 볼 수 있는 신경섬유종 발병 및 신경섬유종-MPNST 진행 과정을 정확하게 모델링한다는 것을 입증하는 이 정보와 기타 정보를 얻기 위해 당사는 이러한 동물의 조직을 처리하고, 종양을 정확하게 진단하고, 이러한 마우스에서 발생하는 MPNST의 등급을 매기고, 초기 통과 P0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3을 확립하고 특성화하는 특수 방법론을 개발했습니다. Trp53+/- MPNST 배양 및 P 0-GGFβ3 PN 및 MPNST와 P0-GGFβ3의 병리학을 비판적으로 비교; Trp53+/- MPNST를 인간과 비교합니다. 이러한 방법론 중 다수는 신경계 종양의 다른 GEM 모델로 일반화할 수 있습니다. 또한 이러한 방법론 중 일부는 다른 장기 부위에서 신생물이 발생하는 GEM 모델에 더 광범위하게 적용할 수 있습니다. 따라서 여기서는 이러한 방법론에 대한 자세한 설명을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Plates</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;- Diaminobensidine (DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- well plates</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21043 or A11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caldesmon</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>E89, ab32330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>117R-18-ASR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-L-CD163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>ab29364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>ab81289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>ab53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>5989-27-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>C-11, ab7753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Agilent Dako&#160;</td>
			<td>clone D33 (M0760)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobensizdine (DAB) Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forksolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>245-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Brightline-Hauser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP-7401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell 240i CO2 incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>12202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MART1</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>M2-9E3, ab187369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuregulin 1 beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&#38;D Systems)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofibromin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Great Value Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P0-GGF&#946;3 mice</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Paraplast 39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J19943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount (Xylene Mounting Medium)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toldedo</td>
			<td>Seven Excellence, 8603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco&#39;s)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMEL</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>EP4863(2), ab137078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5899-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Isoflurance Machine</td>
			<td>VetEquip Inhalation Anesthesia Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10981100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rice Cooker</td>
			<td>Beech Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100B</td>
			<td>Agilent Dako&#160;</td>
			<td>Z0311&#160; (now GA504)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>Ventana Medical Systems&#160;</td>
			<td>clone 1A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate (Dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP327-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>ab212843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel histology mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCF4/TCFL2&#160;</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>(CH48H11) #2569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>348600050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-31</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying, diagnosing, and grading malignant peripheral nerve sheath tumors in genetically engineered mouse models

상염색체 우성 종양 감수성 증후군인 신경섬유종증 1형(NF1) 환자는 일반적으로 망상신경섬유종(PN)이 발생하며, 이후 매우 공격적인 악성 말초 신경초초 종양(MPNST)으로 변합니다. PN이 MPNST로 전환되는 과정을 이해하는 것은 NF1이 있는 인간에게서 볼 수 있는 PN-MPNST 진행을 정확하게 복제하는 유전자 조작 마우스(GEM) 모델의 가용성에 의해 촉진될 것입니다. 불행히도 Nf1 절제가 있는 GEM 모델은 이 프로세스를 완전히 재현하지 못합니다. 이를 통해 슈반(Schwann) 세포에서 미토겐 뉴레굴린-1(NRG1)이 과발현되어 고주파의 MPNST로 발전하는 PN이 발생하는 GEM 모델인 P 0-GGFβ3 마우스를 개발하게 되었습니다. 그러나 P 0-GGFβ3 마우스의 종양형성 및 종양 진행이 NF1 환자에서 관찰되는 과정을 정확하게 모델링하는지 여부를 결정하기 위해서는 먼저 P0-GGFβ3 말초 신경초 종양의 병리학이 인간 종양의 병리를 재현한다는 것을 증명해야 했습니다.
여기에서는 P 0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3을 사용하여 GEM 모델에서 말초 신경계 신생물을 정확하게 진단하고 등급을 매기는 데 사용되는 특수 방법론을 설명합니다. Trp53+/- 마우스를 예로 들 수 있습니다. PN 및 MPNST를 진단하는 데 사용되는 조직학적, 면역조직화학적, 조직화학적 방법, 이러한 신생물을 병리학을 모방하는 다른 종양 유형과 구별하는 방법 및 이러한 신생물의 등급을 매기는 방법에 대해 설명합니다. GEM MPNST의 초기 배양 확립, 면역세포화학을 사용하여 이러한 배양을 특성화하는 방법, 동종 이식편을 설정하여 종양원성을 검증하는 방법에 대해 논의합니다. 종합적으로 이러한 기술은 GEM 모델에서 발생하는 PN 및 MPNST의 병리를 특성화하고 이러한 쥐 종양의 병리학을 인간 종양과 비판적으로 비교합니다.

Over the last three decades, numerous laboratories have attempted to create mouse models of human cancers by introducing human cancer-associated mutations into the mouse genome or by overexpressing a gene product that is overexpressed in human cancers. The resulting genetically engineered mouse (GEM) models can be used for a variety of purposes such as establishing that the newly introduced genomic modification initiates tumorigenesis, identifying other subsequently occurring genetic or epigenetic changes that contribute to tumor progression, and defining the key signaling pathways that drive tumor initiation and progression. Unlike orthotopic xenograft models, which rely on the use of immunodeficient mice, GEM cancer models have a fully functional immune system and so more accurately model responses to candidate therapeutic agents. However, when using GEM cancer models for purposes such as these, it is essential that investigators confirm that observations made with GEM neoplasms are relevant to their human counterparts. This validation should include a thorough assessment of the pathology of the GEM neoplasms and a determination as to whether the pathologic features of the GEM neoplasms recapitulate the pathology of the corresponding human tumor type.
The tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1) is the most common genetic disease affecting the human nervous system, occurring in approximately 1 in every 3,000-3,500 live births1,2,3. Individuals afflicted with NF1 develop multiple benign peripheral nerve sheath tumors known as neurofibromas in their skin (dermal neurofibromas) and in large nerves and nerve plexuses (plexiform neurofibromas). While both dermal and plexiform neurofibromas worsen the patient&#39;s quality of life by producing physical, behavioral, and/or social impairment, plexiform neurofibromas (PNs) are particularly dangerous4,5.&#160;This is because PNs frequently transform into malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which are aggressive spindle cell neoplasms with an exceptionally low survival rate1,2. In large part, this low survival rate is because the radio- and chemotherapeutic regimens that are currently used to treat MPNSTs are ineffective. However, developing new, more effective therapies has been challenging. This is because, despite how commonly MPNSTs occur in NF1 patients, they are still rare neoplasms. As a result, it is very difficult to obtain large numbers of human tumors for study; it is also challenging to recruit enough patients with MPNSTs for clinical trials. To overcome these limitations, several GEM models have been generated with the goal of gaining further insights into the abnormalities driving neurofibroma pathogenesis and PN-MPNST progression and to facilitate preclinical trials with candidate therapeutic agents.
NF1 patients have inactivating mutations in one copy of the NF1 gene. Neurofibroma pathogenesis is triggered when an inactivating mutation in the remaining functional NF1 gene occurs in a cell in the Schwann cell lineage. Surprisingly, however, when mice were generated with germline inactivating Nf1 mutations, they did not develop neurofibromas6,7. The subsequent demonstration that mice with Nf1-null Schwann cells and Nf1 haploinsufficiency in all other cell types (Krox20-Cre;Nf1flox/- mice) developed plexiform neurofibromas suggested that reduced Nf1 gene dosage in additional cell types was required for neurofibroma pathogenesis8. Even then, the plexiform neurofibromas in Krox20-Cre;Nf1flox/- mice did not progress to become MPNSTs and so only partially mimicked the biology of their human counterparts. MPNST pathogenesis did occur when Nf1 mutations were partnered with mutations in additional tumor suppressor genes such as Trp539 or Cdkn2a10, but MPNSTs in these GEM models developed de novo or from atypical neurofibromatous neoplasms of uncertain biologic potential (ANNUBPs)11,12, rather than from preexisting benign plexiform neurofibromas (see13,14 for excellent reviews of these models as well as other models introducing additional MPNST-associated loss of function mutations in genes such as Suz12 and Pten15).
These mouse models have been invaluable for establishing the role that genes such as NF1, TP53, and CDKN2A play in the pathogenesis of NF1-associated peripheral nervous system neoplasms and for preclinical trials testing candidate therapeutic agents. However, we still have an incomplete understanding of the process by which plexiform neurofibromas progress to become atypical neurofibromatous neoplasms of uncertain biologic potential (ANNUBPs16) and then MPNSTs. Some progress has recently been made in understanding this process with the recent report that mice with deletions in Nf1 and Arf develop ANNUBPs that progress to become MPNSTs11. However, Nf1 mutation-based mouse models that fully recapitulate the process of plexiform neurofibroma-MPNST progression seen in humans do not yet exist. In addition, it is not clear whether there are multiple distinct pathways that lead to the development of MPNSTs. Given this, it is possible that the GEMs described above only model a subset of several different pathways that lead to neurofibroma-MPNST progression and MPNST pathogenesis. This point is emphasized by the fact that MPNSTs also occur sporadically and that some sporadic MPNSTs apparently do not have NF1 mutations17,18.
Although this latter point has been challenged by Magollon-Lorenz et al.&#39;s recent suggestion that at least some sporadic MPNSTs lacking NF1 mutations are melanomas or a different type of sarcoma19, we have recently reported a sporadic MPNST and a cell line derived from this tumor (2XSB cells) that was NF1 wild-type20. During the characterization of the parent tumor and the 2XSB cell line, we systematically ruled out alternative diagnostic possibilities, including melanoma and the multiple other sarcoma types that are routinely considered in the differential diagnosis of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor20. In addition, we note that Magollon-Lorenz et al. acknowledged that their findings in the three sporadic MPNST cell lines that they studied could not be generalized to indicate that all tumors identified as sporadic MPNSTs are not MPNSTs.
To construct a GEM model in which neurofibroma and MPNST pathogenesis were not necessarily dependent upon specific tumor suppressor gene mutations, we generated transgenic mice in which overexpression of the potent Schwann cell mitogen neuregulin-1 (NRG1) was driven by the Schwann cell-specific myelin protein zero (P0) promoter (P0-GGF&#946;3 mice)21. We have previously shown that human neurofibromas, MPNSTs, and MPNST cell lines express several NRG1 isoforms together with the erbB receptor tyrosine kinases (erbB2, erbB3, and erbB4) that mediate NRG1 signaling and that these erbB receptors are constitutively activated22. We have also demonstrated that pharmacologic inhibitors of the erbB kinases potently inhibit MPNST proliferation22, survival23, and migration24. In keeping with our observations in humans, P0-GGF&#946;3 mice develop plexiform neurofibromas25 that progress to become MPNSTs at a high frequency21,25. We have shown that P0-GGF&#946;3 MPNSTs, like their human counterparts, commonly develop mutations of Trp53 and Cdkn2a, as well as numerous other genomic abnormalities that potentially contribute to tumorigenesis25. MPNSTs arising in P0-GGF&#946;3 mice do not have inactivating Nf1 mutations. However, using genetic complementation, we showed that NRG1 promotes tumorigenesis in P0-GGF&#946;3 mice predominantly through the same signaling cascades that are altered by Nf1 loss26; this conclusion is based on our finding that substituting NRG1 overexpression for Nf1 loss in the presence of Trp53 haploinsufficiency (P0-GGF&#946;3;Trp53+/- mice) produces animals in which MPNSTs develop de novo, as is seen in cis-Nf1+/-;Trp53+/- mice27.
To obtain this and other information demonstrating that P0-GGF&#946;3 mice accurately model the processes of neurofibroma pathogenesis and neurofibroma-MPNST progression seen in humans with NF1, we have developed specialized methodologies for processing tissues from these animals, accurately diagnosing their tumors, grading the MPNSTs arising in these mice, establishing and characterizing early-passage P0-GGF&#946;3 and P0-GGF&#946;3;Trp53+/- MPNST cultures and critically comparing the pathology of P0-GGF&#946;3 PNs and MPNSTs and P0-GGF&#946;3;Trp53+/- MPNSTs to that of their human counterparts. Many of these methodologies are generalizable to other GEM models of nervous system neoplasia. Additionally, several of these methodologies are more broadly applicable to GEM models in which neoplasms arise in other organ sites. Consequently, here we present a detailed description of these methodologies.

저자 스포트라이트: 유전자 조작 마우스 모델 및 신경섬유종증 제1형 관련 종양의 병리학적 특성 분석

유전자 조작 마우스 모델에서 악성 말초 신경초 종양 식별, 진단 및 등급 지정

그림 2는 P 0-GGFβ3 마우스에서 발생하는 매우 명백한 신생물의 예를 보여줍니다. 육안으로 쉽게 식별할 수 있는 종양은 그림 2A(화살표)와 같이 신체 부위를 팽창시키는 종괴로 보일 수 있습니다. 신생물이 잠재적으로 말초 신경초 종양인지 여부를 결정할 때 종양이 말초 신경과 관련이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 경우 MRI 스캔(<strong cl...

우리는 유전자 조작 쥐의 신경계 신생물이 인간 쥐의 병리를 정확하게 재현하는지 여부를 평가하는 방법론을 개발했습니다. 여기서는 이러한 조직학적 기술, 정의된 병리학적 기준 및 배양 방법론을 P 0-GGFβ3 마우스 모델에서 발생하는 신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양에 적용합니다.

Patients with the autosomal dominant tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1) commonly develop plexiform neurofibromas (PNs) that ...

우리 그룹은 신경섬유종증 1형에 중점을 두고 있으며 질병과 관련된 암, 망상신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양의 병리를 이해하는 데 중점을 두고 있습니다. 이를 위해 우리는 유전자 조작 마우스 모델, P0GGF 베타 3, 우리 연구실 및 망상형 신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양을 연구하는 다른 연구실을 포함한 여러 기술을 사용하여 유사한 문제에 직면해 있습니다. 환자 유래 종양 샘플에 대한 제한된 접근은 우리의 작업에 방해가 됩니다.결과적으로, 유전자 조작 마우스 모델을 만들고 특성화하는 것은 질병 메커니즘과 치료법의 잠재적 개발에 대한 지속적인 연구에 매우 중요합니다. 말초 신경 종양을 식별하는 것은 까다로울 수 있으며 종종 다른 암으로 오진됩니다. 이를 방지하기 위해 우리는 조직학, 면역조직화학 및 등급을 사용하여 이러한 종양을 정확하게 식별하고 등급을 매기는 상세한 프로토콜을 개발했습니다.이를 통해 향후 연구 연구의 신뢰성을 높일 수 있습니다. 우리의 연구는 유전자 조작 마우스 모델 유래 종양을 조사하고 검증하여 인간의 질병을 적절하게 모방하는지 확인하는 프레임워크를 제공합니다. 우리는 현재의 유전자 조작 마우스 모델을 사용하여 종양 미세환경과 종양 변형에 필수적인 요인을 이해할 것입니다.망상신경섬유종이 악성 말초종양으로 진행되는 원인.

identifying-diagnosing-grading-malignant-peripheral-nerve-sheath

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identifying, Diagnosing, and Grading Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors in Genetically Engineered Mouse Models

732 조회수.  Medical University of South Carolina. 우리 그룹은 신경섬유종증 1형에 중점을 두고 있으며 질병과 관련된 암, 망상신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양의 병리를 이해하는 데 중점을 두고 있습니다. 이를 위해 우리는 유전자 조작 마우스 모델, P0GGF 베타 3, 우리 연구실 및 망상형 신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양을 연구하는 다른 연구실을 포함한 여러 기술을 사용하여 유사한 문제에 직면해 있습니다. 환자...

비디오: 저자 스포트라이트: 유전자 조작 마우스 모델 및 신경섬유종증 제1형 관련 종양의 병리학적 특성 분석

Patients with the autosomal dominant tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1) commonly develop plexiform neurofibromas (PNs) that subsequently transform into highly aggressive malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Understanding the process by which a PN transforms into an MPNST would be facilitated by the availability of genetically engineered mouse (GEM) models that accurately replicate the PN-MPNST progression seen in humans with NF1. Unfortunately, GEM models with Nf1 ablation do not fully recapitulate this process. This led us to develop P0-GGF&#946;3 mice, a GEM model in which overexpression of the Schwann cell mitogen neuregulin-1 (NRG1) in Schwann cells results in the development of PNs that progress to become MPNSTs with high frequency. However, to determine whether tumorigenesis and neoplastic progression in P0-GGF&#946;3 mice accurately model the processes seen in NF1 patients, we had to first prove that the pathology of P0-GGF&#946;3 peripheral nerve sheath tumors recapitulates the pathology of their human counterparts.
Here, we describe the specialized methodologies used to accurately diagnose and grade peripheral nervous system neoplasms in GEM models, using P0-GGF&#946;3 and P0-GGF&#946;3;Trp53+/- mice as an example. We describe the histologic, immunohistochemical, and histochemical methods used to diagnose PNs and MPNSTs, how to distinguish these neoplasms from other tumor types that mimic their pathology, and how to grade these neoplasms. We discuss the establishment of early-passage cultures from GEM MPNSTs, how to characterize these cultures using immunocytochemistry, and how to verify their tumorigenicity by establishing allografts. Collectively, these techniques characterize the pathology of PNs and MPNSTs that arise in GEM models and critically compare the pathology of these murine tumors to their human counterparts.

We have developed a methodology for assessing whether nervous system neoplasms in genetically engineered mice accurately recapitulate the pathology of their human counterparts. Here, we apply these histologic techniques, defined pathologic criteria, and culture methodologies to neurofibromas and malignant peripheral nerve sheath tumors arising in the P0-GGF&#946;3 mouse model.

연구

암 연구학

Identifying Neurofibromas and Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) in P0-GGF&#946;3 Mice

P 0-GGFβ3 마우스에서 신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양(MPNST) 식별

Preparing Hematoxylin and Eosin-Stained Sections of Grossly Visible Tumors

심하게 보이는 종양의 헤마톡실린 및 에오신 염색 절편 준비

Identifying Potential Plexiform Neurofibromas (PNs) and Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) by Performing Special Stains to Confirm Diagnoses