Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento para BAV da Fundação de Crohn e Colite do Canadá (CCFC) e os Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR). GB foi financiado por uma bolsa de estudo de pós-graduação a partir de CIHR. BAV é a crianças com distúrbios intestinais e do Fígado (filho) Cadeira Fundação de Pesquisa IBD Pediátrica e do Presidente de Pesquisa do Canadá em Gastroenterologia Pediátrica.

1. Preparação do inoculo e Citrobacter rodentium gavagem oral de ratos <ol><li> Preparar e autoclave caldo Luria Bertani (LB). </li><li> Obter C. viável rodentium a partir de um estoque de glicerol congelados e raia na placa LB agar usando um loop de inoculação estéril ou pipeta. Incubar a 37 ° C durante a noite. Inocular 3 ml de caldo LB estéril num tubo de cultura com falcon colónias da placa LB usando uma ansa de inoculação ou a ponta da pipeta. Preparação do inoculo deve ser feita utilizando técnicas assépticas. </li><li> Incubar a C. cultura rodentium aerobicamente a 37 ° C durante a noite num agitador de bancada de incubação a 200 rpm. O caldo LB inoculado deve aparecer turva após cultura durante a noite. </li><li> Use uma lâmpada de ponta de agulha gavagem gástrica ligada a uma seringa de 1 ml para cada rato gavagem com 100 ul da noite para o dia C. cultura rodentium. Gentilmente scruff o mouse, segurando firmemente a pele solta sobre o seu pescoço e costascom o polegar e os dedos. Puxe a cabeça do animal com o dedo indicador para imobilizar a cabeça e endireitar o esôfago para a inserção da agulha de gavagem. </li><li> Manter o rato na posição vertical, e dirigir a ponta da agulha de bulbo gavagem ao longo do lado da boca e sobre a língua. Gentilmente passar a agulha ao longo do céu da boca e avançá-lo para o esôfago. Se houver qualquer resistência sentida durante este procedimento, remova a agulha gavagem e insira-o novamente. </li><li> Lentamente, injectar 100 ul do inóculo bacteriano e retire cuidadosamente a agulha de gavagem. Monitore a taxa de respiração e comportamento do mouse após o retornar à sua gaiola. </li></ol> Notas: <ul><li> Nos passos 2 e 3, também se preparar um tubo de cultura falcon usando técnicas assépticas, com 3 ml de caldo LB estéril a ser cultivadas durante a noite para assegurar que não existe contaminação bacteriana do caldo de si. O caldo LB deve aparecer claro após cultura durante a noite. </li><li&gt; Agitar suavemente a cultura dentro do tubo falcon antes de carregar as seringas para administração por sonda de modo que uma dose igual de bactérias é entregue para cada ratinho, no passo 4. </li><li> Cultura durante a noite deve ser descartado se tiver sido inoculado durante mais 24 hr. </li><li> Todos C. infecções rodentium e habitação de animais infectados devem ser realizadas em um Nível de Biossegurança 2 instalações. </li></ul> 2. Medindo a permeabilidade da barreira epitelial do cólon em C. rodentium infectadas Mice <ol><li> Medir a integridade da barreira num ponto de tempo desejado após a infecção. </li><li> No dia do ensaio, preparar suficiente 4 kDa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano dissolvido em tampão fosfato salino (PBS) a uma concentração de 80 mg ml -1 de gavagem a cada rato com 150 ul e para preparar a curva padrão. </li><li> Rato da nuca e gavagem com 150 uL de FITC-dextrano. Retirar os alimentos do compartimento no momento. </li><li> Anestesiar ratos 4 horas apósgavaging e recolher tanto sangue quanto possível (~ ul 450) através de punção cardíaca. Adicionar o sangue até uma concentração final de 3% de dextrose ácido-citrato em um tubo de microcentrífuga para impedir a coagulação. Eutanásia os ratos e coletar tecidos de cólon em PBS para contagem bacteriana (passos 3,1-3,5) e em formalina a 10% para fixação dos tecidos e, finalmente, imunofluorescência (passos 4,1-4,8). </li><li> Girar as amostras de sangue a 1000 xg durante 12 min numa centrífuga a 4 ° C. Recolher o soro e dilua para 1/10 e 1/100 em PBS. Adicionar 100 uL de cada amostra a estas duas diluições numa placa de 96 poços em repetições. </li><li> Para preparar a curva padrão, diluir o original 80 mg ml -1 de FITC-dextrano utilizado para gavagem os ratos em PBS com as seguintes concentrações: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 e 0 ng / ml . Adicionam-se 100 ul de cada concentração de uma placa de 96 cavidades em triplicado. </li><li> Quantificar a fluorescência de cada amostra, utilizando um fluorímetro de uma excitação wavelength de 485 nm e comprimento de onda de emissão de 535 nm. </li><li> Analisar os dados brutos traçando a curva padrão. Introduzir os dados em bruto para cada amostra para a equação da linha gerada pela curva padrão para determinar a concentração de FITC-dextrano em cada amostra. </li></ol> Notas: <ul><li> Para a partir do passo 4, manter as amostras de sangue em gelo e minimizar a exposição à luz. </li><li> Quando se mede a integridade da barreira epitelial um ponto no tempo, ou antes, 7 dias após a infecção é o ideal, como dano tecidual grave ocorre após este ponto. Medindo a integridade da barreira antes da ocorrência danos graves permite determinar diferenças máximas na permeabilidade durante C. infecção rodentium entre linhagens de camundongos. </li><li> Assegure-se que os ratinhos de controlo não infectados, são também testados para a integridade da barreira epitelial. </li></ul> 3. Medição da carga bacteriana em tecidos de C. rodentium infectadas Mice <ol><li> Adicione 1 ml de PBS estéril umand um metal autoclavado talão para um fundo redondo 2 tubo de centrífuga ml, utilizando técnica asséptica. Tecidos obtidas de cada animal serão colocados em tubos separados PBS. Pesar os tubos antes da adição do tecido. </li><li> Retire o ceco e cólon a partir do mouse. Separa-se o ceco do cólon e empurrar para fora o conteúdo luminal utilizando fórceps. Adicionar o conteúdo para um tubo de PBS. Depois de separar seções 0,5 centímetros do cólon distal e ceco por 10% de fixação de formalina, cortou o restante do cólon e ceco longitudinalmente e lavar com PBS estéril, antes de colocar tecidos em tubos. </li><li> Pesar os tubos PBS com o tecido e, em seguida homogeneizar as amostras usando um batedor de esferas durante 6 min a 30 Hz. </li><li> Utilizando técnicas assépticas, adicionar 180 ul de PBS estéril por poço de uma placa de 96 poços. Adicionar 20 ul de cada amostra homogeneizada para o primeiro poço em cada linha. Misturar bem e diluir em série, a adição de 20 ul de cada poço anterior para se obter a partir de diluições de 10 -1 (primeira,ll) a 10 -6. Placa de 10 ul de cada diluição de cada amostra, em triplicado, numa placa de fundo quadrado LB com uma grelha. Incubar durante a noite a 37 ° C. </li><li> Contagem de unidades formadoras de colónias (CFU), em seguida, calcular a média dos três contagens, e registar a diluição na qual cada amostra foi contada. Multiplicar CFU médio de 50, a 20 ul da amostra original 1 ml foi usado, e pelo factor de diluição à qual a amostra foi contada, resultando em CFU / ml. Finalmente, dividir pelo peso de tecido para determinar a CFU / g. </li></ol> 4. Avaliação histológica e imunofluorescência de tecidos infectados Colon <ol><li> Recolha de tecidos como descrito no passo 3.2. Tecidos lojas em formol durante a noite, em seguida, lavar com etanol 70%. Incorporar tecidos em parafina e cortadas secções de 5 | iM para a coloração. Mancha com hematoxilina e eosina para avaliação histológica e prossiga para os passos seguintes para técnica de imunofluorescência. </li><li> Para tecidos deparaffinize antes da coloração, desliza em lugaruma tina de coloração Coplin e colocado em banho de água a 65 ° C durante 10 min. Em seguida, as lâminas em xileno para colocar quatro lavagens de 2 minutos cada. As lâminas devem então ser re-hidratadas com duas lavagens de 5 minutos em etanol a 100%, seguido de uma lavagem de 5 minutos em cada um dos seguintes: etanol a 95%, etanol a 75% e de dH 2 0. Estas lavagens devem ser feitas num exaustor de fumos, para evitar a exposição a vapores prejudiciais. </li><li> Colocar as lâminas na jarra de Coplin com pré-aquecido tampão citrato de sódio e depois coloque em um navio a vapor por 30 minutos, em seguida, deixe descansar por 30 min. Este processo divide a proteína ligações cruzadas formadas por fixação em formalina recuperar os locais antigénicos potenciais. </li><li> Lavar com PBS azida durante 5 minutos, três vezes. Lâminas secas e em torno da área do ponto de tecido com uma caneta PAP para criar uma barreira hidrofóbica, mantendo os reagentes de coloração localizadas no tecido. </li><li> Bloco tecido durante 1 hora à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (por exemplo, soro de cabra-α) numa câmara de humidade a imunocoloração. </li><li> Diluir primary anticorpo para a concentração desejada utilizando tampão de diluição do anticorpo. Verter o tampão de bloqueio e adicionar 50-100 uL de anticorpo primário para os tecidos. Incubar a 4 ° C durante a noite ou à temperatura ambiente durante 2 hr. </li><li> Lavar com PBS azida durante 5 minutos, três vezes. Adicionar 50-100 uL de anticorpo secundário diluído em tampão de diluição do anticorpo para os tecidos e incubar à temperatura ambiente durante 1 hora, no escuro. Lavar com dH 2 O durante 5 minutos, três vezes. </li><li> Desidratar slides, adicionar DAPI Prolongar meio de Ouro de montagem e uma lamela. Ver lâminas sob um microscópio de fluorescência. </li></ol> Notas: <ul><li> PBS azida pode ser substituído com PBS preparado de fresco como uma alternativa para evitar o crescimento bacteriano no meio de lavagem para a partir do passo 4. </li></ul>

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P., Clare, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+role+for+B+lymphocytes+and+CD4++T+cells+in+immunity+to+infection+by+the+attaching+and+effacing+pathogen+Citrobacter+rodentium.">Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium.</a> Infection &amp; Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).</li><li>Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+Roles+of+Notch+and+Wnt/&#946;-Catenin+Pathways+in+the+Regulation+of+Hyperplasia+and/or+Colitis+in+Response+to+Bacterial+Infection.">Critical Roles of Notch and Wnt/&#946;-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection.</a> Infection &amp; Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de doenças infecciosas tanto em ratos e colite. Este modelo único permite a caracterização de ambas as respostas do hospedeiro, bem como as propriedades patogénicas de bactérias. As etapas descritas neste detalhe o protocolo de uso bem sucedido desse modelo. Há vários passos críticos neste protocolo para manter em mente quando induzir colite e analisar as respostas. Em primeiro lugar, a prepara?...

Infecção por agentes patogénicos bacterianos entéricos desencadeia a inflamação gastrointestinal (GI), bem como a patologia do intestino e fisiopatologia, incluindo a diarreia e disfunção da barreira epitelial intestinal. Os mecanismos de virulência de patógenos bacterianos que colonizam o trato gastrointestinal de seus hospedeiros, bem como respostas de acolhimento específicas que defendem contra essas infecções são mal compreendidos, no entanto avanços recentes na modelagem de infecções bacterianas entéricas começaram a ajudar o nosso entendimento desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Doença de Crohn IBDS (CD) e UC são doenças complexas de etiologia desconhecida, caracterizada pela inflamação intestinal crônica e dano tecidual. Muitos modelos de rato de inflamação intestinal existe, a partir de inflamação espontânea em estirpes geneticamente modificados, tais como a IL-10 - / - de ratos, aos desafios químicos com os compostos, tais como o sulfato de sódio de dextrano (DSS) e dinitrobenzene sulfico (DNBS) 1. Há a hipótese de que os desajustados respostas inflamatórias crônicas presentes em pacientes com DII desenvolver em indivíduos geneticamente susceptíveis após a exposição anormal do sistema imunológico da mucosa intestinal de bactérias entéricas 2, portanto, o estudo de modelos de colite infecciosa também oferece um potencial significativo para definir potencialmente patogênica anfitrião . respostas a bactérias entéricas Citrobacter rodentium colite induzida é um dos modelos de colite infecciosa raras que tem sido bem caracterizados 1,3, permitindo a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas e uma maior compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD, um passo essencial no desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos. C. rodentium é uma bactéria gram negativa e anexando effacing (A / E), patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com o humano importantepatógenos enteropatogênica E. coli (EPEC) e E. enterohemorrágicas coli (EHEC) 3-8. A família de agentes patogénicos A / E intimamente anexar à membrana apical da célula hospedeira do epitélio do ceco e do cólon, formação de uma estrutura não-invasivo pedestal semelhante sobre a célula hospedeira. Desafio oral com C. rodentium de 10 8 -10 9 organismos produz um modelo robusto de colite infecciosa caracterizada por hiperplasia do cólon ou alongamento das criptas, infiltração de células mononucleares imunológico e esgotamento das células caliciformes 3,4. O sítio inicial da colonização, algumas horas após o desafio, é no remendo cecal, seguido de progressão para o cólon distai 2 a 3 dias após a infecção 3. Em estirpes de murganhos imunocompetentes, a depuração do agente patogénico é alcançado 3 a 4 semanas após a infecção 1,3,4. No entanto, muitas estirpes geneticamente modificados, ou seja deficiente ou gene knockout (- / -), ratinhos, foram encontrados para exibir aumensed susceptibilidade à infecção, resultando em danos exagerados e / ou infecção crónica e inflamação 9-14. A utilização deste modelo de colite infecciosa nessas estirpes knockout, muitas proteínas de sinalização deficiente inatas, tem sido indispensável para revelar proteínas hospedeiras várias integrais para a resolução da infecção e inflamação intestinal.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Luria Broth </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> Adicionar 25 g de pó de LB para 1L de água. Autoclave antes de usar. </td></tr><tr><td> Placa de fundo quadrado com grade </td><td> Pescador </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr><tr><td> Tubo de cultura Falcon </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> Lâmpada derrubado agulha gavagem </td><td> Belas Science Tools </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 seringa ml </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC-dextrano </td><td> Sigma </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido cítrico </td><td> Sigma </td><td> C7129 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Citrato de sódio </td><td> Pescador </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dextrose </td><td> Pescador </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido citrato dextrose </td><td></td><td></td><td> 20 mM de ácido ctiric, 110 mM de citrato de sódio, 5 mM de dextrose </td></tr><tr><td> Placa preta de 96 poços </td><td> Pescador </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> Esferas de metal (5 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> 10% de formalina </td><td> Pescador </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> Frasco de 5 ml </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Hematoxilina </td><td> Pescador </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina </td><td> Pescador </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> Xileno </td><td> Pescador </td><td&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin tina de coloração </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão citrato de sódio </td><td></td><td></td><td> Citrato de sódio 10 mM, Tween 20 0,05%, pH 6,0 </td></tr><tr><td> Caneta pap </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> Soro de cabra </td><td> Sigma </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino (BSA) </td><td> Pescador </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> A azida de sódio </td><td> Sigma </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de bloqueio </td><td></td><td></td><td> Soro de cabra a 2%, 1% de BSA, 0,1% de triton X-100, Tween 20 0,05% de sódio, 0,05%azida, 0,01 M PBS, pH 7,2, mistura e armazenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> De tampão de diluição de anticorpos </td><td></td><td></td><td> 0,1% de triton X-100, 0,1% de BSA, azida de sódio a 0,05%, EDTA a 0,04% </td></tr><tr><td> De tampão de diluição de anticorpo tampão de bloqueio e de tir </td><td></td><td></td><td> Receitas mesmos que acima, mas sem adição de detergentes (triton X-100 e Tween 20) </td></tr><tr><td> Prolongar Reagente Antifade ouro com DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36931 </td><td></td></tr><tr><td> Lamelas </td><td> Pescador </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Incubação de bancada shaker </td><td> Barnstead Laboratório Linha </td><td> Max Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorometer </td><td> Perkin Elmer </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga refrigerada </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microcentrífuga 22R</td><td></td></tr><tr><td> Navio a vapor </td><td> Black &amp; Decker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de fluorescência </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

Este protocolo descreve os passos necessários para a produção de um modelo robusto de doença infecciosa e colite, bem como os métodos utilizados para caracterizar Citrobacter rodentium infecção em ratinhos. C. rodentium é uma bactéria gram negativa, patógeno específico murino bacteriana que está intimamente relacionado com a importância clínica humana patógenos enteropatogênica E. coli entero-e E. coli. Após a infecção com C. rodentium, ratos imunocompetentes sofrem de perda de peso modesta e transitória e diarréia. Histologicamente, alongamento cripta intestinal, infiltração de células imunes, e depleção de células caliciformes são observados. Eliminação da infecção é conseguida ao fim de 3 a 4 semanas. Medição da integridade da barreira epitelial intestinal, a carga bacteriana, ou de lesões histológicas em diferentes momentos após a infecção, permitiu a caracterização de estirpes de ratinho susceptíveis à infecção. O mecanismo de virulências por agentes patogénicos bacterianos, que colonizam o tracto intestinal de hospedeiros, bem como as respostas específicas de acolhimento que defendem contra essas infecções são pouco compreendidos. Por conseguinte, a C. rodentium modelo de infecção bacteriana entérica serve como uma ferramenta valiosa para ajudar a nossa compreensão desses processos. Bactérias entéricas também têm sido associadas a doenças inflamatórias intestinais (IBDS). Postula-se que as respostas inflamatórias crónicas adaptativos observados em pacientes com DII desenvolver, em indivíduos geneticamente susceptíveis, após a exposição anormal do sistema imune da mucosa intestinal de bactérias entéricas. Assim, o estudo de modelos de colite infecciosa oferece um potencial significativo para a definição de respostas do hospedeiro potencialmente patogénicos em bactérias entéricas. C. rodentium colite induzida é um tal modelo raro que permite a análise da resposta do hospedeiro a bactérias entéricas, promovendo a nossa compreensão dos mecanismos de patogénese potenciais de IBD;essencial para o desenvolvimento de novos tratamentos preventivos e terapêuticos.

Durante uma experiência de infecção padrão, os ratinhos são infectados com cerca de 2,5 x 10 8 UFC, pela via oral de 100 ul durante a noite C. cultura rodentium. Infecção de ratinhos C57BL / 6 com C. rodentium resultados na perda de peso modesta e transitória e diarréia. Embora uma ocorrência rara com C57BL / 6, os animais podem ficar doentes e necessitam de eutanásia. Portanto, os ratinhos devem ser monitorizados para o grau de perda de peso e os sintomas da aflição, t...

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The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.

O<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Modelo de Rato: Contribuições Estudar patógeno e hospedeiro para Colite Infecciosa

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

the-citrobacter-rodentium-mouse-model-studying-pathogen-host

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

26.3K visualizações.  BC Children's Hospital. Citrobacter infecção rodentium fornece um modelo útil para o estudo de infecções bacterianas entéricas, bem como resposta imune do hospedeiro e colite em ratos. Este protocolo descreve a medição da integridade da barreira, a carga de patógenos e danos histológicos permitindo a caracterização completa de agentes patogénicos e de acolhimento contribuições para colite infecciosa murino.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

Uso de uma armadilha óptica de Estudos de Interações Hospedeiro-Patógeno para imagens de células dinâmica ao vivo

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Imunologia e Infecção

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

Utilização do Modelo EpiAirway para caracterizar a longo prazo Interações Hospedeiro-Patógeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D Multimodalidade de imagens de<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infecções em Ratos

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Usando Click Chemistry medir o efeito da infecção viral sobre a síntese de RNA do Host-Cell

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Um modelo de rato para induzida por patógeno inflamação crônica no local e sistêmica Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Um modelo de cultura primária de células bolsas serosas Ex Vivo frango para estudar a patogênese de doenças infecciosas bolsas serosas vírus

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Usando um patógeno bacteriano para sonda para celular e organísmica-nível Host respostas

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Avaliação das respostas do hospedeiro-patógeno e eficácia da vacina em camundongos

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...