Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 und R01 NS109655 an S.L.C. unterstützt; R01 NS109655-03S1 an D.P.J.), das National Cancer Institute (R01 CA122804 an S.L.C.) und das Verteidigungsministerium (X81XWH-09-1-0086 und W81XWH-12-1-0164 an S.L.C.).

Pathologische Beurteilung der PN-MPNST-Progression im p 0-GGFβ3-Mausmodell

<ol>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Die hier vorgestellten histologischen und biochemischen Methoden bieten einen Rahmen für die Diagnose und Charakterisierung von GEM-Modellen des Neurofibroms und der MPNST-Pathogenese. Im Laufe der Jahre haben wir festgestellt, dass diese Methoden sehr nützlich sind, um die Pathologie von peripheren Nervenscheidentumoren zu beurteilen, die in GEM-Modellen auftreten 21,25,26. Während die hier skizzierten Protokolle nützlich s...

In den letzten drei Jahrzehnten haben zahlreiche Laboratorien versucht, Mausmodelle für menschliche Krebserkrankungen zu erstellen, indem sie menschliche krebsassoziierte Mutationen in das Mausgenom einführten oder ein Genprodukt überexprimierten, das bei menschlichen Krebsarten überexprimiert wird. Die resultierenden gentechnisch veränderten Mausmodelle (GEM) können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, z. B. um festzustellen, dass die neu eingeführte genomische Modifikation die Tumorentstehung einleitet, um andere später auftretende genetische oder epigenetische Veränderungen zu identifizieren, die zur Tumorprogression beitragen, und um die wichtigsten Signalwege zu definieren, die die Tumorinitiierung und -progression vorantreiben. Im Gegensatz zu orthotopen Xenotransplantatmodellen, die auf der Verwendung von immundefizienten Mäusen beruhen, verfügen GEM-Krebsmodelle über ein voll funktionsfähiges Immunsystem und modellieren daher das Ansprechen auf Therapeutikakandidaten genauer. Bei der Verwendung von GEM-Krebsmodellen für solche Zwecke ist es jedoch wichtig, dass die Forscher bestätigen, dass Beobachtungen mit GEM-Neoplasien für ihre menschlichen Kollegen relevant sind. Diese Validierung sollte eine gründliche Beurteilung der Pathologie der GEM-Neoplasien und eine Feststellung umfassen, ob die pathologischen Merkmale der GEM-Neoplasien die Pathologie des entsprechenden menschlichen Tumortyps rekapitulieren.
Das Tumoranfälligkeitssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) ist die häufigste genetische Erkrankung des menschlichen Nervensystems und tritt bei etwa 1 von 3.000-3.500 Lebendgeburten auf 1,2,3. Personen, die von NF1 betroffen sind, entwickeln mehrere gutartige periphere Nervenscheidentumoren, die als Neurofibrome bekannt sind, in ihrer Haut (dermale Neurofibrome) und in großen Nerven und Nervengeflechten (plexiforme Neurofibrome). Während sowohl dermale als auch plexiforme Neurofibrome die Lebensqualität des Patienten verschlechtern, indem sie körperliche, verhaltensbezogene und/oder soziale Beeinträchtigungen hervorrufen, sind plexiforme Neurofibrome (PNs) besonders gefährlich 4,5. Dies liegt daran, dass sich PNs häufig in bösartige periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) verwandeln, bei denen es sich um aggressive Spindelzellneoplasien mit einer außergewöhnlich niedrigen Überlebensrate handelt 1,2. Diese niedrige Überlebensrate ist zum großen Teil darauf zurückzuführen, dass die derzeit zur Behandlung von MPNSTs verwendeten Radio- und Chemotherapien unwirksam sind. Die Entwicklung neuer, wirksamerer Therapien war jedoch eine Herausforderung. Dies liegt daran, dass MPNSTs trotz der Häufigkeit des Auftretens bei NF1-Patienten immer noch seltene Neoplasien sind. Infolgedessen ist es sehr schwierig, eine große Anzahl menschlicher Tumore für Studien zu erhalten. es ist auch schwierig, genügend Patienten mit MPNSTs für klinische Studien zu rekrutieren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden mehrere GEM-Modelle erstellt, mit dem Ziel, weitere Einblicke in die Anomalien zu gewinnen, die die Pathogenese des Neurofibroms und die PN-MPNST-Progression vorantreiben, und präklinische Studien mit Therapeutikakandidaten zu erleichtern.
NF1-Patienten haben inaktivierende Mutationen in einer Kopie des NF1-Gens. Die Neurofibrom-Pathogenese wird ausgelöst, wenn eine inaktivierende Mutation im verbleibenden funktionellen NF1-Gen in einer Zelle der Schwann-Zelllinie auftritt. Überraschenderweise entwickelten Mäuse, die mit keimbahninaktivierenden Nf1-Mutationen erzeugt wurden, keine Neurofibrome 6,7. Der anschließende Nachweis, dass Mäuse mit Nf1-null-Schwann-Zellen und Nf1-Haploinsuffizienz in allen anderen Zelltypen (Krox20-Cre;Nf1flox/- Mäuse) entwickelten plexiformen Neurofibromen deuteten darauf hin, dass eine reduzierte Nf1-Gendosis in zusätzlichen Zelltypen für die Neurofibrom-Pathogenese erforderlich war8. Selbst dann sind die plexiformen Neurofibrome in Krox20-Cre; Nf1flox/- Mäuse entwickelten sich nicht zu MPNSTs und ahmten daher die Biologie ihrer menschlichen Gegenstücke nur teilweise nach. Die MPNST-Pathogenese trat auf, wenn Nf1-Mutationen mit Mutationen in zusätzlichen Tumorsuppressorgenen wie Trp539 oder Cdkn2a10 verpartnert wurden, aber MPNSTs in diesen GEM-Modellen entwickelten sich de novo oder aus atypischen neurofibromatösen Neoplasien mit unsicherem biologischem Potenzial (ANNUBPs)11,12 und nicht aus bereits bestehenden gutartigen plexiformen Neurofibromen (siehe 13,14 für hervorragende Übersichten dieser Modelle sowie anderer Modelle, die zusätzliche MPNST-assoziierte Funktionsverlustmutationen in Genen wie Suz12 und Pten15 einführen).
Diese Mausmodelle waren von unschätzbarem Wert für die Etablierung der Rolle, die Gene wie NF1, TP53 und CDKN2A bei der Pathogenese von NF1-assoziierten Neoplasien des peripheren Nervensystems spielen, und für präklinische Studien zur Erprobung von Therapeutikakandidaten. Wir haben jedoch immer noch ein unvollständiges Verständnis des Prozesses, durch den plexiforme Neurofibrome zu atypischen neurofibromatösen Neoplasien mit ungewissem biologischem Potenzial (ANNUBPs16) und dann zu MPNSTs fortschreiten. In letzter Zeit wurden einige Fortschritte beim Verständnis dieses Prozesses erzielt, mit dem jüngsten Bericht, dass Mäuse mit Deletionen in Nf1 und Arf ANNUBPs entwickeln, die zu MPNSTs11 fortschreiten. Es gibt jedoch noch keine auf Nf1-Mutationen basierenden Mausmodelle, die den Prozess der plexiformen Neurofibrom-MPNST-Progression beim Menschen vollständig rekapitulieren. Darüber hinaus ist nicht klar, ob es mehrere unterschiedliche Wege gibt, die zur Entwicklung von MPNSTs führen. Vor diesem Hintergrund ist es möglich, dass die oben beschriebenen GEMs nur eine Teilmenge mehrerer verschiedener Signalwege modellieren, die zur Neurofibrom-MPNST-Progression und MPNST-Pathogenese führen. Dieser Punkt wird durch die Tatsache unterstrichen, dass MPNSTs auch sporadisch auftreten und dass einige sporadische MPNSTs anscheinend keine NF1-Mutationen aufweisen17,18.
Obwohl dieser letzte Punkt durch den jüngsten Vorschlag von Magollon-Lorenz et al. in Frage gestellt wurde, dass zumindest einige sporadische MPNSTs ohne NF1-Mutationen Melanome oder eine andere Art von Sarkom19 sind, haben wir kürzlich über ein sporadisches MPNST und eine von diesem Tumor abgeleitete Zelllinie (2XSB-Zellen) berichtet, die NF1-Wildtyp 20 war. Bei der Charakterisierung des Muttertumors und der 2XSB-Zelllinie schlossen wir systematisch alternative diagnostische Möglichkeiten aus, einschließlich des Melanoms und der zahlreichen anderen Sarkomtypen, die routinemäßig bei der Differentialdiagnose eines sporadischen malignen peripheren Nervenscheidentumors in Betracht gezogen werden20. Darüber hinaus stellen wir fest, dass Magollon-Lorenz et al. einräumten, dass ihre Ergebnisse in den drei von ihnen untersuchten sporadischen MPNST-Zelllinien nicht verallgemeinert werden konnten, um darauf hinzuweisen, dass alle Tumoren, die als sporadische MPNSTs identifiziert wurden, keine MPNSTs sind.
Um ein GEM-Modell zu konstruieren, in dem Neurofibrom und MPNST-Pathogenese nicht unbedingt von spezifischen Tumorsuppressorgenmutationen abhängig sind, erzeugten wir transgene Mäuse, in denen die Überexpression des potenten Schwann-Zell-Mitogens Neuregulin-1 (NRG1) durch den Schwann-Zell-spezifischen Myelinprotein-Null-Promotor (P0-GGFβ3-Mäuse) angetrieben wurde21. Wir haben bereits gezeigt, dass humane Neurofibrome, MPNSTs und MPNST-Zelllinien mehrere NRG1-Isoformen zusammen mit den erbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen (erbB2, erbB3 und erbB4) exprimieren, die die NRG1-Signalgebung vermitteln, und dass diese erbB-Rezeptoren konstitutiv aktiviert sind22. Wir haben auch gezeigt, dass pharmakologische Inhibitoren der erbB-Kinasen die MPNST-Proliferation22, das Überleben23 und die Migration24 stark hemmen. In Übereinstimmung mit unseren Beobachtungen beim Menschen entwickeln P 0-GGFβ3-Mäuse plexiforme Neurofibrome25, die sich mit hoher Frequenz zu MPNSTs entwickeln 21,25. Wir haben gezeigt, dass P 0-GGFβ3-MPNSTs, wie ihre menschlichen Gegenstücke, häufig Mutationen von Trp53 und Cdkn2a sowie zahlreiche andere genomische Anomalien entwickeln, die möglicherweise zur Tumorgenese beitragen25. MPNSTs, die in P 0-GGFβ3-Mäusen auftreten, weisen keine inaktivierenden Nf1-Mutationen auf. Unter Verwendung genetischer Komplementierung konnten wir jedoch zeigen, dass NRG1 die Tumorgenese in P 0-GGFβ3-Mäusen hauptsächlich durch dieselben Signalkaskaden fördert, die durch den Verlust von Nf1 verändert werden26; Diese Schlussfolgerung basiert auf unserer Erkenntnis, dass die Substitution der NRG1-Überexpression durch den Nf1-Verlust bei Vorliegen einer Trp53-Haploinsuffizienz (P 0-GGFβ3;Trp53+/- Mäuse) produziert Tiere, bei denen sich MPNSTs de novo entwickeln, wie es bei cis-Nf1+/- der Fall ist; Trp53+/- Mäuse27.
Um diese und andere Informationen zu erhalten, die zeigen, dass P 0-GGFβ3-Mäuse die Prozesse der Neurofibrom-Pathogenese und der Neurofibrom-MPNST-Progression, die bei Menschen mit NF1 beobachtet werden, genau modellieren, haben wir spezielle Methoden entwickelt, um Gewebe von diesen Tieren zu verarbeiten, ihre Tumore genau zu diagnostizieren, die in diesen Mäusen auftretenden MPNSTs zu bewerten, P0-GGFβ3 und P0-GGFβ3 in der frühen Passage zu etablieren und zu charakterisieren; Trp53+/- MPNST-Kulturen und kritischer Vergleich der Pathologie von P 0-GGFβ3 PNs und MPNSTs und P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNSTs mit denen ihrer menschlichen Gegenstücke. Viele dieser Methoden sind auf andere GEM-Modelle von Neoplasien des Nervensystems verallgemeinerbar. Darüber hinaus sind einige dieser Methoden breiter auf GEM-Modelle anwendbar, in denen Neoplasien an anderen Organstellen auftreten. Daher präsentieren wir hier eine detaillierte Beschreibung dieser Methoden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture Plates</td>
			<td>Corning Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;- Diaminobensidine (DAB)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6- well plates</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A38-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21043 or A11004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride (NH4Cl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A661-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caldesmon</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>E89, ab32330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD117</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>117R-18-ASR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD163</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-L-CD163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>ab29364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD34</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>ab81289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD86</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>ab53004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Stripper</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circle Coverslip</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>5989-27-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Critic Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytokeratin</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>C-11, ab7753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desmin</td>
			<td>Agilent Dako&#160;</td>
			<td>clone D33 (M0760)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diaminobensizdine (DAB) Solution</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (200 Proof)</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2716</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>FB-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forksolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harris Hematoxylin</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>245-677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Brightline-Hauser Scientific</td>
			<td>1490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>327-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1</td>
			<td>Wako Chemicals</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP-2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>MP-7401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Heracell 240i CO2 incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Piramal</td>
			<td>NDC 66794-017-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki-67</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>12202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>23017015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MART1</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>M2-9E3, ab187369</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nestin</td>
			<td>Millipore&#160;</td>
			<td>Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuregulin 1 beta</td>
			<td>In house</td>
			<td>Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&#38;D Systems)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofibromin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology&#160;</td>
			<td>sc-67</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice</td>
			<td>Jackson Laboratory</td>
			<td>5557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonfat Dry Milk</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Great Value Brand</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P0-GGF&#946;3 mice</td>
			<td>In house</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Paraplast 39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PM-999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (4%)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>J19943-K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount (Xylene Mounting Medium)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Meter</td>
			<td>Mettler Toldedo</td>
			<td>Seven Excellence, 8603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (Dulbecco&#39;s)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>20-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMEL</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>EP4863(2), ab137078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5899-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Isoflurance Machine</td>
			<td>VetEquip Inhalation Anesthesia Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>10981100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rice Cooker</td>
			<td>Beech Hamilton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100B</td>
			<td>Agilent Dako&#160;</td>
			<td>Z0311&#160; (now GA504)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMA</td>
			<td>Ventana Medical Systems&#160;</td>
			<td>clone 1A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Citrate (Dihydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP327-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10</td>
			<td>ABCAM&#160;</td>
			<td>ab212843</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel histology mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCF4/TCFL2&#160;</td>
			<td>Cell Signaling&#160;</td>
			<td>(CH48H11) #2569</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Cassette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>348600050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-051-31</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identifying, diagnosing, and grading malignant peripheral nerve sheath tumors in genetically engineered mouse models

Patienten mit dem autosomal-dominanten Tumoranfälligkeitssyndrom Neurofibromatose Typ 1 (NF1) entwickeln häufig plexiforme Neurofibrome (PNs), die sich anschließend in hochaggressive maligne periphere Nervenscheidentumoren (MPNSTs) verwandeln. Das Verständnis des Prozesses, durch den sich ein PN in ein MPNST verwandelt, würde durch die Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten Mausmodellen (GEM) erleichtert, die das PN-MPNST-Fortschreiten beim Menschen mit NF1 genau replizieren. Leider rekapitulieren GEM-Modelle mit Nf1-Ablation diesen Prozess nicht vollständig. Dies führte uns zur Entwicklung von P 0-GGFβ3-Mäusen, einem GEM-Modell, in dem die Überexpression des Schwann-Zell-Mitogens Neuregulin-1 (NRG1) in Schwann-Zellen zur Entwicklung von PNs führt, die sich mit hoher Frequenz zu MPNSTs entwickeln. Um jedoch festzustellen, ob die Tumorgenese und die neoplastische Progression in P 0-GGFβ3-Mäusen die bei NF1-Patienten beobachteten Prozesse genau modellieren, mussten wir zunächst nachweisen, dass die Pathologie von P0-GGFβ3-Tumoren der peripheren Nervenscheide die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke rekapituliert.
Hier beschreiben wir die spezialisierten Methoden, die zur genauen Diagnose und Bewertung von Neoplasien des peripheren Nervensystems in GEM-Modellen verwendet werden, wobei P 0-GGFβ3 und P0-GGFβ3 verwendet werden; Trp53+/- Mäuse als Beispiel. Wir beschreiben die histologischen, immunhistochemischen und histochemischen Methoden, die zur Diagnose von PNs und MPNSTs verwendet werden, wie man diese Neoplasien von anderen Tumorarten unterscheidet, die ihre Pathologie nachahmen, und wie man diese Neoplasien einstuft. Wir diskutieren die Etablierung von Frühpassagekulturen aus GEM-MPNSTs, wie diese Kulturen mit Hilfe der Immunzytochemie charakterisiert werden können und wie ihre Tumorigenität durch die Etablierung von Allotransplantaten verifiziert werden kann. Zusammengenommen charakterisieren diese Techniken die Pathologie von PNs und MPNSTs, die in GEM-Modellen auftreten, und vergleichen die Pathologie dieser murinen Tumoren kritisch mit ihren menschlichen Gegenstücken.

Over the last three decades, numerous laboratories have attempted to create mouse models of human cancers by introducing human cancer-associated mutations into the mouse genome or by overexpressing a gene product that is overexpressed in human cancers. The resulting genetically engineered mouse (GEM) models can be used for a variety of purposes such as establishing that the newly introduced genomic modification initiates tumorigenesis, identifying other subsequently occurring genetic or epigenetic changes that contribute to tumor progression, and defining the key signaling pathways that drive tumor initiation and progression. Unlike orthotopic xenograft models, which rely on the use of immunodeficient mice, GEM cancer models have a fully functional immune system and so more accurately model responses to candidate therapeutic agents. However, when using GEM cancer models for purposes such as these, it is essential that investigators confirm that observations made with GEM neoplasms are relevant to their human counterparts. This validation should include a thorough assessment of the pathology of the GEM neoplasms and a determination as to whether the pathologic features of the GEM neoplasms recapitulate the pathology of the corresponding human tumor type.
The tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1) is the most common genetic disease affecting the human nervous system, occurring in approximately 1 in every 3,000-3,500 live births1,2,3. Individuals afflicted with NF1 develop multiple benign peripheral nerve sheath tumors known as neurofibromas in their skin (dermal neurofibromas) and in large nerves and nerve plexuses (plexiform neurofibromas). While both dermal and plexiform neurofibromas worsen the patient&#39;s quality of life by producing physical, behavioral, and/or social impairment, plexiform neurofibromas (PNs) are particularly dangerous4,5.&#160;This is because PNs frequently transform into malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs), which are aggressive spindle cell neoplasms with an exceptionally low survival rate1,2. In large part, this low survival rate is because the radio- and chemotherapeutic regimens that are currently used to treat MPNSTs are ineffective. However, developing new, more effective therapies has been challenging. This is because, despite how commonly MPNSTs occur in NF1 patients, they are still rare neoplasms. As a result, it is very difficult to obtain large numbers of human tumors for study; it is also challenging to recruit enough patients with MPNSTs for clinical trials. To overcome these limitations, several GEM models have been generated with the goal of gaining further insights into the abnormalities driving neurofibroma pathogenesis and PN-MPNST progression and to facilitate preclinical trials with candidate therapeutic agents.
NF1 patients have inactivating mutations in one copy of the NF1 gene. Neurofibroma pathogenesis is triggered when an inactivating mutation in the remaining functional NF1 gene occurs in a cell in the Schwann cell lineage. Surprisingly, however, when mice were generated with germline inactivating Nf1 mutations, they did not develop neurofibromas6,7. The subsequent demonstration that mice with Nf1-null Schwann cells and Nf1 haploinsufficiency in all other cell types (Krox20-Cre;Nf1flox/- mice) developed plexiform neurofibromas suggested that reduced Nf1 gene dosage in additional cell types was required for neurofibroma pathogenesis8. Even then, the plexiform neurofibromas in Krox20-Cre;Nf1flox/- mice did not progress to become MPNSTs and so only partially mimicked the biology of their human counterparts. MPNST pathogenesis did occur when Nf1 mutations were partnered with mutations in additional tumor suppressor genes such as Trp539 or Cdkn2a10, but MPNSTs in these GEM models developed de novo or from atypical neurofibromatous neoplasms of uncertain biologic potential (ANNUBPs)11,12, rather than from preexisting benign plexiform neurofibromas (see13,14 for excellent reviews of these models as well as other models introducing additional MPNST-associated loss of function mutations in genes such as Suz12 and Pten15).
These mouse models have been invaluable for establishing the role that genes such as NF1, TP53, and CDKN2A play in the pathogenesis of NF1-associated peripheral nervous system neoplasms and for preclinical trials testing candidate therapeutic agents. However, we still have an incomplete understanding of the process by which plexiform neurofibromas progress to become atypical neurofibromatous neoplasms of uncertain biologic potential (ANNUBPs16) and then MPNSTs. Some progress has recently been made in understanding this process with the recent report that mice with deletions in Nf1 and Arf develop ANNUBPs that progress to become MPNSTs11. However, Nf1 mutation-based mouse models that fully recapitulate the process of plexiform neurofibroma-MPNST progression seen in humans do not yet exist. In addition, it is not clear whether there are multiple distinct pathways that lead to the development of MPNSTs. Given this, it is possible that the GEMs described above only model a subset of several different pathways that lead to neurofibroma-MPNST progression and MPNST pathogenesis. This point is emphasized by the fact that MPNSTs also occur sporadically and that some sporadic MPNSTs apparently do not have NF1 mutations17,18.
Although this latter point has been challenged by Magollon-Lorenz et al.&#39;s recent suggestion that at least some sporadic MPNSTs lacking NF1 mutations are melanomas or a different type of sarcoma19, we have recently reported a sporadic MPNST and a cell line derived from this tumor (2XSB cells) that was NF1 wild-type20. During the characterization of the parent tumor and the 2XSB cell line, we systematically ruled out alternative diagnostic possibilities, including melanoma and the multiple other sarcoma types that are routinely considered in the differential diagnosis of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor20. In addition, we note that Magollon-Lorenz et al. acknowledged that their findings in the three sporadic MPNST cell lines that they studied could not be generalized to indicate that all tumors identified as sporadic MPNSTs are not MPNSTs.
To construct a GEM model in which neurofibroma and MPNST pathogenesis were not necessarily dependent upon specific tumor suppressor gene mutations, we generated transgenic mice in which overexpression of the potent Schwann cell mitogen neuregulin-1 (NRG1) was driven by the Schwann cell-specific myelin protein zero (P0) promoter (P0-GGF&#946;3 mice)21. We have previously shown that human neurofibromas, MPNSTs, and MPNST cell lines express several NRG1 isoforms together with the erbB receptor tyrosine kinases (erbB2, erbB3, and erbB4) that mediate NRG1 signaling and that these erbB receptors are constitutively activated22. We have also demonstrated that pharmacologic inhibitors of the erbB kinases potently inhibit MPNST proliferation22, survival23, and migration24. In keeping with our observations in humans, P0-GGF&#946;3 mice develop plexiform neurofibromas25 that progress to become MPNSTs at a high frequency21,25. We have shown that P0-GGF&#946;3 MPNSTs, like their human counterparts, commonly develop mutations of Trp53 and Cdkn2a, as well as numerous other genomic abnormalities that potentially contribute to tumorigenesis25. MPNSTs arising in P0-GGF&#946;3 mice do not have inactivating Nf1 mutations. However, using genetic complementation, we showed that NRG1 promotes tumorigenesis in P0-GGF&#946;3 mice predominantly through the same signaling cascades that are altered by Nf1 loss26; this conclusion is based on our finding that substituting NRG1 overexpression for Nf1 loss in the presence of Trp53 haploinsufficiency (P0-GGF&#946;3;Trp53+/- mice) produces animals in which MPNSTs develop de novo, as is seen in cis-Nf1+/-;Trp53+/- mice27.
To obtain this and other information demonstrating that P0-GGF&#946;3 mice accurately model the processes of neurofibroma pathogenesis and neurofibroma-MPNST progression seen in humans with NF1, we have developed specialized methodologies for processing tissues from these animals, accurately diagnosing their tumors, grading the MPNSTs arising in these mice, establishing and characterizing early-passage P0-GGF&#946;3 and P0-GGF&#946;3;Trp53+/- MPNST cultures and critically comparing the pathology of P0-GGF&#946;3 PNs and MPNSTs and P0-GGF&#946;3;Trp53+/- MPNSTs to that of their human counterparts. Many of these methodologies are generalizable to other GEM models of nervous system neoplasia. Additionally, several of these methodologies are more broadly applicable to GEM models in which neoplasms arise in other organ sites. Consequently, here we present a detailed description of these methodologies.

Autor im Rampenlicht: Gentechnisch veränderte Mausmodelle und pathologische Charakterisierung von Neurofibromatose Typ 1 assoziierten Tumoren

Identifizierung, Diagnose und Einstufung bösartiger peripherer Nervenscheidentumoren in gentechnisch veränderten Mausmodellen

Abbildung 2 zeigt Beispiele für grob offensichtliche Neoplasien, die bei P 0-GGFβ3-Mäusen auftreten. Tumoren, die mit bloßem Auge leicht zu erkennen sind, können als Massen gesehen werden, die sich in Körperregionen ausdehnen, wie in Abbildung 2A (Pfeil) dargestellt. Bei der Bestimmung, ob es sich bei dem Neoplasma möglicherweise um einen peripheren Nervenscheidentumor handelt, muss unbedingt festgestellt werden, dass der Tumor mit einem periph...

Wir haben eine Methodik entwickelt, um zu beurteilen, ob Neubildungen des Nervensystems in gentechnisch veränderten Mäusen die Pathologie ihrer menschlichen Gegenstücke genau rekapitulieren. Hier wenden wir diese histologischen Techniken, definierten pathologischen Kriterien und Kulturmethoden auf Neurofibrome und maligne periphere Nervenscheidentumoren an, die im P 0-GGFβ3-Mausmodell auftreten.

Patients with the autosomal dominant tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1) commonly develop plexiform neurofibromas (PNs) that ...

Unsere Gruppe konzentriert sich auf Neurofibromatose Typ eins und das Verständnis der Pathologie der mit der Krankheit assoziierten Krebsarten, plexiformen Neurofibromen und bösartigen peripheren Nervenscheidentumoren. Zu diesem Zweck verwenden wir mehrere Techniken, darunter die Verwendung eines gentechnisch veränderten Mausmodells, P0GGF beta three. Unser Labor und andere, die plexiforme Neurofibrome und bösartige periphere Nervenscheidentumoren untersuchen, stehen vor ähnlichen Herausforderungen. Der eingeschränkte Zugang zu patienteneigenen Tumorproben behindert unsere Arbeit.Daher ist die Erstellung und Charakterisierung gentechnisch veränderter Mausmodelle entscheidend für die laufende Erforschung von Krankheitsmechanismen und die mögliche Entwicklung von Therapien. Die Identifizierung peripherer Nerventumoren kann schwierig sein und wird oft als andere Krebsarten fehldiagnostiziert. Um dies zu vermeiden, haben wir ein detailliertes Protokoll entwickelt, das Histologie, Immunhistochemie und Grading verwendet, um diese Tumoren genau zu identifizieren und zu bewerten.Dies verbessert die Zuverlässigkeit zukünftiger Forschungsstudien. Unsere Arbeit bietet einen Rahmen für die Untersuchung und Validierung von gentechnisch veränderten Tumoren aus Mausmodellen, um sicherzustellen, dass sie die menschliche Krankheit richtig nachahmen. Wir werden aktuelle gentechnisch veränderte Mausmodelle verwenden, um die Tumormikroumgebung und die für die Tumortransformation wesentlichen Faktoren zu verstehen.Was führt dazu, dass plexiforme Neurofibrome zu bösartigen peripheren Tumoren fortschreiten?

identifying-diagnosing-grading-malignant-peripheral-nerve-sheath

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Identifying, Diagnosing, and Grading Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors in Genetically Engineered Mouse Models

732 Aufrufe.  Medical University of South Carolina. Unsere Gruppe konzentriert sich auf Neurofibromatose Typ eins und das Verständnis der Pathologie der mit der Krankheit assoziierten Krebsarten, plexiformen Neurofibromen und bösartigen peripheren Nervenscheidentumoren. Zu diesem Zweck verwenden wir mehrere Techniken, darunter die Verwendung eines gentechnisch veränderten Mausmodells, P0GGF beta three. Unser Labor und andere, die plexiforme Neurofibrome und bösartige periphere Nervenscheidentumoren untersuchen, stehen vor ähnlichen Heraus...

Serie: Autor im Rampenlicht: Gentechnisch veränderte Mausmodelle und pathologische Charakterisierung von Neurofibromatose Typ 1 assoziierten Tumoren

Patients with the autosomal dominant tumor susceptibility syndrome neurofibromatosis type 1 (NF1) commonly develop plexiform neurofibromas (PNs) that subsequently transform into highly aggressive malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs). Understanding the process by which a PN transforms into an MPNST would be facilitated by the availability of genetically engineered mouse (GEM) models that accurately replicate the PN-MPNST progression seen in humans with NF1. Unfortunately, GEM models with Nf1 ablation do not fully recapitulate this process. This led us to develop P0-GGF&#946;3 mice, a GEM model in which overexpression of the Schwann cell mitogen neuregulin-1 (NRG1) in Schwann cells results in the development of PNs that progress to become MPNSTs with high frequency. However, to determine whether tumorigenesis and neoplastic progression in P0-GGF&#946;3 mice accurately model the processes seen in NF1 patients, we had to first prove that the pathology of P0-GGF&#946;3 peripheral nerve sheath tumors recapitulates the pathology of their human counterparts.
Here, we describe the specialized methodologies used to accurately diagnose and grade peripheral nervous system neoplasms in GEM models, using P0-GGF&#946;3 and P0-GGF&#946;3;Trp53+/- mice as an example. We describe the histologic, immunohistochemical, and histochemical methods used to diagnose PNs and MPNSTs, how to distinguish these neoplasms from other tumor types that mimic their pathology, and how to grade these neoplasms. We discuss the establishment of early-passage cultures from GEM MPNSTs, how to characterize these cultures using immunocytochemistry, and how to verify their tumorigenicity by establishing allografts. Collectively, these techniques characterize the pathology of PNs and MPNSTs that arise in GEM models and critically compare the pathology of these murine tumors to their human counterparts.

We have developed a methodology for assessing whether nervous system neoplasms in genetically engineered mice accurately recapitulate the pathology of their human counterparts. Here, we apply these histologic techniques, defined pathologic criteria, and culture methodologies to neurofibromas and malignant peripheral nerve sheath tumors arising in the P0-GGF&#946;3 mouse model.

Forschung

Krebsforschung

Identifying Neurofibromas and Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) in P0-GGF&#946;3 Mice

Identifizierung von Neurofibromen und malignen peripheren Nervenscheidentumoren (MPNSTs) bei P 0-GGFβ3-Mäusen

Preparing Hematoxylin and Eosin-Stained Sections of Grossly Visible Tumors

Präparation von Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Schnitten von grob sichtbaren Tumoren

Identifying Potential Plexiform Neurofibromas (PNs) and Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumors (MPNSTs) by Performing Special Stains to Confirm Diagnoses

Identifizierung potenzieller plexiformer Neurofibrome (PNs) und bösartiger peripherer Nervenscheidentumoren (MPNSTs) durch spezielle Färbungen zur Diagnosesicherung

Verifying the Identity of Early-Passage MPNST Cells and Allograft of Early-Passage Tumor Cells to Demonstrate Tumorigenicity

Überprüfung der Identität von MPNST-Zellen in der frühen Passage und Allotransplantat von Tumorzellen in der frühen Passage zum Nachweis der Tumorigenität