This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

NOTA: Os seguintes procedimentos estão em conformidade com as directrizes aprovadas pelo Conselho Canadense de Cuidado Animal. Todos os esforços são para minimizar a dor eo sofrimento dos animais durante os procedimentos. 1. Revestimento de Filtros Nota: Quando as inserções de filtro de cultura são colocadas em poços de placas de poços múltiplos, dois compartimentos são definidos: o compartimento de cima é a região superior da inserção e do compartimento inferior é o que está abaixo do inserto Figura 1A.ab. Os explantes são semeados na parte superior do compartimento onde se fixam para o lado de cima do filtro; muitos axónios crescer através do filtro e prolongar sobre o lado inferior do filtro, dentro do compartimento inferior Figura 1A.c. Os volumes de trabalho padrão (ou seja, para a aplicação de solução de revestimento, lavagens, meios de cultura, etc) são 2 ml para o compartimento inferior e 1 ml para o compartimento superior e vão ser referidos no protocolo como &quot;; Volumes normais &quot;. Adicionar as soluções de partida, com o compartimento de fundo, colocando a ponta da pipeta no espaço entre o inserto e o lado do poço. Além disso, a inserção de inclinar para um lado, enquanto a distribuição da solução para evitar que as bolhas de ser preso na parte inferior do filtro. <ol><li> Inicie o revestimento dos filtros no dia antes do plaqueamento. De acordo com o tecido de cultura esterilizado capa, colocar 24 inserções de filtro mm numa placa de 6 alvéolos de recepção. Incubar inserções com poli-D-lisina em água (1 mg / ml) durante 1 hora à temperatura ambiente usando volumes padrão: 2 ml no compartimento inferior e um ml do topo. </li><li> Aspirar poli-D-lisina e lavar uma vez com água. Aspirar água, feche a tampa e deixe as placas para secar no capô O / N. Durante a aspiração de líquidos, certifique-se de remover um remanescente de líquido que fica preso diretamente sob o filtro. </li><li> Na manhã seguinte, diluir em água laminina (10 ug / ml), misturar e quente a 37 ° C. Incubar inserções com laminina 1 hr no cell incubadora a 37 ° C, utilizando-se volumes padrão. </li><li> Laminina aspirado e adicionam colagénio em água (0,1 mg / ml) e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Neste caso utilizam 2 ml para o compartimento inferior e 2 ml para o compartimento superior. </li><li> Colagénio Aspirar e lavar uma vez com água estéril. Os filtros já estão prontos para receber meios de cultura e explantes DRG, conforme descrito no passo 3. </li></ol> 2. Dissecação Embryonic gânglio de raiz dorsal (DRG) explantes <ol><li> Anestesiar um rato fêmea grávida de 13 dias por uma injeção IP de Avertin (250 mg / kg). Espere 10-15 minutos e verifique se há falta de reflexos de retirada da córnea e pedais. Uma vez que os reflexos estão ausentes, realizar deslocamento cervical. </li><li> Desinfetar todos os instrumentos cirúrgicos e abdômen feminino com etanol 70%. Permitir instrumentos para secar. Mantenha a pele do abdómen e cortar através das camadas da pele e músculo para expor a cavidade abdominal. </li><li> Remover o útero por descolamento do colo do útero e ovários. Numa Sterile capô, retire os embriões do útero com uma tesoura e coletá-los em uma placa de Petri cheia de mídia L15 gelada. Mantenha no gelo. NOTA: Consulte relatórios técnicos anteriores para obter mais detalhes sobre como obter embriões de 13 dias de gestação 17,18. </li><li> Sob o microscópio, estava o embrião de um lado e usar uma tesoura pequena mola para remover a cabeça. Faça uma incisão ao longo das laterais para descartar o peito, barriga, pernas e cauda. Mantenha as costas contendo a coluna vertebral, deitados lado ventral para cima e remova todos os órgãos viscerais. </li><li> Com uma tesoura pequena mola, expor toda a medula espinal por corte da coluna vertebral a partir do seu lado ventral na linha média. Segurar a carcaça para baixo com um par de pinças (# 3) e com um segundo par de segurar a medula espinal por seu aspecto mais rostral. </li><li> Lenta e delicadamente puxe o cabo longe da cavidade vertebral e beliscar fora DRGs da medula espinhal usando fórceps ultra-finas (# 5). Grupo dos DRGs que devem ser recolhidaso fundo do prato. </li><li> Colete DRGs agrupados por aspiração com uma pipeta de 200 mL que foi cortado para ampliar a sua abertura. Coloque as GDH num tubo e deixar em gelo até a recolha de DRG está terminado. NOTA: Branco dicas / transparentes são os preferidos porque DRGs não aderem às paredes desta ponta (em comparação com pontas amarelas padrão). Dicas Flushing com a mídia antes do uso impede mais DRGs de degola para suas paredes. </li></ol> 3. Sementeira e Manutenção de gânglio de raiz dorsal explantes em Filtros <ol><li> Adicionar mídia DRG completa a 37 ° C para as pastilhas revestidas utilizando volumes padrão. Suplemento da mídia compartimento inferior com 15 ng / ml de NGF, enquanto se mantém a parte superior do compartimento de NGF livre. NOTA: Apesar de NGF difunde de forma eficiente através do filtro e sua concentração equilibra dentro de horas, temos observado que a aplicação de NGF ao compartimento inferior diretamente antes da semeadura aumenta significativamente o rendimento axonal no bottom superfície do filtro. </li><li> Transferir os DRGs do tubo para os filtros, utilizando uma pipeta de 1000 ul com uma ponta cortada para aumentar a sua abertura. </li><li> Desenhe mídia na ponta 2-3x antes de coletar os DRGs. Isto evita que fiquem coladas ao lado de dentro da ponta. A mesma ponta pode ser re-utilizado para todos os poços. O uso de dicas uncolored (versus pontas azuis padrão) reduz DRG degola para a superfície da ponta. </li><li> Para transferir DRGs, defina a pipeta de 800 mL. Aspirar cerca de 200 mL de mídia a partir do lado superior do filtro, em seguida, ir para o tubo contendo DRG e pipetar um volume pequeno para cima e para baixo - para voltar a suspender DRGs que se afundaram para o fundo. Aspirar todo o volume e GDH submergindo a ponta da pipeta no meio do inserto. </li><li> Uma vez que todas as inserções são carregados, feche a tampa e agite a placa placa de 10x, tocando-o com cuidado no banco capô entre cada redemoinho. Estes movimentos aumentar o rendimento axonal, ajudando explantes DRG pia eanexar ao filtro. Isto também ajuda a distribuir uniformemente explantes de modo que a partir de axônios diferentes explantes não se sobrepõem. NOTA: O procedimento de semeadura explante descrito nas etapas anteriores, aumenta significativamente a taxa global de fixação explante para o substrato (até 75%). Mais significativamente, o processo de pipetagem prontamente impede explantes de flutuar sobre a superfície dos meios de comunicação em vez de afundar para o fundo do inserto. </li><li> Para as análises bioquímicas, DRGs sementes de um embrião (cerca de 30) por filtro. Para as análises morfológicas, use metade ou um terço dos DRGs de um embrião (10-15). Esta decisão deve ser tomada antes de coletar os DRGs em tubos, de modo que todos os DRGs de um tubo são semeadas em um único poço (se é 30, 15 ou 10 DRGs). </li><li> Manter as culturas numa incubadora celular a 37 ° C, alterando mídia a cada 2-3 dias. Para mudar de suporte, aspirar o compartimento de topo em primeiro lugar, seguido do compartimento inferior. Adicionar mídia frescas em volume padrãos a partir do compartimento inferior. NOTA: Para evitar que células / axônios de secagem, não mudam de mídia em mais de três inserções ao mesmo tempo. DRGs cultivadas em filtros na presença de NGF vai estender axônios longos, atingindo até 2 mm ao fim de 2 dias em cultura. </li></ol> 4. Fator Trófico Tratamento Retirada Retirada NGF induz degeneração axonal com a fragmentação axonal (determinado pelo contraste de fase e β-III-tubulina SE), que aparece pela primeira vez em torno de 12 horas após a retirada. Fragmentação completa é alcançada em 36 horas. Quanto tempo a degeneração é deixado para prosseguir para tem que ser escolhido pelo usuário final de acordo com o delineamento experimental. <ol><li> Após a fase de extensão axonal de 2 dias, a partir de meios de mudar os compartimentos superior e inferior de meios de comunicação, que carece de NGF e que contém os anticorpos anti-NGF (1 ug / ml) para sequestrar qualquer remanescente (ou produzida endogenamente) NGF. </li><li> E volta para as placas da incubadora celular (37 ° C) para permitirNGF degeneração induzida por retirada de proceder para a quantidade de tempo desejada. </li><li> Vá para a extração de proteínas (passo 6) para exame por western blot ou examinar diretamente os filtros por IF (passo 7). </li></ol> 5. Axonal transecção para induzir a degeneração walleriana Este procedimento deixa os axónios no lado inferior do filtro separado do seu corpo da célula, mas de outra forma intacto. Posteriormente, esses axônios iniciar rapidamente a degeneração Walleriana. Fragmentação axonal (evidenciado pelo contraste de fase ou β-III-tubulina IF) aparece pela primeira vez por 3 horas após a transecção; por 9 horas, os axônios são completamente fragmentados e são separadas do filtro. Quanto tempo a degeneração é deixado para prosseguir para tem que ser escolhido pelo usuário final de acordo com o delineamento experimental. <ol><li> Raspe o lado superior do filtro, contendo explantes DRG cultivados, com um raspador de células. Assegurar a remoção completa do material de topo por raspador movendo-se em X, Y e circularindicações. </li><li> Descartar o material da parte superior do compartimento contendo os explantes flutuantes que foram raspados do filtro e substitua com 1 ml de pré-aquecido, meios DRG completo contendo NGF (10 ng / ml). </li><li> Retornar placa para a célula incubadora (37 ° C) para permitir que a degeneração waleriana prosseguir durante o período de tempo escolhido pelo utilizador final. </li><li> Vá para a extração de proteínas (passo 6) para exame por western blot ou examinar diretamente os filtros por IF (passo 7). </li></ol> 6. Extração de proteínas das amostras axonais <ol><li> Preencha tubos de coleta (1,5 ml) com 75 mL de tampão de amostra Laemmli. Manter tubos em gelo enquanto colhendo os axônios de todo o conjunto de filtros. </li><li> Lavar o filtro com explantes DRG em PBS e raspar o lado de topo do filtro. Remova a inserção da placa, limpar o lado de cima do filtro com um aplicador de algodão-ponta e aspirar qualquer PBS extra dos lados superior e inferior. </li><li> Coloque inserção de cabeçapara baixo no banco e cortar o filtro da inserção utilizando um bisturi afiada. Mantenha o filtro com uma pinça, de baixo para cima. Fazer um corte a partir da circunferência para o centro do filtro, com uma tesoura. </li><li> Local filtro no topo do tubo de recolha, e com uma pinça, prima do centro do filtro para baixo do tubo. Enquanto isso, um funil devem formar. Empurrar o filtro em forma de funil para o fundo do tubo de maneira que ele é submerso no tampão de amostra Laemmli. </li><li> Extração de proteína completa, fervendo os tubos para 4 min. Retirar o filtro, utilizando um fórceps para colocá-la de cabeça para baixo na parte superior do tubo e realizar uma breve centrifugação (2000 xg durante 15 seg). Descarte os filtros secos. </li><li> Resolver 10 ul da preparação de proteína axonal num SDS-PAGE seguido por Western blot para detectar as proteínas de interesse. NOTA: Como referência, uma preparação axonal de 20 explantes cultivados durante 2 dias e lisadas em 100 ul de tampão de lise RIPA terá uma concentração de proteína de 4-6ug / ul. </li></ol> 7. Exame de imunofluorescência de axônios em Filtros Os passos seguintes descrevem as manipulações gerais para executar se a coloração de elementos filtrantes, exemplificadas pela detecção de β-III-tubulina. Fixação, tempos de incubação, concentrações e outros elementos devem ser otimizados para outros pares de antígeno-anticorpo. <ol><li> Utilize usados ​​anteriormente placas de 6 poços, cuidadosamente limpos, para as seguintes lavagens e incubações das inserções. </li><li> Lava-se rapidamente insertos em PBS. Corrigi-los em recém-preparada de paraformaldeído 4% em PBS durante 10 min à temperatura ambiente no agitador. </li><li> Após a fixação, raspar e limpar o lado de topo do inserto de recolher os axónios que cresceram exclusivamente sobre a superfície inferior do filtro. Prossiga com incubações padrão para IF. </li><li> Incubar inserções em solução de bloqueio (TBS, 0,05% de Tween 20, 5% de leite desnatado), usando volumes padrão, durante 1 hora à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Transferência de inserções para anticorpo primário diluído em tampão (anti-β-III-tubulina, 1:5000) de bloqueio, utilizando volumes padrão. Incubar S / N (~ 18 horas) a 4 ° C com agitação suave. </li><li> Lavar o primeiro anticorpo duas vezes em PBS (2 x 10 min à temperatura ambiente). </li><li> Transferência insere a anticorpos secundários fluorescentes conjugados diluídos em tampão de bloqueio (cabra anti-ratinho, 1:2000), usando volumes padrão. Incubar coberto da luz durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave. </li><li> Lavar 3x anticorpo secundário em PBS (3 x 10 min à temperatura ambiente). </li><li> Depois de IF é completa, tome inserir fora, despeje longe PBS a partir da última lavagem e limpar o lado de cima do filtro com um aplicador de algodão-ponta. Aspirar todo o líquido a partir dos lados superior e inferior. </li><li> Local inserir de cabeça para baixo no banco, e cortar o filtro de inserção com um bisturi afiada. </li><li> Mantenha o filtro com uma pinça, desvantagem, e colocar sobre lâmina de microscopia. Overlay com uma lamela e mou compatível fluorescentemídia NTING. Vamos plana e seca no quarto frio, coberto de luz. Examinar e capturar imagens usando um microscópio fluorescente. NOTA: Quando armazenado a 4 ° C e protegida da luz, estas preparações podem ser mantidas durante semanas, com uma perda mínima de fluorescência. </li><li> OPCIONAL: Como alternativa, se pode ser realizada em filtros que foram removidas a partir da inserção. Para fazer isso, raspar e limpar o lado de cima dos filtros directamente após a fixação. <ol><li> Tome filtros fora das pastilhas com um bisturi afiado filtros e colocar axónios-se na parte inferior de uma placa de seis poços. </li><li> Em seguida, execute incubações para IF como indicado na 7,4-7,8 e 7.11. A vantagem desta alternativa é que poupa reagentes, uma vez que, por exemplo, os volumes de incubação pode ir até 500 mL (em comparação com os 3 ml utilizadas quando os filtros são directamente corados sobre as inserções como mostrado na 7,1-7,11). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Parâmetros importantes a ter em conta aquando da adaptação desta técnica incluem a população neuronal que vai ser estudado, o substrato, o tamanho dos poros do filtro e área de superfície. Todos estes parâmetros terá impacto sobre a especificidade, qualidade e quantidade da preparação neurite obtido e deve ser analisada com cuidado pelo usuário final. Nos exemplos apresentados neste protocolo, o uso de neurônios DRG tem a vantagem de estender apenas axônios, dando assim um puro preparação axonal (espec?...

O compartimento axonal de neurônios mostra um elevado grau de independência funcional do compartimento do somato-dendrítica. Em neurônios de projeção, os axônios conter a maior parte do 1,2 proteína neuronal. O estudo da fisiologia e fisiopatologia dos axônios ganhou força na comunidade da neurociência porque estudos recentes têm mostrado que a disfunção axonal no início parece ser uma característica comum de doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos 3. Parece provável que uma melhor compreensão dos mecanismos axonal exclusiva em condições normais e patológicas vai lançar luz sobre os eventos iniciais que levam a disfunção. O presente protocolo descreve como utilizar inserções de cultura tendo uma membrana porosa (filtro) para obter grandes quantidades de material axonal puro que é adequado para análises bioquímicas e imunocitoquímica. O uso de filtro insere estudar biologia axonal foi implementado pela primeira vez por Steward e4 colegas e desenvolvido por Twiss e colegas 5 a sua configuração actual. A técnica é agora de uso corrente por parte de grupos que estudam diferentes aspectos da biologia axonal e dendritos, com ligeiras modificações, em cada caso para acomodar a população de neurônios estudados, os tratamentos realizados eo tipo de análises bioquímicas usadas 6-9. O presente protocolo não pretende acomodar todas as alternativas para uma tal variedade de aplicações, mas sim fornecer uma abordagem simples que é adequado para a maioria das aplicações. Em particular, o protocolo descrito aqui utiliza uma camada tripla que maximiza o rendimento axonal para análises bioquímicas e é o mais apropriado para estudar revestimentos degeneração axonal outros descritos na literatura produziu menos axónios que retraem e degeneram mais rápido quando privados de factores tróficos 9. Neste procedimento, os corpos celulares neuronais permanecer isolada sobre os filtros de whaxônios ile passar através dos poros e crescer ao longo de sua superfície inferior. Axónios puros (livres de células da glia e os contaminantes do corpo da célula neuronal), que crescem sobre a superfície inferior do filtro pode ser recolhido para análises bioquímicas ou pode ser fixada in situ e examinadas por meio de técnicas de imunocitoquímica 9. O procedimento baseia-se na utilização de neurónios sensoriais embrionárias a partir de gânglios da raiz dorsal (DRG). DRGs embrionárias são amplamente usados ​​para o estudo da biologia axonal porque neurites a partir dessas células sofrem um crescimento rápido e robusto, in vitro, quando mantidos em factor de crescimento do nervo (NGF), e porque rapidamente sofrer degeneração quando privados deste factor. Além disso, os neurónios DRG falta dendritos, de modo que todas as neurites recolhidos por este método são meramente axónios. Filtrar inserções representam uma grande vantagem em comparação com outras abordagens utilizadas para estudar os axônios. Estudos que dependem da utilização de microscopia de diferenciar os processos que ocorrem na célula do soma daquelas numaXONs fornecer informação bioquímica limitado. Como outro exemplo, os sistemas de cultura (por exemplo, em compartimentos, câmaras Campenot 10 ou dispositivos de microfluidos 11) são úteis para abordagens de imagem e para o tratamento diferencial de compartimentos celulares, mas fornecer apenas pequenas quantidades de material axonal, impedindo o uso destas técnicas para análises bioquímicas que requerem quantidades relativamente grandes de amostra. Além disso, seu uso requer treinamento significativo, bem como dispositivos especializados, e eles são demorados. Outra abordagem frequentemente usada para isolar os axônios a partir de explantes é remover manualmente um centro de explante (contendo corpos celulares neuronais) antes da coleta de amostra axonal. Embora este pode produzir grandes quantidades de preparações enriquecidas dos axónios, os axônios nesta preparação pode ser envolto em células gliais e removendo rapidamente corpos 20 do explante consecutivamente a partir de 6 poços (como um exemplo de uma experiência mínima) é demorado e no limite de viabilidade. Em contraste, o método aqui apresentado produz preparações axonais abundante e pura, que pode, então, ser analisados ​​por virtualmente qualquer técnica bioquímica que é vulgarmente utilizado para analisar os lisados ​​de células inteiras, como Western blot, imunoprecipitação 6, northern blot 5 espectrometria de massa 6, a purificação de ARN 7,12,13, entre outros. Além disso, o protocolo pode ser aplicado para imunofluorescência (IF) de técnicas, como é possível a fixação de axónios em crescimento no lado inferior do filtro para os examinar ainda por IF. Esta abordagem facilita muito a análise dos processos específicos de axonal já que não há corpos celulares na preparação final. Esta é uma vantagem significativa uma vez que um sinal de alta imunofluorescência de corpos celulares muitas vezes prejudica o exame e análise de um sinal mais fraco proveniente de estruturas finas, tais como axónios. Duas aplicações do método de cultura para estudar axonal ar degeneraçãoe descritos; um modelo de poda de desenvolvimento e um modelo de degeneração induzida por lesão (comumente referido como degeneração Walleriana). A modelagem da poda de desenvolvimento baseia-se no fato de que os neurônios sensoriais in vivo competem para limitar a quantidade de NGF derivado do alvo e aqueles não receber suficiente neurotrófico degenerado apoio 14. Este fenómeno pode ser mimetizado em culturas de DRG embrionárias mediante a retirada do NGF do meio de cultura, o que, como acontece in vivo, inicia a degeneração axonal seguida da destruição de células do corpo. Para modelar a degeneração Wallerina, o lado superior do filtro com os corpos celulares é raspado. Os axônios que tinham crescido para o lado inferior do filtro tornar-se fisicamente separados dos corpos celulares e, posteriormente, submeter-se ao processo degenerativo rápido e estereotipado conhecida como degeneração Walleriana 15, em homenagem a A. Waller que primeiro relatou o fenômeno em 1850 16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td>
			<td style="width:140px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:416px;">In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353102</td>
			<td>1 &#181;m pore size, fits 6-well receiving plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Companion Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353502</td>
			<td>Receiving plates for inserts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td style="width:416px;">Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 &#176;C and thaw overnight at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureCol Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>Can be replaced by DMEM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum-Free Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGF (2.5S, beta subunit)</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLMCNET-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="109" rowspan="2" style="height:109px;width:297px;">Anti-NGF Antibody</td>
			<td style="width:140px;">Prepared in-house</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:416px;">As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. &#38; Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">AN-240</td>
			<td>Commercial option</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Tubulin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRG culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:297px;">Neurobasal Medium 
			2 % B27 Neurobasal Supplement 
			2 mM l-Glutamine 
			1 % Penicillin-Streptomysin 
			10 &#181;M FDU 
			15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Laemmli Sample Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:297px;">10 % SDS 
			0.5 M DTT 
			0.5 M Tris (pH 6.8) 
			5 % Glycerol 
			0.01 % (w/v) Bromophenol blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Explantes gânglio da raiz dorsal de ratos E13.5 crescer extensivamente sobre filtros sequencialmente revestidas com poli-D-lisina, laminina e colágeno (Figura 1B, à esquerda), atingindo até 2 mm de dentro de 2 dias em cultura. Esta combinação de substrato produz um crescimento particularmente exuberante; outras combinações produzir axónios que são consideravelmente mais curto (Figura 1B, à direita). Além disso, os GDH mantidos em filtros estender mais e mais longos do que os...

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Produção e Isolamento de axônios de neurônios sensoriais para análise bioquímica Usando filtros porosos

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K visualizações.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

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Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Análise morfológica de Drosophila Larval sensorial periférica Dendrites Neuron e axônios Usando Mosaicos Genéticos

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Neurociência

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Flash Fotólise de Compostos Caged no Cilia de Olfactory neurônios sensoriais

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento de neurônios sensoriais de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Para Remendo Recordings Grampo de Correntes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Monte todo imunomarcação de Neurônios Receptores Olfatórios no<em&gt; Drosophila</em&gt; Antena

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolamento e Cultura de Dissociated neurônios sensoriais de Chick Embriões

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Remoção de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tecido muscular larval Filetes para Análise de imunofluorescência de neurônios sensoriais e células epidérmicas

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparação para gravações eletrofisiológicas da Spinal Sensorial e Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

Isolamento e cultura de neurônios da medula espinhal de ratos neonatais

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

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