This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

注：以下の手順は、動物管理のカナダ人評議会によって承認されたガイドラインに従っている。すべての努力は、処置中の疼痛および動物の苦痛を最小限にするために行われる。 フィルタの1。コーティング注：培養フィルターインサートがマルチウェルプレートのウェルに配置された場合、二つの区画が定義されています。トップのコンパートメントは、挿入の上の領域であり、ボトムのコンパートメントは、挿入図1A.ab下の1である。外植片を、それらがフィルタの上側に取り付けられる上部コンパートメントに播種する;多くの軸索は、フィルターを通して成長し、底部区画図1A.c内に、フィルタの下側に延びている。 （ すなわち、コーティング液、洗浄液、培養培地などを適用するための）標準ワーキングボリュームは上部区画のために底部区画2および1mlであり、「のようなプロトコルで言及されようとしている;標準ボリューム」。インサートとウェルの側面との間の隙間にピペットの先端を配置することによって、ボトムのコンパートメントで始まるソリューションを追加します。フィルターの底にトラップされる気泡を防止するためのソリューションを分配しながらも、一方の側に挿入を傾ける。 <ol><li>フィルターをメッキ前日にコーティング開始します。滅菌組織培養フードの下で、6ウェル受けプレートに24ミリメートルフィルターインサートを配置します。一番下の区画に2ミリリットルとトップでの1ミリリットル：標準ボリュームを使用して室温で1時間、水中のポリ-D-リジン（1ミリグラム/ ml）で挿入をインキュベートする。 </li><li>吸引ポリ-D-リジン、水で1回すすいでください。吸引水、ふたを閉じて、フードのO / N中で乾燥プレートを残す液体の吸引中に、直接、フィルタの下に閉じ込められた液体の残骸を削除してください。 </li><li>翌朝、水にラミニン（10μg/ mlの）を希釈して混ぜて暖かい37℃でCELにラミニン1時間で挿入をインキュベート標準ボリュームを使用して37℃でLインキュベーター、。 </li><li>吸引ラミニン、水にコラーゲン（0.1 mg / mlの）を追加し、室温で1時間インキュベートする。この場合、最上部のコンパートメントのために一番下の区画のための2ミリリットルと2ミリリットルを使用しています。 </li><li>吸引コラーゲン、滅菌水で1回洗浄する。 STEP 3に記載されるようにフィルタが、現在培養培地およびDRG外植片を受信する準備ができている。 </li></ol> 2。解剖胚後根神経節（DRG）外植片<ol><li>アベルチン（250 mg / kg）のIP注射により13日間の妊娠雌マウスを麻酔。 10〜15分待ってから、角膜とペダル撤退反射の欠如を確認してください。反射神経が存在しないと、頸椎脱臼を行う。 </li><li> 70％エタノールですべての手術器具と女性の腹部を消毒。楽器を乾燥させる。腹部の皮膚を保持し、腹腔を露出させ、皮膚と筋肉の層を通ってカット。 </li><li>子宮頸部および卵巣から取り外すことにより、子宮を除去します。殺菌中ル·フード、ハサミで子宮から胚を除去し、氷冷L15メディアで満たされたペトリ皿にそれらを収集。氷の上においてください。 注：妊娠17,18の13日の胚を取得する方法についての詳細は、以前の技術レポートをご参照ください。 </li><li>顕微鏡下で、側に胚を置き、頭部を取り除くために、小さな春のはさみを使用しています。胸、腹、手足や尾を廃棄するように側面に沿って切開する。背骨を含む背中を保つ、腹側を上に置き、すべての内臓を取り除く。 </li><li>小さな春のはさみで、正中線に沿って腹側から脊柱を切断することにより、脊髄全体を公開します。鉗子の1組（＃3）でカーカスを押しながら、その最も頭側視点で脊髄を保持するために第二の対を使用しています。 </li><li>ゆっくりと静かに椎骨の空洞からコードを引き出し、超薄型鉗子（＃5）を使用して、脊髄からのDRGをピンチオフ。グループDRGを上で収集される皿の底。 </li><li>その開口部を拡大するために切断された200μlのピペットチップで吸引することによりグループ化されたDRGを収集します。チューブ内のDRGを置き、DRGの収集が完了するまで氷上にしておきます。 注：DRGを、この先端部の壁面に付着しないので（標準黄色チップと比較して）ホワイト/透明ヒントが好ましい。使用前にメディアとヒントをフラッシュすると、さらにその壁に付着するのDRGを防ぐことができます。 </li></ol>フィルターに3。播種し、後根神経節外植片のメンテナンス<ol><li>標準ボリュームを使用してコーティングされたインサートに37℃で完全DRGのメディアを追加します。 NGFのないトップのコンパートメントを維持しながら、NGFの15 ng / mlの底の区画メディアを補完する。 NOTE：NGFを効率的にフィルタを横切って拡散し、その濃度は時間以内に平衡が、我々は直接播種する前に、底部区画にNGFを適用すること有意Bの軸索の収率を増加させることを観察したフィルターのottom表面。 </li><li>その開口部を拡大するためにトリミングされたチップで千μLピペットを用いてフィルターにチューブからのDRGを転送します。 </li><li>のDRGを収集する前に、先端2〜3倍にメディアを描画します。これは、先端の内側に付着するのを防ぐことができます。同じチップを全てのウェルに再使用することができる。 （標準ブルーチップに対して）無着色のヒントを使用すると、先端面にDRGの付着を低減します。 </li><li>のDRGを転送するには、800μLのピペットを設定します。吸引除去フィルタの上側からのメディアの約200μlを、そしてDRG-含むチューブに移動して、上下に小さな体積をピペット - 底に沈めてきたのDRGを再懸濁する。全編、インサートの中央に先端を沈めるピペットのDRGを吸引。 </li><li>一度すべての挿入がロードされ、プレートの蓋を閉じて、プレート10倍渦巻、各スワール間フードベンチに静かに叩く。これらの動きはDRG外植片シンク支援することにより、軸索の収率を増加させフィルターに付着する。これはまた別の外植片からの軸索が重ならないように均等に外植片を分配するのに役立ちます。 注：前の手順で説明した外植片の播種手順が大幅に（75％まで）基板に外植片の添付ファイルの全体的な速度を増加させる。最も重要なことは、ピペットする手順を容易に媒体表面上に浮遊代わりに、インサートの底に沈んでから外植片を防止する。 </li><li>生化学的分析のために、フィルターごと（30前後）1胚からのシードのDRG。形態学的分析のために、半分または1胚（10〜15）からのDRGの第三のいずれかを使用する。チューブのすべてのDRGは、（それが30、15、または10のDRGであるかどうか）単一のウェルに播種されるように、この決定は、チューブにDRGをを収集する前に行わなければならない。 </li><li> 2〜3日ごとにメディアを変更し、37℃で細胞培養器内の文化を維持している。メディアを変更するには、下のコンパートメントに続いて、最初のトップのコンパートメントを吸引する。標準ボリュームに新鮮な培地を追加下部コンパートメントから始まるのです。 注：乾燥から細胞/軸索を防止するために、同時に複数の3の挿入にメディアを変更しないでください。 NGFの存在下でフィルター上に成長したDRGを培養液中で2日後に2ミリメートルまで到達し、長い軸索を拡張します。 </li></ol> 4。栄養因子撤退トリートメント NGFの撤退は最初の撤退後の約12時間後に表示されます（位相差とβ-III-チューブリンIFによって決定）軸索の断片化と軸索変性を誘導する。完全な断片化は、36時間までに達成される。どのくらい変性は進行したままにする実験計画に従って、エンドユーザによって選択されな​​ければならない。 <ol><li> NGFを欠いており、残りの（または内因性に産生される）、NGFを隔離する抗NGF抗体（1μg/ mlの）が含まれているメディアへの上部と下部の区画からの2日間の軸索伸長相、変化媒体の後。 </li><li>可能にするために細胞インキュベーター（37℃）にプレートを戻す所望の時間進行さNGF離脱誘発性の変性。 </li><li>ウェスタンブロットによる検査のためにタンパク質抽出する（ステップ6）を行って、または直接場合（ステップ7）することで、フィルタを調べます。 </li></ol>ウォーラー変性を誘導するために5。軸索切断この手順は、それらの細胞体から離脱フィルタの下側に軸索を残し、それ以外は無傷。その後、これらの軸索は急速ウォーラー変性を開始する。最初の切断後3時間で表示されます（IF位相コントラストまたはβ-III-チューブリンによって証明）軸索断片化; 9時間で、軸索は完全に断片化され、フィルタから切り離されています。どのくらい変性は進行したままにする実験計画に従って、エンドユーザによって選択されな​​ければならない。 <ol><li>細胞スクレーパーで、成長したDRG外植片を含む、フィルターの上側をこすり。 X軸、Y軸、および円形にスクレーパーを移動することで、トップの材料の完全な除去を確実方向。 </li><li>フィルターから掻き取り、NGF（10 ng / mlの）を含む予め温め、完全のDRG培地1mlと交換された浮遊植片を含むトップのコンパートメントからメディアを捨てる。 </li><li>ウォーラー変性がエンドユーザによって選択された時間だけ進行させるためにインキュベーター（37℃）、細胞をプレートに戻す。 </li><li>ウェスタンブロットによる検査のためにタンパク質抽出する（ステップ6）を行って、または直接場合（ステップ7）することで、フィルタを調べます。 </li></ol>軸索のサンプルの6。タンパク質抽出<ol><li>レムリ試料緩衝液の75μlのコレクションチューブ（1.5ミリリットル）を入力します。フィルタのセット全体から軸索を収穫しながら、氷の上でチューブを保持します。 </li><li> PBSにDRG外植片でフィルターを洗浄し、フィルターの上側をこすり。プレートからカバーを取り外し綿チップアプリケーターでフィルターの上面をきれいにし、上側と下側から余分なPBSを吸引除去する。 </li><li>場所インサート逆さまベンチに鋭いメスを用いて、インサートからフィルタをカット。鉗子、ボトムアップのフィルタを保持する。はさみでフィルタの中心周から切​​断を行う。 </li><li>収集チューブの上に置き、フィルタ、およびピンセットで、チューブダウンフィルタの中心を押してください。これを実行しながら、漏斗が形成すべきである。それはLaemmliサンプル緩衝液中に浸漬されるように、チューブの底部に漏斗状のフィルタを押してください。 </li><li> 4分間のチューブを煮沸完全なタンパク質の抽出。管の上部に上下逆に配置する鉗子を使用し、簡単なスピン（15秒2000 XG）を実行するフィルタを削除します。乾燥したフィルターを廃棄します。 </li><li>目的のタンパク質を検出するために、ウェスタンブロットに続くSDS-PAGEにおける軸索タンパク質調製液10μlを解決します。 NOTE：参考として、20外植片を2日間増殖させ、RIPA溶解緩衝液100μlで溶解製剤からの軸索は4-6のタンパク質濃度を有する。μgの/μL。 </li></ol>フィルターに軸索の7。免疫蛍光検査次の手順は、β-III-チューブリンの検出により例示フィルターインサート上で染色した場合に実行する一般的な操作の概要を説明します。固定剤、インキュベーション時間、濃度およびその他の詳細は、他の抗原抗体対に対して最適化されるべきである。 <ol><li>インサートの次の洗浄およびインキュベーションのために完全に洗浄以前に使用した6ウェルプレートを利用する。 </li><li>簡単に言えば、PBS中のインサートを洗う。シェーカー上で室温で10分間PBS中の新たに調製した4％パラホルムアルデヒドで固定します。 </li><li>固定後、フィルターの下面に排他的に成長した軸索を収集するために、インサートの上面をこすり、清掃。 IFのための標準的なインキュベーションを進める。 </li><li>穏やかに振盪しながらRTで1時間、標準的なボリュームを使用して、（TBS、0.05％のTween20、5％スキムミルク）をブロッキング溶液中にインサートをインキュベートする。 </li><li>転送は、標準的なボリュームを使用して、バッファー（抗β-III-チューブリン、1:5,000）をブロックで希釈した一次抗体に挿入されます。穏やかに振盪しながら4℃でO / N（〜18時間）インキュベートする。 </li><li> PBSで2回、第一の抗体（室温で2×10分間）洗浄します。 </li><li>転送は、標準的なボリュームを使用して、（1:2,000をヤギ抗マウス）を、ブロッキング緩衝液中に希釈し、蛍光結合二次抗体に挿入する。穏やかに振盪しながら室温で2時間光から覆わインキュベートする。 </li><li> PBS（室温で3×10分）で、二次抗体3回洗浄します。 </li><li> IFが完了したら、出挿入取る最後の洗浄から、PBSを離れて注ぎ、綿チップアプリケーターでフィルターの上面を清掃してください。上側と下側から任意の液体を吸引する。 </li><li>場所はベンチに上下逆に挿入して、鋭いメスでインサートの外にフィルタをカット。 </li><li> 、ピンセットでフィルターを保持するまで下振れし、顕微鏡スライド上に配置します。カバーガラスと蛍光互換MOUとオーバーレイntingメディア。光から覆わ低温室で乾燥フラットを、してみましょう。検査し、蛍光顕微鏡を用いて画像を取り込む。 NOTE：4℃で保存し、光から保護した場合、これらの製剤は、蛍光の損失を最小限に抑えて週間にわたって維持することができる。 </li><li>オプション：別の方法として、IFが挿入から削除されたフィルタで実行することができます。そのためには、直接、固定後のフィルターの上側をこすりして清掃してください。 <ol><li> 6ウェルプレートの底に鋭いメスで、場所フィルター軸索アップしてインサートからフィルタを取る。 </li><li> 7.4から7.8と7.11に示すように、その後、IFのためのインキュベーションを行う。この代替の利点は、例えば、インキュベーションボリュームが（7.1から7.11に示すようにフィルターを直接インサート上で染色されているときに使用される3ミリリットルと比較して）500μLにまで行くことができ、ので、それは、試薬を保存することです。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Conde, C., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+assembly,+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites.">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).</li><li>Rasband, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axon+initial+segment+and+the+maintenance+of+neuronal+polarity.">The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).</li><li>Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+as+a+therapeutic+target+in+the+CNS.">Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS.</a> Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).</li><li>Torre, E. R., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+local+protein+synthesis+within+dendrites+using+a+new+cell+culture+system+that+permits+the+isolation+of+living+axons+and+dendrites+from+their+cell+bodies.">Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies.</a> J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).</li><li>Zheng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+role+for+intra-axonal+protein+synthesis+during+axonal+regeneration+from+adult+sensory+neurons.">A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons.</a> J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).</li><li>Willis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+transport+and+local+translation+of+cytoskeletal,+injury-response,+and+neurodegeneration+protein+mRNAs+in+axons.">Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons.</a> J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).</li><li>Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+process-localized+mRNAs+from+cultured+rodent+hippocampal+neurons.">Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).</li><li>Schoenmann, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+degeneration+is+regulated+by+the+apoptotic+machinery+or+a+NAD+-sensitive+pathway+in+insects+and+mammals.">Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals.</a> J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).</li><li>Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XIAP+regulates+caspase+activity+in+degenerating+axons.">XIAP regulates caspase activity in degenerating axons.</a> Cell Rep. 4, 751-763 (2013).</li><li>Ure, D. R., Campenot, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+transport+and+steady-state+distribution+of+125I-nerve+growth+factor+in+rat+sympathetic+neurons+in+compartmented+cultures.">Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures.</a> J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons.">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li><li>Minis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+transcriptomics-Dissection+of+the+mRNA+composition+in+the+axonal+compartment+of+sensory+neurons.">Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons.</a> Dev. Neurobiol. , (2013).</li><li>Niekerk, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sumoylation+in+axons+triggers+retrograde+transport+of+the+RNA-binding+protein+La.">Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophins:+roles+in+neuronal+development+and+function.">Neurotrophins: roles in neuronal development and function.</a> Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).</li><li>Vargas, M. E., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+is+Wallerian+degeneration+in+the+CNS+so+slow.">Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow.</a> Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).</li><li>Waller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+Section+of+the+Glossopharyngeal+and+Hypoglossal+Nerves+of+the+Frog,+and+Observations+of+the+Alterations+Produced+Thereby+in+the+Structure+of+Their+Primitive+Fibres.">Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .</li><li>Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Plating,+and+Maintenance+of+Dorsal+Root+Ganglion+Neurons+for+Monoculture+and+for+Coculture+with+Dorsal+Horn+Neurons.">Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).</li><li>Leach, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+primary+motor+and+sensory+neurons+in+defined+media+on+electrospun+poly-L-lactide+nanofiber+scaffolds.">The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+nicotinamide+adenine+dinucleotide+biosynthetic+pathways+delays+axonal+degeneration+after+axotomy.">Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy.</a> J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

この技術を適応させる際に考慮すべき重要なパラメータは、検討するニューロン集団は、基板、フィルターの細孔径および表面積を含む。これらのすべてのパラメータが得られ、神経突起の準備の特異性、質と量に影響を与える、とエンドユーザーが慎重に検討されなければならない。このプロトコルで示す実施例では、DRGニューロンの使用は、純粋な（特定の）軸索の製剤を与えるだけ軸?...

神経細胞の軸索の区画は、体性樹状区画から機能的自立度が大きく表示されます。投射ニューロンでは、軸索は、神経タンパク質1,2のほとんどが含まれています。最近の研究では、早期の軸索の機能障害は、神経変性疾患や精神神経疾患3の共通の特徴であるように思われることが示されているので、軸索の生理学および病態生理学の研究では、神経科学のコミュニティで勢いを得ています。これは、正常および病的条件下における軸索独占的メカニズムのよりよい理解が機能障害を運転初期事象を解明する可能性が高いようです。 この議定書は、生物化学的に適しており、免疫細胞化学分析の純粋な軸索材料を大量に取得するために多孔質膜（フィルター）を有する培養インサートを使用する方法について説明します。軸索生物学を研究するためのフィルターインサートの使用は、最初のスチュワードによって実装され、同僚4、さらにその現在の構成にトウィスと同僚5によって開発された。技術が研究されたニューロンの集団に対応するために、それぞれの場合にわずかな変更を加えて、軸索と樹状突起生物学のさまざまな側面を研究するグループによる、現在使用中である、行わトリートメント、生化学的分析のタイプは6-9を使用していました。この議定書は、アプリケーションのような様々なすべての選択肢に対応するつもりではなく、ほとんどのアプリケーションに適しています簡単な方法を提供していません。具体的には、ここで説明するプロトコルは、撤回し、栄養因子9から奪わとき速く退化少ない軸索を生産生化学分析のための軸索の歩留まりを最大化し、文献に記載された軸索変性、他のコーティングを勉強するのに最適であるトリプルコーティングを使用しています。 この手順では、神経細胞体は、フィルターの上に分離されたままのWHパリの軸索は、孔を通過し、その底面に沿って成長する。フィルタの下面に成長する（グリアおよびニューロン細胞体の混入物を含まない）純粋な軸索 ​​は、生化学分析のために収集することができ、またはその場で固定し、免疫細胞化学的技法9により調べることができる。手順は、後根神経節（DRG）からの胚性感覚ニューロンの使用に依存している。神経成長因子（NGF）に維持するとき、これらの細胞からの神経突起は、インビトロで迅速かつ強固な増殖を受けるので、この要因を奪われたとき、彼らは急速に変性を受けるため、胚性DRGを広く軸索の生物学を研究するために使用される。この方法で収集されたすべての神経突起は、純粋に軸索になるように、また、DRGニューロンは、樹状突起を欠いている。 フィルタインサートは、軸索を研究するために使用される他のアプローチに比べて大きな利点を示す。 Aのものとは細胞体で発生するプロセスを区別するために顕微鏡を使用することに頼った研究xonsは、限られた生化学的な情報を提供します。別の例として、区画化培養システム（ 例えば 、Campenotチャンバー10又はマイクロ流体デバイス11）は、撮像アプローチのためおよび細胞区画の差分治療に有用であるが、軸索の材料を少量しか提供し、必要とする生化学的分析のためのこれらの技術の使用を排除する試料の比較的大量。また、それらの使用はかなりの訓練並びに特殊な装置を必要とし、それらは時間がかかる。多くの場合、外植片からの軸索を単離するために使用される別のアプローチは、手動で、軸索試料収集の前に（ニューロン細胞体を含む）を外植片の中心部を除去することである。これは軸索に富む準備を大量に生成することができますが、この準備の軸索は、グリアに包まれ、急速に連続して（最小限の実験の例として）6ウェルから20外植片の本体を取り外すことができ、時間がかかり、実現可能性の限界にある。 対照的に、ここに示された方法は、次いで、ウェスタンブロット、免疫沈降6、ノーザンブロット5質量分析計6、RNA精製の ​​ような一般的に全細胞溶解物を分析するために使用される実質的に任意の生化学的手法で分析することができ、豊かで純粋な軸索 ​​の製剤を生成する7,12,13等が挙げられる。それはさらに、IFによってそれらを調べるために、フィルタの下側で成長する軸索を固定することができるように、また、このプロトコルは、免疫蛍光（IF）技術を適用することができる。ない細胞体は、最終的な準備ではありませんので、このアプローチは、大幅に軸索固有のプロセスの分析を容易にします。細胞体からの高免疫蛍光信号は、多くの場合、軸索のような薄い構造から生じる弱い信号の検査および分析を損なうので、これは重要な利点である。 軸索変性ARを研究する培養方法の2つのアプリケーションE説明し;発達剪定や損傷誘発変性のモデルのモデルは、（一般的にウォーラー変性と呼ばれる）。発達剪定のモデル化は、 生体内での感覚ニューロンがターゲット由来のNGFの量を制限し、それらが十分な栄養サポート縮退14の受信に失敗のために競争するという事実に基づいています。この現象は、インビボで起こるように、細胞体の破壊に続いて軸索変性を開始し、培養培地からNGFを引き出すことによって、胚DRG培養物に模倣することができる。ウォーラー変性をモデル化するために、細胞体を持つフィルタの上面が削り取られている。物理的に細胞体から分離し、その後、最初の1850年16現象を報告したA. Wallerの名にちなんで名付けウォーラー変性症15、として知られている迅速かつステレオタイプ変性過程を経るとなり、フィルタの下側に成長していた軸索。

<table><tbody><tr><td>CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td><td>Charles River</td><td></td><td>In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td></tr><tr><td>Falcon cell culture inserts</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 &amp;micro;m pore size, fits 6-well receiving plate</td></tr><tr><td>Falcon cell culture companion plates</td><td>Corning</td><td>353502</td><td>Receiving plates for inserts</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Used at 10 &amp;micro;g/ml in water. Take 100x stock from -80 &amp;deg;C and thaw O/N at 4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PureCol bovine collagen solution</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Can be replaced by DMEM</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 serum-free supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&amp;prime;-deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, beta subunit)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGF antibody</td><td>Prepared in-house</td><td></td><td>As described in: Acheson, A. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. &lt;strong&gt;7&lt;/strong&gt;, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Commercial option</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DRG culture medium&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal Medium&lt;br/&gt; 2% B27 Neurobasal Supplement&lt;br/&gt; 2 mM l-Glutamine&lt;br/&gt; 1% Penicillin-streptomysin&lt;br/&gt; 10 &amp;micro;M FDU&lt;br/&gt; 15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1x Laemmli sample buffer&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS&lt;br/&gt; 50 mM DTT&lt;br/&gt; 60 mM Tris (pH 6.8)&lt;br/&gt; 5% Glycerol&lt;br/&gt; 0.01% (w/v) Bromophenol blue</td></tr></tbody></table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

E13.5マウスから後根神経節外植片を培養液中で2日以内に、2ミリメートルまで到達し、フィルター上で広範囲にポリ-D-リジン、ラミニンおよびコラーゲン（ 図1B、左）でコーティングされた順に成長する。この基質の組み合わせは、特に熱狂的な成長をもたらす。他の組み合わせは、かなり短い軸索得た（ 図1B、右）。また、フィルターに保持さDRGをプラスチック<str...

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

多孔質フィルタを使用した生化学分析のための感覚ニューロンからの軸索の産生および単離

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

production-isolation-axons-from-sensory-neurons-for-biochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K ビュー.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

ビデオ: Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we demonstrate and describe a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on the following steps: (1) dissection of nerve fascicles and separation of connective tissue; (2) incubation of short segments of nerve fascicles in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures; and (3) extraction of the remaining axon-enriched material. Proteomic and biochemical characterization of this preparation has confirmed a high degree of enrichment for axonal components.

We demonstrate a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on dissection of nerve fascicles and incubation in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures, followed by extraction of the remaining axon-enriched material.

ラット坐骨神経からの軸索原形質分離

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

神経科学

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ganglia that line the spinal column. Understanding the receptors and channels expressed by these sensory afferent neurons could lead to novel therapies for disease. The initial step is to identify the specific subset of sensory neurons of interest. Here we describe a method to identify afferent neurons innervating the muscles by retrograde labeling using a fluorescent dye DiI (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate). Understanding the contribution of ion channels to excitation of muscle afferents could help to better control excessive excitability induced by certain disease states such as peripheral vascular disease or heart failure. We used two approaches to identify the voltage dependent ion channels expressed by these neurons, patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry. While electrophysiology plus pharmacological blockers can identify functional ion channel types, we used immunocytochemistry to identify channels for which specific blockers were unavailable and to better understand the ion channel distribution pattern in the cell population. These techniques can be applied to other areas of the nervous system to study specific neuronal groups.

Afferent sensory neurons signal sensory information from the periphery to the central nervous system. Identifying specific afferent neurons will help in understanding their physiology. We describe a method of retrograde labeling to identify afferent neurons, and study the voltage-gated ion channels in these neurons using patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry.

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

発生生物学

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

神経成長因子のキャリアとしてポーラス シリコン膜の設計

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

生物工学

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

体外における感覚神経と運動神経からの線維芽細胞およびシュワン細胞の精製

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

マイクロフルイディクス支援による軸索ミトコンドリアの選択的脱分極

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Isolation of Schwann Cells from Mouse Spinal Roots

Source: He, Q., et al., &#38; Ding, F. <a href="https://app.jove.com/v/60952">Purification of fibroblasts and schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video outlines the isolation and culturing of Schwann cells from mouse spinal roots. Isolated cells are then cultured in specific media. Schwann cells are isolated via differential digestion and adherence. They are subsequently transferred to extracellular matrix-coated coverslips for attachment and proliferation.

マウス脊髄根からのシュワン細胞の単離

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

多孔質フィルタを使用した生化学分析のための感覚ニューロンからの軸索の産生および単離

要約

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この動画の章

ラット坐骨神経からの軸索原形質分離

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

の感覚ニューロンの分離

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

神経成長因子のキャリアとしてポーラスシリコン膜の設計

体外における感覚神経と運動神経からの線維芽細胞およびシュワン細胞の精製

マイクロフルイディクス支援による軸索ミトコンドリアの選択的脱分極

マウス脊髄根からのシュワン細胞の単離

多孔質フィルタを使用した生化学分析のための感覚ニューロンからの軸索の産生および単離

要約

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ラット坐骨神経からの軸索原形質分離

不連続パーコール-ショ糖密度勾配を用いてマウスの皮質からSynaptoneurosomesの調製

培養大人の背根神経節ニューロンの軸索再生の遺伝学的研究

の感覚ニューロンの分離

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

神経成長因子のキャリアとしてポーラス シリコン膜の設計

体外における感覚神経と運動神経からの線維芽細胞およびシュワン細胞の精製

マイクロフルイディクス支援による軸索ミトコンドリアの選択的脱分極

マウス脊髄根からのシュワン細胞の単離

神経成長因子のキャリアとしてポーラスシリコン膜の設計