Agradecemos a membros do laboratório Mariani ajuda a edição do protocolo. Este trabalho foi financiado por uma CIRM Postdoctoral Formação Grant (JLF), um estágio CIRM PONTES (TZTT), o Robert E. e R. May Wright Foundation (FVM), e da Universidade do Sul da Califórnia (FVM).

1. Coloração Lyso Tracker de embriões de camundongos <ol><li> Gerar embriões de ratos, colocando jovens (5-6 semanas de idade) fêmeas em gaiolas do parafuso prisioneiro do sexo masculino. Monitorar nas manhãs seguintes para o aparecimento de um rolhão vaginal indicando que o acasalamento ocorreu. Se a mulher está grávida, meio-dia em que dia é chamado de 0,5 dpc (dias coito post). O procedimento aqui apresentado é ideal para embriões 7-13 DPC. </li><li> No dia embrionário de interesse, a eutanásia fêmea de acordo com os protocolos aprovados e remover o útero. Remoção dos embriões a partir da decidua em uma placa de 10 cm de Petri com Hanks BSS (sem vermelho de fenol). Remover as membranas extra-embrionárias e que pelo menos uma lavagem com Hanks BSS para remover tecidos estranhos e sangue. </li><li> Prepare Lyso Tracker solução de coloração Embrião (5 Lyso Tracker mM em Hanks BSS). Um volume conveniente para 1-2 litros é de 5 ml. Misture delicadamente para desembolsar o corante uniformemente. </li><li> Adicionar embriões para o solut coloração Lyso Tracker Embriãoion em um tubo de microcentrífuga ou frasco e incubar a 37 ° C durante 45 min. </li><li> Enxágüe muito delicadamente em Hanks BSS quatro vezes, 5 min cada lavagem. </li><li> Fixar em paraformaldeído 4% durante a noite. </li><li> Enxaguar uma vez em Hanks BSS, 10 min, para remover a solução. </li><li> Desidratar através de uma série de metanol (50%, 75%, 80%, 100%, 5 min cada passo) para eliminar a coloração de fundo. Isto é importante para alcançar um bom sinal-para-ruído de imagem durante a. </li><li> Neste ponto, é possível armazenar as amostras de embrião indefinidamente em metanol à temperatura de -20 ° C, protegida da luz. </li></ol> Nota: Uma amostra de tecido pode ser tomada em qualquer passo para a genotipagem de DNA, no entanto, pode ser mais conveniente para retirar uma amostra imediatamente antes de armazenamento, de modo que até esta etapa todas as amostras podem ser processadas em lotes. Recolher uma amostra de tecido a partir da cauda, ​​membros, ou a cabeça de cada embrião e colocar tudo em tubos separados. Hidratar a amostra de tecido e se preparar para genotyping. 2. Coloração Lyso Tracker de diferenciar culturas ES <ol><li> Preparar corpos embrióides através da suspensão da gota Método 15, com uma densidade inicial de 500 células por 20 ul de gota. </li><li> Após 3 dias, transferir os corpos embrióides de cultura em suspensão em 10 centímetros não aderentes pratos de Petri (isto é, aqueles utilizados para o trabalho bacteriológica). Cultura por 5 dias, mudando os meios de comunicação a cada 2 dias. </li><li> No dia 7, transferir os corpos embrióides de lâminas gelatinizadas oito poços de câmara (adicionar 0,1% de gelatina para as câmaras, espere 5 minutos, remover e adicionar mídia). Transferência 1-2 corpos embrióides por câmara. </li><li> Cultura por 10 dias, mudando de mídia todos os dias. Ter o cuidado de colocar a pipeta no canto da lâmina de câmara de modo a não perturbar o corpo embryoid fixação à superfície de vidro. Além disso, quando a adição de meio fresco também colocar a pipeta no canto da câmara, e soltar o material lentamente. </li><li> Após 10 dias de cultoure, para induzir a apoptose, como controlo positivo, tratar alguns dos poços com 0,1 mM e 1,0 mM de H 2 O 2 (adicionar o H 2 O 2 para meios frescos, mistura, em seguida, adicionar às células) durante 60 min. Lavar duas vezes com D-PBS durante a noite e a cultura em meios normais. </li><li> Aspirar cuidadosamente meios existentes e adicionar Lyso Tracker solução de coloração celular (500 Lyso Tracker nM (concentração final), em media, 300 ul por câmara). </li><li> Incubar a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Lavar duas vezes com 2 vezes D-PBS, 5 min cada. </li><li> Fixar em paraformaldeído a 4% durante 15 min a RT. </li><li> Lavar duas vezes com D-PBS, 5 min. </li></ol> 3. Visualizando Embriões Lyso Tracker manchados ou culturas ES <ol><li> Preparar as amostras de células para microscopia aspirando o D-PBS; remover a câmara fora do slide, secagem ao ar durante cerca de 5 min, e em seguida a adição de um meio aquoso de montagem (Vectashield com DAPI ou similar). Coloque uma folha de barreira, enquanto drying para diminuir o branqueamento do fluoróforo. Monte embriões em um prato de vidro depressão profunda ou placa de Petri pequena Vectashield ou similar. </li><li> Visualizar com um microscópio de dissecção ou composto equipado com uma rodamina ou vermelho Texas filtro (Lyso Tracker RED DND-99, excitação / emissão: 577/590 nm). A coloração é tipicamente muito brilhante para longas exposições normalmente não são necessário. </li></ol> 4. Quantificação dos resultados usando técnicas de imagem <ol><li> Tire fotos digitais de suas amostras nas condições de exposição mesmo em modo manual. </li><li> Abra as imagens no Adobe Photoshop ou um programa de imagem semelhante. Para determinar a quantidade de coloração de Lyso Tracker, seleccionar o canal vermelho e do limiar da imagem (converte a imagem em preto e branco) de tal forma que a coloração vermelha é agora representado por pixels brancos. Seleccionar os pixels brancos, e utilizar a função de histograma para obter a contagem total. </li><li> Use o canal azul para contaro número de núcleos no campo. Ele pode ser útil para manter um registro da contagem, anotando a imagem. </li><li> Registre os valores e calcular o nível de coloração média por celular. Repita esta análise com a configuração de limite mesmo para todas as imagens que pretende provar. </li></ol> 5. Resultados representativos Há um padrão normal de PCD durante o desenvolvimento embrionário, que pode mudar quando um gene do factor de crescimento, tal como o Sonic hedgehog (Shh), é removido 16,17. Uma vez que é um corante Lyso Tracker pequena molécula que é altamente difusível, o embrião inteiro pode ser visualizado para avaliar as áreas de PCD mesmo profundamente dentro do mesênquima 12,13 A Figura 1 mostra o padrão de coloração para Lyso Tracker normais e Shh -. / - Embriões de ratos mutantes no 10.5dpc. Nesta fase, PCD é grandemente aumentada em Shh - / - embriões mutantes, particularmente no membro e regio somitons. Partes do embrião pode ser trabalhada em toda montagem em maior ampliação (1B) para avaliar o padrão global. Porções dissecadas também pode ser seccionado em micrótomo vibrando (1C) ou um criostato (DF) para revelar as regiões de PCD em maior detalhe. Análise TUNEL é melhor feita em secções finas em que a penetração da transferase terminal é menos problemático. Coloração Lyso Tracker e um ensaio de TUNEL pode ser feita no mesmo tecido (Figura 1D-G). Estes resultados mostram que, apesar de não existir uma correlação estreita entre 01:01 e Lyso Tracker coloração TUNEL, as regiões de sobreposição gerais PCD consideravelmente. Numa ampliação mais elevada, é possível ver que puncta coloração positiva com o ensaio de TUNEL, mas não com o corante Lyso Tracker, puncta que mancha única com o corante Lyso Tracker, e que se sobrepõem puncta coloração. Quando uma EB é chapeada sobre uma superfície revestida de gelatina, as células diferenciam irá migrate para fora. Após 10 dias de cultura, as células foram diferenciadas em uma variedade de tipos de células incluindo neurónios, células musculares, e cardiomiócitos. As culturas apresentadas na Figura 2 contêm populações mistas destes tipos de células, no entanto pode-se adaptar a protocolo para estudar a CPD de um determinado tipo de células de interesse. Por exemplo, a EB pode ser tratado com ácido retinóico para melhorar a diferenciação de neurónios 19, e, em seguida, o ensaio de Lyso Tracker poderia ser utilizado para avaliar a morte de células neuronais em diferentes condições. Na cultura normal de células ES diferenciadas, existem algumas células que passam por PCD e estes podem ser detectados com Lyso Tracker e / ou ensaios de TUNEL (Figura 2A). PCD pode ser induzida por um número de diferentes agentes citotóxicos, tais como o peróxido de hidrogénio (H 2 O 2), que induz danos oxidativos e inicia a via apoptótica 20,21. Uma dose baixa de H 2 O 2 aumenta tantoLyso Tracker e coloração TUNEL em comparação com nenhum tratamento, enquanto que resulta uma dose elevada de encolhimento celular e Lyso Tracker generalizada e positividade TUNEL. De forma semelhante aos resultados em que o embrião, é possível ver que puncta coloração positiva com o ensaio de TUNEL, mas não com o corante Lyso Tracker, puncta que mancha única com o corante Lyso Tracker, e que se sobrepõem puncta coloração. A consequência da aplicação de um agente citotóxico que induz a apoptose é comparado com as condições que induzem a privação de soro autofagia (Figura 2D). Células que tenham sido submetidos a um período de privação de soro (1 hora) exibem um padrão diferente, onde Lyso Tracker e coloração TUNEL não correlacionam. Coloração Lyso Tracker é muito maior em comparação com culturas não tratadas, contudo TUNEL positivo é em níveis normais. Empregando ferramentas padrão disponíveis no Adobe Photoshop, coloração Lyso Tracker pode ser quantificada com um método simples limiarizaçãoque permite calcular o nível de coloração média para uma população de células. Figura 3A-B mostra como a imagem da amostra parece durante o processo de quantificação. Começando com uma imagem de linha de base com coloração Lyso Tracker no canal vermelho e os núcleos DAPI-manchado no canal azul (painel 3A), o canal vermelho da imagem foi limiarizadas para converter a imagem em preto-e-branco e os pixels brancos eram então selecionadas e contadas (Figura 3A). Um nível de limiar foi escolhido que representa o padrão de coloração Lyso Tracker. Como acontece com qualquer método de quantificação que usa imagens, é importante para evitar a superexposição suas fotos como esta poderia resultar em mais-enfatizar as diferenças. O número de núcleos no campo podem então ser contadas olhando apenas o canal azul (Figura 3B) e a marcação dos núcleos utilizando uma ferramenta de desenho, tal como um pincel, enquanto a contagem (Figura 3B). Pode-se, em seguida, expressar thnível e de coloração por meio do cálculo do nível médio de manchas por célula (número de pixels de contagem de núcleos /). Se se quiser usar esse algoritmo para rastreio através put-alta, a maioria dos pacotes de triagem pode medir o brilho em um canal específico e também ter uma função identificador do objeto que contará núcleos em um campo, no entanto, para a maioria das aplicações típicas do método manual é rápido e simples. Para dar um exemplo, uma região de amostra a partir das Figuras 2A-C foi quantificada e os resultados confirmam que o aumento das concentrações de H 2 O 2, resulta num maior nível de coloração Lyso Tracker (Figura 3C). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Coloração Lyso Tracker em normais e Shh - embriões - /. A, A &#39;Normal e Shh -. / - Embriões de camundongos em 10,5 dpc, corados com Lyso Tracker Vermelho, montado em Vectashield e fotografados emum microscópio de dissecção epiflourescence. Os parênteses indicam a localização dos membros anteriores B, B &#39;de Membro Anterior normais e Shh -.. / - Embriões fotografada na maior ampliação. Note os domínios de morte das células normais, incluindo a &quot;Zona Posterior Necrotic &#39;(marcada com um asterisco) e uma região no mesênquima proximal do botão do membro (marcada com uma seta). Membros nulos Shh exibem forte coloração na porção média e distal . C, C &#39;. seções medial através do broto forelimb de brotos de membros normais e nulo. Observe a presença de manchas no mesênquima proximal (seta) e AER (seta) do botão do membro normal ea coloração forte dentro do mesênquima dorsal e ventral e distal dentro do broto de membro nulo. DF. A mesma seção (12 mícron, congelados seção) foi fotografada por Lyso Tracker e coloração TUNEL (Roche 1.684.795). A secção de passa através da porção distai do nulo Shh mesenchyme. Seta aponta para a AER. Note-se como o padrão geral é muito semelhante, usando os dois métodos, no entanto, a coloração não se sobreponha completamente. G, G &#39;. Numa ampliação mais elevada do AER e mesênquima, pode-se ver tanto a presença de pontos lacrimais que são Lyso Tracker ou TUNEL positivo Apenas assim como puncta que se sobrepõem a coloração. <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Lyso Tracker coloração em células ES diferenciadas. Diferenciando células foram semeadas em oito lâminas de câmara, na ausência de LIF. Para mostrar como Lyso Tracker e coloração TUNEL comparar, a via de apoptose foi induzida com 2 doses diferentes de H 2 O 2, enquanto a via autophagy foi induzida com 1 hora de privação de soro. Estas imagens foram tiradas com um microscópio Zeiss Confocal LSM5 A-A&#39;&#39;:. Culturas não tratadas mostram alguma apoptose normal, tal como indicado pela LysoTracker e coloração TUNEL. O padrão de ambas as técnicas em sua maioria sobreposições (setas brancas), no entanto, pode-se ver um puncta poucos que são Lyso Tracker positivas (setas vermelhas) B-B&#39;&#39;, CC &quot;:. Tratamento com quantidades crescentes de H 2 O 2 estimula a apoptose . A dose mais baixa mostra mais Lyso Tracker e puncta TUNEL positivo quando comparadas com as células não tratadas. A dose mais elevada induz em Lyso Tracker ainda mais e puncta TUNEL positivo. setas apontam para a coloração branca sobreposta, enquanto as setas vermelhas apontam para puncta que são positivos para apenas Lyso Tracker. É também possível ver puncta que são apenas positivo para a coloração TUNEL (setas verdes) DD &quot;:. inanição de soro pode induzir autofagia, que pode estimular uma acumulação de material nos lisossomas e autophagolysosomes. Observe quantos mais pontos lacrimais Lyso Tracker são visíveis em comparação com culturas não tratadas. TUNEL puncta positiva estão presentes (a maioria dos quais se sobrepõem Lyso Tracker manchação, as setas brancas), no entanto, que o número não é grandemente aumentada em comparação com as condições não tratadas. Além disso, sob condições de privação de soro, Lyso Tracker somente puncta positivo são altamente prevalentes (setas vermelhas). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Método de quantificação para avaliar o nível de coloração, numa população de células, utilizando o Adobe Photoshop. A: Uma porção da Figura 2A foi escolhido eo Lyso Tracker (canal vermelho) e coloração DAPI (núcleos, azul canal) é mostrado neste painel A &#39;:. O canal vermelho da Figura 3A foi limiarizadas para convertê-lo a um preto-e -branco. Os pixels brancos, podem então ser seleccionados e contados utilizando a função de histograma B-B &#39;:. O canal azul mostra os núcleos e, enquanto a contagem deles, a imagem pode ser anotado com uma função de desenho, tal como um pincel C:. Isto é um ex-quantificação amplo de uma amostra a partir de painéis 2A-C. Os dados são representados como pixels por núcleos. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

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Não há conflitos de interesse declarados.

Características importantes da apoptose incluem a detecção de danos no DNA, com o ensaio de TUNEL, juntamente com a detecção da actividade da caspase (detectada com mAbs ou uma molécula de ligação, tal como zVAD-fmk), a observação das modificações celulares, bem como a apresentação de fosfatidilserina (PS ) na superfície da membrana (detectado pela aderência à anexina V). Existem algumas desvantagens com cada um destes ensaios. Por exemplo, a transferase terminal utilizado no ensaio de TUNEL não penetr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td></td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Lyso Tracker Red DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldeído </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> VETOR </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Não-aminoácidos essenciais </td><td> Cellgro </td><td> 25-025 CI- </td><td></td></tr><tr><td> Piruvato de sódio </td><td> Cellgro </td><td> 25-000 CI- </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> Pen-Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> b-mercaptoetanol, 50 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> LabTek-II lâminas Câmara (8 poços) </td><td> Nalge Nunc International </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> Gelatina a 0,1% </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> PBS de Dulbecco (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 CV- </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Receitas solução Paraformaldeído a 4% Para 100 ml: <ol><li> Misture paraformaldeído a 4 g, 90 ml de H 2 O, e NaOH (uma gota de NaOH 2N). O paraformaldeído não vou entrar em solução até ter adicionado alguns NaOH para aumentar o pH. </li><li> Agita-se e aquece-se a 60 ° C até todo o pó se encontra em solução (~ 10-20 minutos). Não sobreaquecer. </li><li> Adicionar ~ 10 ml de PBS 10x para atingir um volume final de 100 ml. </li><li> Armazenar a -20 ° C em conveniente (~ ~ 10 ml ou 40 ml) de alíquotas. </li></ol> AVISO: Paraformaldeído em &#39;babado&#39; forma (comprimido pequenas pelotas) é menor em pó e pode, portanto, ser medido fora de um capuz. No entanto, você ainda deve usar uma máscara protetora contra poeira (N95pelo menos) durante o manuseamento. EB Meios de Cultura Para 500 ml EB Media: <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM: </td><td> 404,5 ml </td></tr><tr><td> FBS: </td><td> 75,0 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamina: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> De penicilina / estreptomicina: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Não-aminoácidos essenciais: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> Piruvato de sódio: </td><td> 5,0 ml </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol: </td><td> 500ul </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells

A morte celular programada (PCD) ocorre em adultos para manter a homeostase do tecido normal e durante o desenvolvimento embrionário de moldar os tecidos e órgãos 1,2,6,7. Durante o desenvolvimento, produtos químicos tóxicos ou alterações genéticas podem causar um aumento na PCD ou mudar os padrões de PCD, resultando em anomalias do desenvolvimento e defeitos de nascimento 3-5. Para compreender a etiologia de tais defeitos, o estudo de embriões podem ser complementados com os ensaios in vitro que utilizam diferenciação estaminais embrionárias (ES) células. A apoptose é uma forma bem estudado de PCD que envolve tanto intrínsecos e extrínsecos de sinalização para ativar a enzima caspase cascata. Alterações celulares características incluem blebbing membrana, encolhimento nuclear, e fragmentação de DNA. Outras formas de PCD não envolvem a activação das caspases e pode ser o resultado final de autofagia prolongada. Independentemente da via de PCD, as células que morrem precisam de ser removidos. Em adultos, as células do sistema imunológico performe esta função, enquanto que em embriões, em que o sistema imune não desenvolveu ainda, a remoção ocorre por um mecanismo alternativo. Este mecanismo envolve as células vizinhas (chamados &quot;não profissionais fagócitos&quot;) assumindo um papel-fagocítica eles reconhecem o &#39;me comer&#39; sinal na superfície da célula a morrer e que engolem 8-10. Após imersão, os detritos é trazido para o lisossoma pela degradação. Assim, independentemente do mecanismo de PCD, um aumento da actividade lisossomal pode ser correlacionada com o aumento da morte celular. Para estudar PCD, um ensaio simples de visualizar lisossomas em tecidos espessos e culturas de multicamadas de diferenciação pode ser útil. Corante Lyso Tracker é uma molécula altamente solúvel pequeno que é retido na ácidas compartimentos subcelulares, tais como a 11-13 lisossoma. O corante é absorvido por difusão e através da circulação. Uma vez que a penetração não é um obstáculo, visualização de CPD nos tecidos espessos e multi-camada de culturas é possível 12,13 </sup&gt;. Em contraste, TUNEL (Terminal desoxinucleotidilo transferase dUTP nick end rotulagem) análise 14, está limitado a pequenas amostras, secções histológicas, e as culturas de monocamada, porque o processo requer a entrada / permeabilidade de uma transferase terminal. Em contraste com o azul de anilina, que difunde e é dissolvido por solventes, Lyso Tracker Red DND-99 é corrigível, brilhante e estável. A coloração pode ser visualizado com microscopia de fluorescência confocal ou padrão em montagem integral ou seção usando aquosas ou base solvente meios de montagem 12,13. Aqui descrevemos protocolos utilizando o corante de olhar para PCD no normal e Sonic Hedgehog embriões de camundongos nulos. Além disso, demonstramos análise de PCD em diferenciar as culturas de células ES e apresentar um método de quantificação simples. Em resumo, coloração Lyso Tracker pode ser um ótimo complemento para outros métodos de detecção de PCD.

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Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Apresenta-se um protocolo simples de visualizar regiões de morte celular programada (PCD) em embriões de ratinho e de diferenciação estaminais embrionárias de culturas (ES) de células utilizando um corante altamente solúvel chamada Lyso Tracker.

Uso de Lyso Tracker para detectar a morte celular programada em embriões e diferenciação das células-tronco embrionárias

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

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23.0K visualizações.  University of Southern California. Apresenta-se um protocolo simples de visualizar regiões de morte celular programada (PCD) em embriões de ratinho e de diferenciação estaminais embrionárias de culturas (ES) de células utilizando um corante altamente solúvel chamada Lyso Tracker.

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Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissecção de 6,5 embriões de camundongos dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biologia

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivação de células estaminais embrionárias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Embrionárias com células-tronco derivadas de células endoteliais para tratamento da isquemia dos membros posteriores

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparação de embriões de Microscopia Eletrônica do Drosophila Tubo cardíaco embrionário

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolamento e derivação de células embrionárias de rato Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Vídeo Bioinformática Análise de Crescimento Humano embrionárias Colony Stem Cell

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Diferenciação de células-tronco embrionárias em precursores oligodendroglial

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mapeamento de destino de células estaminais embrionárias humanas por formação de teratomas

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Derivação eficiente dos recursos humanos Precursores cardíaca e Cardiomyocytes pluripotentes a partir de células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas