Os estudos sobre KvAP no laboratório Jiang ter obtido ajuda significativa do laboratório do Dr. Roderick MacKinnon na Universidade Rockefeller. Um agradecimento especial ao Dr. Kathlynn Brown e Michael McQuire para os seus conselhos e ajuda em nossos experimentos fago tela. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH (GM088745 e GM093271 a Q-XJ) e AHA (12IRG9400019 a Q-XJ).

<ol>
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Incorporation of a vesicular membrane marker into the planar membrane.</a> The Journal of General Physiology. 75, 251 (1980).</li><li>Fuks, B., Homble, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Permeability+and+electrical+properties+of+planar+lipid+membranes+from+thylakoid+lipids.">Permeability and electrical properties of planar lipid membranes from thylakoid lipids.</a> Biophysical Journal. 66, 1404 (1994).</li><li>Hanke, W., Schlue, W. -. R., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+Lipid+Bilayers.+Methods+and+Applications.">Planar Lipid Bilayers. Methods and Applications.</a> Biological Techniques. , 133 (1993).</li><li>Tien, H. 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H., Zimmerberg, J., Finkelstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+affecting+the+fusion+of+unilamellar+phospholipid+vesicles+with+planar+bilayer+membranes.">Parameters affecting the fusion of unilamellar phospholipid vesicles with planar bilayer membranes.</a> The Journal of Cell Biology. 98, 1054 (1984).</li><li>Smith, G. P., Petrenko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+Display.">Phage Display.</a> Chem. Rev. 97, 391-39 (1997).</li><li>McGuire, M. J., Li, S., Brown, K. 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Res. 35, 753 (2002).</li><li>Chami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+octyl+beta-thioglucopyranoside+in+two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins.">Use of octyl beta-thioglucopyranoside in two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 133, 64 (2001).</li><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+crystallization+of+membrane+proteins.">Two-dimensional crystallization of membrane proteins.</a> Q. Rev. Biophys. 25, 1 (1992).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65 (2003).</li><li>Walz, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Crystallography+of+Two-Dimensional+Crystals+of+Membrane+Proteins.">Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins.</a> J. Struct. Biol. 121 (2), 142 (1998).</li><li>Signorell, G. A., Kaufmann, T. C., Kukulski, W., Engel, A., Remigy, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+2D+crystallization+of+membrane+proteins+using+methyl-beta-cyclodextrin.">Controlled 2D crystallization of membrane proteins using methyl-beta-cyclodextrin.</a> J. Struct. Biol. 157, 321 (2007).</li><li>Vink, M., Derr, K., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+strategy+to+screen+2D+crystallization+trials+of+membrane+proteins.">A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins.</a> J. Struct. Biol. 160, 295 (2007).</li><li>Iacovache, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+2DX+robot:+a+membrane+protein+2D+crystallization+Swiss+Army+knife.">The 2DX robot: a membrane protein 2D crystallization Swiss Army knife.</a> J. Struct. Biol. 169, 370 (2010).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A reconstituição dos canais KvAP em diferentes membranas tem sido utilizado em vários estudos 8-10. Seguindo a ideia de assegurar a distribuição de lípidos entre detergente / lípido micelas mistas e as micelas mistas de proteína / detergente / lípido, que são capazes de atingir a reconstituição quase completa da KvAP em membranas feitas de diferentes lípidos. Cada canal KvAP tetrameric precisa de aproximadamente 100 moléculas lipídicas para cobrir integralmente o seu domínio transmembrana. A e...

Células materiais taxas e informações com seu ambiente através das funções das proteínas de membrana específicos 1. Proteínas de membrana nas membranas celulares funcionam como bombas, canais, receptores, enzimas intramembrane, linkers e simpatizantes estruturais através das membranas. As mutações que afetam as proteínas de membrana têm sido relacionado a muitas doenças humanas. Na verdade, muitas proteínas de membrana têm sido os principais alvos de drogas, porque eles são importantes e facilmente acessível nas membranas celulares. É, portanto, muito importante para compreender a estrutura e função de várias proteínas da membrana em membranas, e torná-lo possível conceber novos métodos para aliviar os efeitos prejudiciais das proteínas mutantes em doenças humanas. Lipids cercar todas as proteínas integradas na membrana bicamadas 2, 3. Em membranas eucarióticos, são conhecidos vários tipos de lípidos para ser organizados em microdomínios 4, 5.Muitas proteínas de membrana foram mostrados para serem distribuídos entre estes microdomínios, bem como o fluido de fase volumosa das membranas 3, 6. O mecanismo subjacente à organização dos microdomínios ea entrega de proteínas de membrana para eles eo significado fisiológico de tais distribuições são claramente importantes, mas permanecem pouco conhecidos. Uma grande dificuldade técnica em estudar os efeitos sobre as proteínas de membrana de lípidos é a reconstituição de confiança de bioquimicamente purificado proteínas de membrana em membranas de composição lipídica bem controlado de modo a que quase todas as proteínas são reconstituídos funcional 7. Nos últimos anos, foi desenvolvido métodos para reconstituir a voltagem dependentes do canal de potássio do protótipo A. pernix (KvAP) em sistemas de membrana diversos para estudos estruturais e funcionais 8-10. Os dados de outros nós em conjunto e mostraram que os lípidos são provavelmente um determinante nas mudanças conformacionais do sensor de tensãodomínios de um canal de iões e por voltagem pode moldar as estruturas de alguns destes canais 11. No próximo, vamos fornecer uma descrição detalhada de nossos métodos e irá oferecer dicas técnicas críticas que provavelmente vai garantir o sucesso da reprodução dos resultados, bem como a extensão dos nossos métodos para estudos de outras proteínas da membrana.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tryptone</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60060</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Yeast Extract</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>Y20020</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>S271-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris Base</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>T60040</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium Chloride</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>BP366-500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Dodecyl-&beta;-D-Maltoside</td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>D322S</td>
 <td>Sol-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>n-Octyl-&beta;-D-Glucoside </td>
 <td>Affymetrix</td>
 <td>O311</td>
 <td>Ana-grade</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Aprotinin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>A20550-0.05</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Leupeptin</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>L22035-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pepstatin A</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>P30100-0.025</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PMSF</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>P7626</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dnase I</td>
 <td>Roche</td>
 <td>13407000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bio-Bead SM-2</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>152-3920</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>RPI Corp.</td>
 <td>H75030</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPE</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850757C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>POPG</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>840457C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOGS</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870314C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMPC </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>850345C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biotin-DOPE </td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>870282C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DOTAP</td>
 <td>Avanti Polar Lipids</td>
 <td>890890C</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NeutrAvidin agarose beads </td>
 <td>Piercenet</td>
 <td>29200</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis Tubing</td>
 <td>Spectrum Laboratories, Inc</td>
 <td>132-570</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pentane</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>R399-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane</td>
 <td>TCI America</td>
 <td>D0011</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MTS-PEG5000</td>
 <td>Toronto Research Cemicals</td>
 <td>M266501</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

reconstitution of a kv channel into lipid membranes for structural and functional studies

Para estudar a interacção lípido-proteína numa forma reductionistic, é necessário incorporar as proteínas de membrana em membranas de composição lipídica bem definida. Estamos estudando os efeitos de propagação de lipídios-dependentes em um canal de potássio voltagem-dependentes protótipo (Kv), e tem trabalhado procedimentos pormenorizados para reconstituir os canais em sistemas de membrana diferentes. Nossos procedimentos de reconstituição tomar conta de ambos fusão detergente induzida por vesículas e da fusão de proteína / detergente micelas com os lipídios / detergente micelas mistas, bem como a importância de se chegar a uma distribuição de equilíbrio de lipídeos entre a proteína / detergente / lipídio e do detergente micelas mistas / lipídicas. Os nossos dados sugerem que a inserção dos canais nas vesículas lipídicas é relativamente aleatória em orientações, e a eficiência da reconstituição é tão elevado que não foram detectáveis ​​agregados proteicos encontrados em experiências de fraccionamento. Nós utilizamos a reconstituird canais para determinar os estados conformacionais dos canais em diferentes lípidos, gravar actividades eléctricas de um pequeno número de canais incorporados em bicamadas lipídicas planas, a tela para ligandos específicos para a conformação de uma biblioteca de péptido-fago exibida, e apoiar o crescimento dos cristais 2D dos canais em membranas. Os procedimentos de reconstituição descritas aqui pode ser adaptado para o estudo de outras proteínas da membrana em bicamada de lípidos, especialmente para a investigação dos efeitos de lípidos nos canais iónicos dependentes da voltagem eucarióticas.

O fluxo geral das experiências para a purificação do canal KvAP em homogeneidade bioquímica está descrito na Figura 1A. Amostras típicas durante a expressão e purificação da proteína é mostrado no gel de SDS-PAGE na Figura 1B. A proteína, após a purificação IMAC é relativamente puro. O rendimento do canal KvAP é de cerca de 1,0 mg / litro de cultura. Solubilização de vesículas lipídicas com detergentes precisa ser trabalhado para cada pa...

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Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.

Reconstituição de um canal de Kv para membranas lipídicas de Estudos estruturais e funcionais

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

reconstitution-kv-channel-into-lipid-membranes-for-structural

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K visualizações.  University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas. Procedimentos para a reconstituição completa da voltagem dependentes do canal de potássio protótipo em membranas lipídicas são descritos. Os canais reconstituídos são adequados para ensaios bioquímicos, gravações elétricas, triagem ligante e estudos de cristalografia de elétrons. Esses métodos podem ter aplicações gerais para os estudos estruturais e funcionais de outras proteínas de membrana.