Agradecemos os drs. Arata Tabuchi e Wolfgang Kuebler (Universidade de Toronto) para a instrução sobre microscopia intravital. Agradecemos Andrew Cahill (Nikon Instruments) para obter ajuda na concepção e implementação de microscopia. Este trabalho foi financiado pelo NIH / NHLBI concede P30 HL101295 e K08 HL105538 (para EPS).

1. Preparação de tubo cirúrgico, cateteres vasculares, Janela parede torácica <ol><li> Fase microscopia intravital. Nós custom-made um estágio plexiglass em que o rato anestesiado reside durante microscopia. Esta fase acomoda ambos de 15 cm por 10 centímetros placa de corte de plástico flexível (sobre a qual o rato se encontra durante a indução da anestesia, a colocação de traqueostomia, e cateterização venosa), bem como um elemento de aquecimento de tamanho semelhante (localizado por baixo da placa de corte). </li><li> Rato preparação tubo de toracostomia (Figura 1). Um comprimento de 10 cm de tubagem de PE 50 (Intramedic, diâmetro interno 0,58 milímetros, o diâmetro exterior 0,965 milímetros) é cortado. Uma das extremidades é ligada à extremidade romba de uma agulha de calibre 23 curvo; esta agulha vai ser usado para passar o tubo através da parede torácica (dentro → exterior) antes do fecho da janela torácica. A extremidade distal do tubo (1,5 cm de comprimento, em frente ao calibre 23 em anexoagulha) é repetidamente perfurado por uma agulha de calibre 30, a criação de &quot;portas laterais&quot; para facilitar a aspiração de ar eficaz intratorácica. Esta porção fenestrada é então separado do resto do tubo por várias voltas circunferenciais de sutura de seda 04:00; estes loops servirá como uma &quot;rolha&quot;, em última análise, a ancoragem dos 1,5 centímetros fenestrado porção no interior da cavidade torácica. </li><li> Cateter venoso jugular. Dois 15 cm de comprimento de tubos PE 10 (Intramedic, diâmetro interno 0,28 milímetros, diâmetro externo 0,61 milímetros) são cortadas. Um bisturi é usado para chanfrar as extremidades do tubo, aumentando assim a facilidade de punção venosa. O tubo é descarregado através de uma seringa de 1 ml contendo 6% de solução de dextrano de 150 kDa (em PBS) ligado à extremidade não-chanfrada do tubo. </li><li> Chest preparação parede janela (Figura 2). Membrana transparente de polivinilideno (New Kure Wrap, Kuresha, Tokyo) é cortada em forma oval (eixo maior a 6 cm, de menor importância do eixo 4 cm). A 5 mm circular n º 1 lamela (Bellco) é fixada à membrana usando α-cianoacrilato cola (Pattex flüssig, Henkel, Dusseldorf). </li><li> . Tubo para a indução de pneumotórax (&quot;tubo de sopro&quot;) Um comprimento de tubo de 10 cm (diâmetro interno de 3 mm, diâmetro externo de 5 mm) é ligada a uma seringa de 5 ml, a extremidade oposta vai ser utilizado para introduzir o ar para dentro da gaiola de animais torácica antes de peito enxerto janela parede. </li><li> Seringa para imersão em água do objectivo. Uma agulha de calibre 23 é ligada a uma seringa de 30 ml com água destilada. A ponta da agulha é embotada (usando um arquivo de metal), a fim de evitar danos para o objectivo. </li></ol> 2. Anestesia Rato <ol><li> Um rato é anestesiado com uma mistura de cetamina (10 mg / ml) e xilazina (2 mg / ml), administrada por via intraperitoneal na dose de 8 ul por grama de peso corporal do rato. A sedação ocorre dentro de 3 - 6 min e não deve impedir a respiração espontânea. </li><li> Usando um barbeador elétrico, fazer a barbada garganta, tórax, abdômen, e do lado direito do rato. </li><li> Usando a fita, prenda o mouse para uma placa fina de plástico de corte. A cabeça do rato deve apontar para o operador (Figura 3). Tensão suave proporcionada por um laço de sutura que passa por baixo dos dentes superiores serve para manter a extensão da cabeça. A placa de corte é colocada sobre uma almofada de aquecimento, mantendo euthermia mouse durante traqueostomia e colocação de cateter venoso. </li><li> Áreas molhadas raspadas com 100% de etanol. </li><li> Confirme anestesia adequada com uma pitada de cauda / pata. Proceder se resposta mínima, fornecer um bolus extra de cetamina / xilazina se não forem adequadamente anestesiado. </li></ol> 3. Traqueostomia <ol><li> Uma incisão de 1 cm é feita ao longo da garganta. Tecido conjuntivo subjacente é dissecado, e as glândulas salivares são separados e reflete lateralmente. O músculo esterno imediatamente anterior à traquéia é ressecado. </li><li> Um laço de sutura 04:00 é avançado em poe traqueia (Figura 4). O ciclo é então cortada, criando duas cadeias separadas de sutura subjacentes à traqueia. A sutura de caudal irá ser utilizado para fixar o tubo de traqueostomia; sutura craniana vai ser usado para fornecer a tensão na traqueia, durante a colocação de traqueostomia. </li><li> Usando dois dedos, a sutura superior é agarrada e a tensão é aplicada uma ligeira à traqueia. Uma incisão é feita na horizontal da traqueia superior entre as suturas e inferiores. Esta incisão deve atravessar aproximadamente dois terços da circunferência traqueal. Um tubo de traqueostomia de arrastamento (Harvard Apparatus, 1,22 mm de diâmetro exterior) é inserido na traqueia distal e fixada no lugar através do fio de sutura caudal traqueal. </li><li> A traqueostomia é ligado a um ventilador de animais controlada a volume pequeno (Inspira, Harvard Apparatus), e que o mouse é ventilado com 40% de oxigênio inspirado e 9 ml / kg de volume corrente (configurações otimizadas para manter a oxigenação adequada / ventilação em nosso laboratório). PosiA pressão expiratória final positiva (PEEP) não é iniciada neste ponto. De nota, o ventilador deve ser otimizada para condições únicas dentro dos laboratórios individuais. Diferentes comprimentos de tubagem redundante (interposta entre o tubo do ventilador conector Y e traqueostomia) pode ser usada para ajustar o espaço morto, garantindo ventilação alveolar estável para qualquer volume escolhido de maré. </li></ol> 4. Cateterismo Venoso <ol><li> A junção da veia jugular interna e externa podem ser identificadas através de rastreamento ramos venosos distais proximalmente. A jugular externa é encontrado debaixo das glândulas salivares refletidas, o que pode ser rastreada proximalmente para encontrar a junção externo-interno jugular. </li><li> Use dissecção romba suave para separar a junção jugular do tecido circundante conjuntivo. </li><li> Com suturas 04:00, amarrar as jugular externa e interna das veias jugulares distais (cranial) para a junção jugular. </li><li> Faça uma incisão pequena no carinada junção jugular; sangramento deve ser mínima. </li><li> Dois cateteres podem ser incrementalmente avançado através da incisão e para dentro do tronco jugular. Após a aspiração suave para garantir o retorno do sangue, cateteres são assegurada na veia com suturas 04:00. </li><li> Fita cateteres venosos para a placa de corte para prevenir contra o deslocamento acidental. </li></ol> 5. Intravital Rato Cirurgia Microscopia Lung (adaptado de Tabuchi et al. 18) <ol><li> A placa de corte (contendo o rato anestesiado contido bem como cateteres venosos gravadas) é transferida para o estágio de microscopia intravital, em que as intervenções cirúrgicas restantes será executada. Uma sonda de temperatura retal é colocado; esta interface com um sistema de aquecimento adaptativo (localizado sob a placa de corte), permitindo a manutenção de euthermia mouse. </li><li> Um cateter venoso jugular está ligado a uma bomba de seringa, que proporciona uma mistura de cetamina (10 mg / ml), xilazina (2 mg / ml)mistura à temperatura de 200 ul por hora. Anestesia adequada é novamente confirmado usando a cauda / pata pitada. </li><li> A incisão é estendida a partir do pescoço ao processo xifóide, em seguida, proceder-se lateralmente para o lado direito (Figura 5). </li><li> Usando a electrocauterização, a musculatura do peito é removida, expondo a caixa torácica. Toma-se cuidado para garantir a hemostase completa. </li><li> Atravesse garupa direito do rato sobre o lado esquerdo e fita para baixo. A torção, resultante do tórax abdominal gira ligeiramente, melhorando a facilidade da operação. </li><li> Coloque a fase em um ângulo de 45 graus (Figura 6), o que permite o posicionamento do pulmão para cair para fora da parede do peito quando o pneumotórax é induzida. </li><li> A 1 ª costela (costela mais inferior) é apreendido com pinça e levantou; uma pinça curva é bruscamente empurrado por baixo da costela. Isto separa pleura parietal da parede torácica. A pleura deve permanecer unpunctured. </li><li> Usando o tubo de sopro euma seringa, o ar é introduzido à força contra a pleura parietal. Isto leva a ruptura da superfície pleural e pneumotórax, sem danificar o pulmão subjacente. O pulmão subjacente cair fora da parede torácica, o que permite a introdução de uma pinça de eletrocautério sem danificar o pulmão. Uma diminuição no volume tidal ventilador não é normalmente necessário durante este passo. </li><li> Utilizando uma pinça eletrocautério, dissecar o peito musculatura da parede e corte pelas 5 ª e 6 ª costelas / pleura parietal, fazendo um buraco ~ 8 milímetros circular na parede torácica. É essencial que a hemostase completa seja mantida, tal como a presença de hemorragia irá obscurecer microscopia (Figura 7). </li><li> Utilizando um controlador de agulha, inserir o tubo de toracostomia no orifício da parede torácica. A agulha deve perfurar a parede do peito e sair da cavidade torácica inferior e lateral para a janela torácica (Figura 7). Tome cuidado para evitar a perfuração do diafragma. Otubo é então delicadamente puxado para fora da parede da caixa, até que a resistência ocorre a partir do fio de sutura &quot;rolha&quot;, localizado na extremidade da porção do tubo fenestrado. </li><li> Coloque a fase plana. </li><li> Adicione 3 cm H 2 O PEEP ao ventilador para ajudar a ajudar reexpansão pulmonar. </li><li> Cola (Pattex gel, Henkel) é colocada circunferencialmente em torno da janela de peito. A membrana é ligada, com a lamela de vidro voltado para o exterior da cavidade torácica. Cuidadosamente (e circunferencialmente) aproximada da membrana para a cola usando um aplicador de algodão. </li><li> Durante a realização de uma manobra de recrutamento do pulmão (3 volumes correntes durante a qual a porta é obstruída ventilador PEEP), -3 mm Hg sucção é aplicada ao tubo de peito. O pulmão deve persistentemente aproximada da membrana, enquanto movendo-se livremente, durante a ventilação de ar corrente (Figura 8). </li><li> A pata dianteira direita do rato é cruzado para o lado esquerdo, o que resulta numa posição de decúbito lateral esquerdo do rato.Cunhas de esponja pode ser utilizado para posicionar devidamente o rato para a janela do peito está alinhado com a objectiva de imersão em água a microscopia. </li><li> A água destilada é colocada sobre a lâmina de cobertura antes de microscopia, permitindo a visualização do pulmão utilizando uma objectiva de imersão em água. Água terá de ser reabastecido intermitentemente ao longo da imagem latente. </li></ol> 6. Medição da Espessura da camada endotelial da superfície pulmonar <ol><li> Imediatamente após o fechamento da parede torácica, 500 ul de FITC-dextrano 150 kDa marcado (solução a 6% em PBS) é administrada através do cateter venoso segunda (não-anestesia) jugular. Isto serve como bolus ressuscitação de volume, bem como o marcador vascular para ESL medição. O bolus dextrano não influencia a adesão de neutrófilos ou a formação de edema pulmonar 2. </li><li> O objetivo imersão em água está centrada sobre a lamínula. A escolha do objetivo é essencial para visualizar pequenas diferenças na espessura ESL, um elevado numerical abertura é necessário (&gt; 0,8) e ainda manter um 2-3 mm de distância de trabalho (que permite a penetração através da janela de pulmão e superfície pleural). Usamos a Nikon CFI 75 LWD 16x (NA 0,8) e CFI 75 LWD 25x (NA 1.1) objetivos para esta finalidade. </li><li> Para medir com precisão o AEP espessura em um órgão móvel, é essencial que as larguras de campo claro e fluorescentes vasculares são realizadas simultaneamente. Isto pode ser conseguido utilizando um divisor de imagem (Dual View, Photometrics), que permite a captação simultânea de luz reflectida de contraste de interferência diferencial (DIC, campo claro) e imagens de FITC (Figura 9). </li><li> Durante a 5 seg pausa inspiratória, imagem contínua é realizada e gravada. Mais tarde, estas imagens podem ser revistos para identificar em foco quadros. </li><li> Usando um em foco-frame, microvasos subpleural (&lt;20 um de diâmetro) são identificados, pelo menos três microvasos são normalmente encontrados em um único frame. Depois de terminada a experiência, DICe larguras de FITC-dextrano vasculares são medidos (por um observador cego) calculando a média dos comprimentos das três intercepta perpendiculares por microvascular. Assumindo espessura ESL igual em ambas as extremidades do navio, o tamanho ESL pode ser definida por um-metade da diferença entre as larguras de DIC e FITC-dextrano vasculares, tal como descrito na secção de resultados representativos. </li><li> Tipicamente, microscopia intravital pode ser realizada por&gt; 90 min, sem qualquer evidência de lesão pulmonar ou hipotensão 2. Experiências preliminares devem ser realizados para confirmar a estabilidade do rato (pressão arterial, a oxigenação, a ventilação, a lesão pulmonar), durante o período de observação. Drogas experimentais, pode ser introduzido através do segundo cateter (não-anestésico) jugular em qualquer momento durante o procedimento. </li></ol> 7. Medição alternativa da integridade da camada endotelial superfície pulmonar As funções da camada endoteliais intactas de superfície (em parte) para excluir ciring elementos do 2 superfície endotelial. Integridade ESL pode, portanto, ser medida pela capacidade de um elemento circular (por exemplo, uma microesfera fluorescente), para aceder e interagir com as moléculas de adesão da superfície celular (por exemplo, ICAM-1). <ol><li> Anti-ICAM-1 marcado microesferas fluorescentes são preparados antes da cirurgia. Revestidas com estreptavidina 0,97 uM microesferas fluorescentes são incubados com anticorpo biotinilado de controlo de isotipo ou anti-ICAM-1 (clone YN1/1.7.4, 1:50, eBioscience) durante 30 min à temperatura ambiente. As microesferas são lavadas por três vezes e suspensas em PBS a 1 x 10 9 microesferas por ml. </li><li> Durante a microscopia intravital, a suspensão de microsferas (100 uL) é injectado para dentro do cateter da veia jugular. Após 15 minutos de circulação, as imagens fluorescentes foram capturadas ao longo de 5 min. Microesferas imóvel por&gt; 5 minutos são considerados aderentes e quantificadas usando o software de processamento de imagem. </li></ol> 8. Eutanásia &lt;classe p = &quot;jove_content&quot;&gt; Após a conclusão do procedimento, os ratos anestesiados são sacrificados por exsanguinação por punção cardíaca directa. A eutanásia é confirmado através de pneumotórax bilateral, após o que os pulmões são colhidas e snap-congelado para posterior análise.

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Não há conflitos de interesse declarados.

Coincidente com a crescente utilização de microscopia em vivo, não há reconhecimento crescente de tanto o tamanho substancial do ESL, bem como as suas numerosas contribuições para a função vascular. Estes dados emergentes, no entanto, são principalmente derivados de estudos do sistema vascular sistémica. Na verdade, o uso de em microscopia vivo no pulmão é tecnicamente desafiador, dado artefato movimento significativo pulmonar e cardíaca. Vários últi...

O glycocalyx é uma camada endotelial extracelular de proteoglicanos e glicosaminoglicanos associados que revestem a íntima vascular. In vivo, o glycocalyx é altamente hidratada, formando uma camada superficial substancial endotelial (ESL) que regula várias funções endoteliais incluindo a permeabilidade do fluido 1, neutrófilos endotelial adesão 2, e a tensão de 3 mecanotransdução fluido de cisalhamento. Historicamente, tem sido o glicocálice underappreciated devido à sua aberrance em preparações de células de cultura 4, 5 e a sua degradação durante a fixação do tecido normal e de processamento 6. O uso crescente de 7 microscopia intravital (em microscopia vivo, IVM) coincidiu com elevado interesse científico na importância do ESL para a função vascular durante a saúde e na doença. O ESL é invisível para microscopia de luz e não pode ser facilmente rotulado devivo, dada a propensão do glicocálice fluorescentes de ligação de lectinas para provocar a aglutinação de glóbulos vermelhos 8 e embolia pulmonar fatal (observações não publicadas). Várias abordagens indiretas, por isso, foi desenvolvido para deduzir ESL espessura (e, por extensão, a integridade glicocálice), não-móveis leitos vasculares, como os microcirculations cremastérico e mesentérica. Estas técnicas incluem a medição de diferenças de velocidade de circulação de micropartículas como uma função da distância a partir da membrana endotelial (velocimetria de micropartículas imagem 9), bem como a medição da exclusão de volumosos, fluorescentemente marcadas com marcadores vasculares (por exemplo, dextranos), a partir da superfície endotelial (técnica de exclusão de dextrano 10, 11). Destas técnicas, apenas a exclusão de dextrano é capaz de estimar a espessura ESL partir de medições feitas em um único ponto no tempo. Ao medir simultaneamente larguras vasculares utilizando microscopia de campo claro (a largura emclusive do &quot;invisível&quot; ESL) e microscopia de fluorescência de um marcador vascular excluídos do ESL, ESL espessura pode ser calculada como a metade da diferença entre as larguras vasculares 2. O uso de uma medida instantânea de espessura ESL é bem adequado para o estudo do glicocálice pulmonar. Microscopia intravital do pulmão é um desafio, dado artefato movimento significativo pulmonar e cardíaca. Embora os avanços recentes permitem a imobilização dos pulmões do rato, in vivo 12, 13, existam preocupações quanto ao impacto fisiológico do pulmão estase. Imobilidade pulmonar está associado com o óxido nítrico endotelial diminuiu de sinalização 14, uma via de sinalização que afeta tanto a adesão de neutrófilos e lesão pulmonar 15 16. Além disso, a imobilização de uma área de pulmão expõe circundante alvéolos móveis prejudiciais forças de cisalhamento (o chamado &quot;atelectrauma&quot;), de acordo com os conceitos clássicos fisiológicosinterdependência alveolar 17. Em 2008, Arata Tabuchi, Wolfgang Kuebler e seus colegas desenvolveram uma técnica cirúrgica que permite microscopia intravital de um pulmão de rato livremente em movimento 18. Artefato respiratória decorrente desta técnica pode ser negada pela utilização de imagens em alta velocidade, incluindo a medição simultânea de campo claro e microscopia de fluorescência. Neste relatório, como pormenor, a exclusão de imagem instantânea de dextrano pode ser utilizado para medir a espessura ESL na microcirculação subpleural do pulmão do rato livremente movendo, in vivo. Esta técnica pode ser facilmente modificado para determinar a função glicocálice, especificamente, a capacidade de um intacto ESL para excluir circulante elementos a partir da superfície endotelial. Recentemente temos usado essas técnicas para determinar a importância da integridade ESL pulmonar para o desenvolvimento de lesão pulmonar aguda durante as doenças inflamatórias sistémicas tais como sépsis 2.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Nome do reagente </td></tr><tr><td> FITC-dextrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> FD150S </td><td></td></tr><tr><td> TRITC-dextrano (150 kDa) </td><td> Sigma </td><td> T1287 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina revestida microesferas fluorescentes </td><td> Bangs Laboratories </td><td> CP01F/10428 </td><td> Dragão Verde fluorescência (semelhante a FITC) </td></tr><tr><td> Cetamina </td><td> Moore Médica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Moore Médica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anti-ICAM-1 anticorpo biotinilado </td><td> eBioscience </td><td> Clonar YN1/1.7.4 </td><td> Diluição 1:50 </td></tr><tr><td> Isotipo de anticorpo biotinilado </td><td> eBioscience </td><td> IgG2b eB149/10H5 </td><td> Diluição 1:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPAMENTOS </td></tr><tr><td> Ventilador mecânico </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Inspira </td><td></td></tr><tr><td> Cateter traqueostomia </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 730028 </td><td></td></tr><tr><td> Aparelho de eletrocautério </td><td> DRE Médica </td><td> Valleylab SSE-2L </td><td></td></tr><tr><td> Cautério bipolar fórceps </td><td> Olsen Medical </td><td> 10-1200I </td><td> 9,9 centímetros McPherson </td></tr><tr><td> Temperatura control sistema </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> ATC1000 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de seringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Elite bomba 11 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio (campo amplo) </td><td> Nikon </td><td> LV-150 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio (confocal) </td><td> Nikon </td><td> A1R </td><td></td></tr><tr><td> Image Splitter </td><td> Fotometria </td><td> DV2 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera CCD </td><td> Fotometria </td><td> CoolSNAP HQ2 </td><td></td></tr><tr><td> Software de processamento de imagem </td><td> Nikon </td><td> Elementos NIS </td><td></td></tr><tr><td> Membrana de polivinilideno </td><td> Kure Wrap </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lamela circular </td><td> Bélico </td><td> 5CIR-1-BEL </td><td> 5 mm, # 1 espessura </td></tr><tr><td> Cola (tampa de deslizamento de membrana) </td><td> Pattex </td><td> Flussig (líquido) </td><td> Para a aposição lamínula à membrana </td></tr><tr><td> Cola (tampa de deslizamento de mouse) </td><td> Pattex </td><td> Gel </td><td> Para a fixação da membrana de rato </td></tr><tr><td> Tubo cirúrgico </td><td> Intramedic </td><td> PE50, PE10 </td><td></td></tr><tr><td> Suture </td><td> Pescador </td><td></td><td> 04:00 seda </td></tr><tr><td> Barbeador elétrico </td><td> Oster </td><td> 78997 </td><td></td></tr><tr><td> Curvas pinça cirúrgica </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Retas pinça cirúrgica </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tesouras cirúrgicas </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microtesoura cirúrgicos </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Motorista agulha cirúrgica </td><td> Roboz </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fita cirúrgica </td><td> Pescador </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Esponjas de cozinha (cortadas em fatias) </td><td> vário </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo measurement of the mouse pulmonary endothelial surface layer

O glycocalyx é uma camada endotelial de proteoglicanos e glicosaminoglicanos associados que revestem o lúmen vascular. In vivo, o glycocalyx é altamente hidratada, formando uma camada superficial substancial endotelial (ESL), que contribui para a manutenção da função endotelial. À medida que o glicocálice endotelial é muitas vezes aberrante in vitro e é perdida durante as técnicas de fixação de tecidos normais, o estudo do ESL requer o uso de microscopia intravital. Para melhor a fisiologia do complexo aproximado da microvasculatura alveolar, imagens intravital pulmonar está idealmente realizada em um pulmão livremente movimento. Estas preparações, no entanto, geralmente sofrem de artefacto de movimento extensivo. Demonstramos como de tórax fechado de microscopia intravital de um pulmão de rato livremente móvel pode ser usado para medir a integridade glicocálice via ESL exclusão de fluorescentemente marcadas com dextranos de elevado peso molecular a partir da superfície endotelial. Esta técnica não-recuperação cirúrgica, que requerbrightfield simultânea e de imagem de fluorescência do pulmão do rato, permite a observação longitudinal da microvasculatura subpleural sem evidência de induzir lesão pulmonar confusão.

A abordagem experimental descrito nos passos 1-6 permite a captura de quadros múltiplos de DIC simultânea (campo claro) e as imagens fluorescentes. Para determinar a espessura da ESL, imagens gravadas são analisadas por um observador cego, após conclusão do protocolo experimental. Usando uma moldura de focagem, microvasos subpleural (&lt;20 um de diâmetro) são identificados; pelo menos 3 microvasos são normalmente encontrados numa estrutura única (Figura 10). Usando o software de análise de im...

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In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

A camada de superfície endotelial glicocálice / endotelial está idealmente estudada por microscopia intravital. Microscopia intravital é tecnicamente desafiante em um órgão em movimento, tais como o pulmão. Demonstramos como brightfield simultânea e microscopia de fluorescência pode ser utilizado para estimar a espessura da camada endotelial da superfície em um movimento livremente<em&gt; In vivo</em&gt; Pulmão do rato.

Na medição in vivo da camada superficial do rato pulmonar endotelial

The endothelial glycocalyx is a layer of proteoglycans and associated glycosaminoglycans lining the vascular lumen. In vivo, the glycocalyx is highly ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

In vivo Measurement of the Mouse Pulmonary Endothelial Surface Layer

14.5K visualizações.  University of Colorado School of Medicine. A camada de superfície endotelial glicocálice / endotelial está idealmente estudada por microscopia intravital. Microscopia intravital é tecnicamente desafiante em um órgão em movimento, tais como o pulmão. Demonstramos como brightfield simultânea e microscopia de fluorescência pode ser utilizado para estimar a espessura da camada endotelial da superfície em um movimento livremente In vivo Pulmão do rato.

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Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

Angiogênese no pulmão de rato Isquêmica

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

Medicina

Automated Measurement of Microcirculatory Blood Flow Velocity in Pulmonary Metastases of Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. However, very few methods exist to date to investigate lung metastases in a dynamic fashion at the microcirculatory level, due to the difficulty to access the lung with a microscope. Here, an intravital microscopy method is presented to functionally image and quantify the microcirculation of superficial pulmonary metastases in rats, using a closed-chest pulmonary window and automated analysis of blood flow velocity and direction. The utility of this method is demonstrated to measure increases in blood flow velocity in response to pharmacological intervention, and to image the well-known tortuous vasculature of solid tumors. This is the first demonstration of intravital microscopy on pulmonary metastases in a closed-chest model. Because of its minimized invasiveness, as well as due to its relative ease and practicality, this technology has the potential to experience widespread use in laboratories that specialize on pulmonary tumor research.

A method is presented to measure microcirculatory blood flow velocity in pulmonary cancer metastases of the pleural surface in rats in an automated fashion, using closed-chest pulmonary intravital microscopy. This model has potential to be used as a widespread tool to perform physiologic research on pulmonary metastases in rodents.

Automated Medição da microcirculação sanguínea velocidade na Pulmonar Metástases of Rats

Because the lung is a major target organ of metastatic disease, animal models to study the physiology of pulmonary metastases are of great importance. ...

Automated Measurement of Pulmonary Emphysema and Small Airway Remodeling in Cigarette Smoke-exposed Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1). Animal models of COPD are used to identify molecules that contribute to the disease process and to test the efficacy of novel therapies for COPD. Researchers use a number of models of COPD employing different species including rodents, guinea-pigs, rabbits, and dogs(2). However, the most widely-used model is that in which mice are exposed to cigarette smoke. Mice are an especially useful species in which to model COPD because their genome can readily be manipulated to generate animals that are either deficient in, or over-express individual proteins. Studies of gene-targeted mice that have been exposed to cigarette smoke have provided valuable information about the contributions of individual molecules to different lung pathologies in COPD(3-5). Most studies have focused on pathways involved in emphysema development which contributes to the airflow obstruction that is characteristic of COPD. However, small airway fibrosis also contributes significantly to airflow obstruction in human COPD patients(6), but much less is known about the pathogenesis of this lesion in smoke-exposed animals. To address this knowledge gap, this protocol quantifies both emphysema development and small airway fibrosis in smoke-exposed mice. This protocol exposes mice to CS using a whole-body exposure technique, then measures respiratory mechanics in the mice, inflates the lungs of mice to a standard pressure, and fixes the lungs in formalin. The researcher then stains the lung sections with either Gill&#8217;s stain to measure the mean alveolar chord length (as a readout of emphysema severity) or Masson&#8217;s trichrome stain to measure deposition of extracellular matrix (ECM) proteins around small airways (as a readout of small airway fibrosis). Studies of the effects of molecular pathways on both of these lung pathologies will lead to a better understanding of the pathogenesis of COPD.

The goal of this protocol is to provide automated methods to quantify chronic lung pathologies in a murine model of COPD. The protocol includes exposing mice to cigarette smoke (CS), measuring pulmonary function, inflating the lungs, and using morphometry methods to measure emphysema and small airway remodeling in mice.

Automáticos de medição de enfisema pulmonar e das vias aéreas pequenas Reformas em cigarro expostas ao fumo Mice

COPD is projected to be the third most common cause of mortality world-wide by 2020(1).  Animal models of COPD are used to identify molecules that ...

Measurement of the Pressure-volume Curve in Mouse Lungs

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential phenotypic changes are best assessed by measurement of the changes in lung elasticity. To best understand specific mechanisms underlying such pathologies in mice, it is essential to make functional measurements that can reflect the developing pathology. Although there are many ways to measure elasticity, the classical method is that of the total lung pressure-volume (PV) curve done over the whole range of lung volumes. This measurement has been made on adult lungs from nearly all mammalian species dating back almost 100 years, and such PV curves also played a major role in the discovery and understanding of the function of pulmonary surfactant in fetal lung development. Unfortunately, such total PV curves have not been widely reported in the mouse, despite the fact that they can provide useful information on the macroscopic effects of structural changes in the lung. Although partial PV curves measuring just the changes in lung volume are sometimes reported, without a measure of absolute volume, the nonlinear nature of the total PV curve makes these partial ones very difficult to interpret. In the present study, we describe a standardized way to measure the total PV curve. We have then tested the ability of these curves to detect changes in mouse lung structure in two common lung pathologies, emphysema and fibrosis. Results showed significant changes in several variables consistent with expected structural changes with these pathologies. This measurement of the lung PV curve in mice thus provides a straightforward means to monitor the progression of the pathophysiologic changes over time and the potential effect of therapeutic procedures.

Here we present a protocol to simply and reliably measure the lung pressure-volume curve in mice, showing that it is sufficiently sensitive to detect phenotypic parenchymal changes in two common lung pathologies, pulmonary fibrosis and emphysema. This metric provides a means to quantify the lung&#8217;s structural changes with developing pathology.

Medição da curva pressão-volume no mouse Lungs

In recent decades the mouse has become the primary animal model of a variety of lung diseases. In models of emphysema or fibrosis, the essential ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetria Intrauterine medir Rato contrátil Pressão<em&gt; In Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse models of lung cancer are being used to study the mechanism of cancer development and to experiment with various therapeutic strategies. However, the absence of a real-time technique to identify the development of tumor nodules in mice lungs and to monitor the changes in their size in response to various experimental and therapeutic interventions hampers the ability to obtain an accurate description of the course of the disease and its timely response to treatments. In this study, a method using a micro-computed tomography (CT) scanner for the detection of the development of lung tumors in a mouse model of lung adenocarcinoma is described. Next, we show that monthly follow-up with micro-CT can identify dynamic changes in the lung tumor, such as the appearance of additional nodules, increase in the size of previously detected nodules, and decrease in the size or complete resolution of nodules in response to treatment. Finally, the accuracy of this real-time assessment method was confirmed with end-point histological quantification. This technique paves the way for planning and conducting more complex experiments on lung cancer animal models, and it enables us to better understand the mechanisms of carcinogenesis and the effects of different treatment modalities while saving time and resources.

We describe a method for the detection of tumor nodule development in the lungs of an adenocarcinoma mouse model using micro-computed tomography and its use for monitoring changes in nodule size over time and in response to treatment. The accuracy of the assessment was confirmed with end-point histological quantification.

Usando tomografia Micro-computadas para a avaliação do desenvolvimento do tumor e Acompanhamento da resposta ao tratamento em um modelo do rato do cancro do pulmão

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depleção de células do rato de xenoenxertos de tumor humano Melhora Significativamente Análise Downstream de células alvo

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ultimately lead to new knowledge concerning the causes of or new ways to inhibit or treat plasma extravasation. It is important that researchers have the proper tools, including the best methods available, for studying plasma extravasation. In this article, we describe a protocol, using the Evans blue dye method, for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice. This protocol is intentionally simple, to as great a degree as possible, but provides high quality data. Evans blue dye has been chosen primarily because it is easy for the average laboratory to use. We have used this protocol to provide evidence and support for the hypothesis that the enzyme neprilysin may protect the vasculature against plasma extravasation. However, this protocol may be experimentally used and easily adapted for use in other strains of mice or in other species, in many different organs or tissues, for studies which may involve other factors that are important in understanding, preventing, or treating plasma extravasation. This protocol has been extensively optimized and modified from existing protocols, and combines reliability, ease of use, economy, and general availability of materials and equipment, making this protocol superior for the average laboratory to use in quantifying plasma extravasation from organs.

In this article, an economical, optimized, and simple protocol is described which uses the Evans blue dye method for assessing plasma extravasation in the organs of FVBN mice that can be adapted for use in other strains, species, and other organs or tissues.

Um otimizado Evans Blue protocolo para avaliar vazamento Vascular no Mouse

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

Left Atrial Stenosis Induced Pulmonary Venous Arterialization and Group 2 Pulmonary Hypertension in Rat

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of group 2 PH, due to mitral stenosis (MS), to facilitate the investigation of disease mechanisms and potential therapeutic strategies. We present a novel rat model of pulmonary venous congestion-induced pulmonary venous arterialization and group 2 PH caused by left atrial stenosis (LAS). LAS is achieved by constricting the left atrium using a half-closed titanium clip. After the LAS surgery, a rat model with a transmitral inflow velocity greater than or equal to 2.0 m/s on echocardiography gradually develops pulmonary venous arterialization and group 2 PH over an 8- to 10-week period. In this protocol, we provide the step-by-step procedure of how to perform the LAS surgery. The presented LAS rat model mimics MS in humans and is useful for studying the underlying molecular mechanism of pulmonary venous arterialization and for the preclinical evaluation of therapies for group 2 PH.

Left atrial stenosis (LAS) is a novel surgical technique used for studying group 2 pulmonary hypertension (PH) and mechanisms underlying pulmonary venous arterialization. Here, we present a protocol to constrict the left atrium using a titanium clip to cause pulmonary venous arterialization and moderate PH in a rat.

Estenose Atrial Esquerdo induzida Arterialization venoso pulmonar e hipertensão pulmonar do grupo 2 no rato

The mechanism of mitral stenosis-induced pulmonary venous arterialization and group 2 pulmonary hypertension (PH) is unclear. There is no rodent model of ...