This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

注：以下の手順は、動物管理のカナダ人評議会によって承認されたガイドラインに従っている。すべての努力は、処置中の疼痛および動物の苦痛を最小限にするために行われる。 フィルタの1。コーティング注：培養フィルターインサートがマルチウェルプレートのウェルに配置された場合、二つの区画が定義されています。トップのコンパートメントは、挿入の上の領域であり、ボトムのコンパートメントは、挿入図1A.ab下の1である。外植片を、それらがフィルタの上側に取り付けられる上部コンパートメントに播種する;多くの軸索は、フィルターを通して成長し、底部区画図1A.c内に、フィルタの下側に延びている。 （ すなわち、コーティング液、洗浄液、培養培地などを適用するための）標準ワーキングボリュームは上部区画のために底部区画2および1mlであり、「のようなプロトコルで言及されようとしている;標準ボリューム」。インサートとウェルの側面との間の隙間にピペットの先端を配置することによって、ボトムのコンパートメントで始まるソリューションを追加します。フィルターの底にトラップされる気泡を防止するためのソリューションを分配しながらも、一方の側に挿入を傾ける。 <ol><li>フィルターをメッキ前日にコーティング開始します。滅菌組織培養フードの下で、6ウェル受けプレートに24ミリメートルフィルターインサートを配置します。一番下の区画に2ミリリットルとトップでの1ミリリットル：標準ボリュームを使用して室温で1時間、水中のポリ-D-リジン（1ミリグラム/ ml）で挿入をインキュベートする。 </li><li>吸引ポリ-D-リジン、水で1回すすいでください。吸引水、ふたを閉じて、フードのO / N中で乾燥プレートを残す液体の吸引中に、直接、フィルタの下に閉じ込められた液体の残骸を削除してください。 </li><li>翌朝、水にラミニン（10μg/ mlの）を希釈して混ぜて暖かい37℃でCELにラミニン1時間で挿入をインキュベート標準ボリュームを使用して37℃でLインキュベーター、。 </li><li>吸引ラミニン、水にコラーゲン（0.1 mg / mlの）を追加し、室温で1時間インキュベートする。この場合、最上部のコンパートメントのために一番下の区画のための2ミリリットルと2ミリリットルを使用しています。 </li><li>吸引コラーゲン、滅菌水で1回洗浄する。 STEP 3に記載されるようにフィルタが、現在培養培地およびDRG外植片を受信する準備ができている。 </li></ol> 2。解剖胚後根神経節（DRG）外植片<ol><li>アベルチン（250 mg / kg）のIP注射により13日間の妊娠雌マウスを麻酔。 10〜15分待ってから、角膜とペダル撤退反射の欠如を確認してください。反射神経が存在しないと、頸椎脱臼を行う。 </li><li> 70％エタノールですべての手術器具と女性の腹部を消毒。楽器を乾燥させる。腹部の皮膚を保持し、腹腔を露出させ、皮膚と筋肉の層を通ってカット。 </li><li>子宮頸部および卵巣から取り外すことにより、子宮を除去します。殺菌中ル·フード、ハサミで子宮から胚を除去し、氷冷L15メディアで満たされたペトリ皿にそれらを収集。氷の上においてください。 注：妊娠17,18の13日の胚を取得する方法についての詳細は、以前の技術レポートをご参照ください。 </li><li>顕微鏡下で、側に胚を置き、頭部を取り除くために、小さな春のはさみを使用しています。胸、腹、手足や尾を廃棄するように側面に沿って切開する。背骨を含む背中を保つ、腹側を上に置き、すべての内臓を取り除く。 </li><li>小さな春のはさみで、正中線に沿って腹側から脊柱を切断することにより、脊髄全体を公開します。鉗子の1組（＃3）でカーカスを押しながら、その最も頭側視点で脊髄を保持するために第二の対を使用しています。 </li><li>ゆっくりと静かに椎骨の空洞からコードを引き出し、超薄型鉗子（＃5）を使用して、脊髄からのDRGをピンチオフ。グループDRGを上で収集される皿の底。 </li><li>その開口部を拡大するために切断された200μlのピペットチップで吸引することによりグループ化されたDRGを収集します。チューブ内のDRGを置き、DRGの収集が完了するまで氷上にしておきます。 注：DRGを、この先端部の壁面に付着しないので（標準黄色チップと比較して）ホワイト/透明ヒントが好ましい。使用前にメディアとヒントをフラッシュすると、さらにその壁に付着するのDRGを防ぐことができます。 </li></ol>フィルターに3。播種し、後根神経節外植片のメンテナンス<ol><li>標準ボリュームを使用してコーティングされたインサートに37℃で完全DRGのメディアを追加します。 NGFのないトップのコンパートメントを維持しながら、NGFの15 ng / mlの底の区画メディアを補完する。 NOTE：NGFを効率的にフィルタを横切って拡散し、その濃度は時間以内に平衡が、我々は直接播種する前に、底部区画にNGFを適用すること有意Bの軸索の収率を増加させることを観察したフィルターのottom表面。 </li><li>その開口部を拡大するためにトリミングされたチップで千μLピペットを用いてフィルターにチューブからのDRGを転送します。 </li><li>のDRGを収集する前に、先端2〜3倍にメディアを描画します。これは、先端の内側に付着するのを防ぐことができます。同じチップを全てのウェルに再使用することができる。 （標準ブルーチップに対して）無着色のヒントを使用すると、先端面にDRGの付着を低減します。 </li><li>のDRGを転送するには、800μLのピペットを設定します。吸引除去フィルタの上側からのメディアの約200μlを、そしてDRG-含むチューブに移動して、上下に小さな体積をピペット - 底に沈めてきたのDRGを再懸濁する。全編、インサートの中央に先端を沈めるピペットのDRGを吸引。 </li><li>一度すべての挿入がロードされ、プレートの蓋を閉じて、プレート10倍渦巻、各スワール間フードベンチに静かに叩く。これらの動きはDRG外植片シンク支援することにより、軸索の収率を増加させフィルターに付着する。これはまた別の外植片からの軸索が重ならないように均等に外植片を分配するのに役立ちます。 注：前の手順で説明した外植片の播種手順が大幅に（75％まで）基板に外植片の添付ファイルの全体的な速度を増加させる。最も重要なことは、ピペットする手順を容易に媒体表面上に浮遊代わりに、インサートの底に沈んでから外植片を防止する。 </li><li>生化学的分析のために、フィルターごと（30前後）1胚からのシードのDRG。形態学的分析のために、半分または1胚（10〜15）からのDRGの第三のいずれかを使用する。チューブのすべてのDRGは、（それが30、15、または10のDRGであるかどうか）単一のウェルに播種されるように、この決定は、チューブにDRGをを収集する前に行わなければならない。 </li><li> 2〜3日ごとにメディアを変更し、37℃で細胞培養器内の文化を維持している。メディアを変更するには、下のコンパートメントに続いて、最初のトップのコンパートメントを吸引する。標準ボリュームに新鮮な培地を追加下部コンパートメントから始まるのです。 注：乾燥から細胞/軸索を防止するために、同時に複数の3の挿入にメディアを変更しないでください。 NGFの存在下でフィルター上に成長したDRGを培養液中で2日後に2ミリメートルまで到達し、長い軸索を拡張します。 </li></ol> 4。栄養因子撤退トリートメント NGFの撤退は最初の撤退後の約12時間後に表示されます（位相差とβ-III-チューブリンIFによって決定）軸索の断片化と軸索変性を誘導する。完全な断片化は、36時間までに達成される。どのくらい変性は進行したままにする実験計画に従って、エンドユーザによって選択されな​​ければならない。 <ol><li> NGFを欠いており、残りの（または内因性に産生される）、NGFを隔離する抗NGF抗体（1μg/ mlの）が含まれているメディアへの上部と下部の区画からの2日間の軸索伸長相、変化媒体の後。 </li><li>可能にするために細胞インキュベーター（37℃）にプレートを戻す所望の時間進行さNGF離脱誘発性の変性。 </li><li>ウェスタンブロットによる検査のためにタンパク質抽出する（ステップ6）を行って、または直接場合（ステップ7）することで、フィルタを調べます。 </li></ol>ウォーラー変性を誘導するために5。軸索切断この手順は、それらの細胞体から離脱フィルタの下側に軸索を残し、それ以外は無傷。その後、これらの軸索は急速ウォーラー変性を開始する。最初の切断後3時間で表示されます（IF位相コントラストまたはβ-III-チューブリンによって証明）軸索断片化; 9時間で、軸索は完全に断片化され、フィルタから切り離されています。どのくらい変性は進行したままにする実験計画に従って、エンドユーザによって選択されな​​ければならない。 <ol><li>細胞スクレーパーで、成長したDRG外植片を含む、フィルターの上側をこすり。 X軸、Y軸、および円形にスクレーパーを移動することで、トップの材料の完全な除去を確実方向。 </li><li>フィルターから掻き取り、NGF（10 ng / mlの）を含む予め温め、完全のDRG培地1mlと交換された浮遊植片を含むトップのコンパートメントからメディアを捨てる。 </li><li>ウォーラー変性がエンドユーザによって選択された時間だけ進行させるためにインキュベーター（37℃）、細胞をプレートに戻す。 </li><li>ウェスタンブロットによる検査のためにタンパク質抽出する（ステップ6）を行って、または直接場合（ステップ7）することで、フィルタを調べます。 </li></ol>軸索のサンプルの6。タンパク質抽出<ol><li>レムリ試料緩衝液の75μlのコレクションチューブ（1.5ミリリットル）を入力します。フィルタのセット全体から軸索を収穫しながら、氷の上でチューブを保持します。 </li><li> PBSにDRG外植片でフィルターを洗浄し、フィルターの上側をこすり。プレートからカバーを取り外し綿チップアプリケーターでフィルターの上面をきれいにし、上側と下側から余分なPBSを吸引除去する。 </li><li>場所インサート逆さまベンチに鋭いメスを用いて、インサートからフィルタをカット。鉗子、ボトムアップのフィルタを保持する。はさみでフィルタの中心周から切​​断を行う。 </li><li>収集チューブの上に置き、フィルタ、およびピンセットで、チューブダウンフィルタの中心を押してください。これを実行しながら、漏斗が形成すべきである。それはLaemmliサンプル緩衝液中に浸漬されるように、チューブの底部に漏斗状のフィルタを押してください。 </li><li> 4分間のチューブを煮沸完全なタンパク質の抽出。管の上部に上下逆に配置する鉗子を使用し、簡単なスピン（15秒2000 XG）を実行するフィルタを削除します。乾燥したフィルターを廃棄します。 </li><li>目的のタンパク質を検出するために、ウェスタンブロットに続くSDS-PAGEにおける軸索タンパク質調製液10μlを解決します。 NOTE：参考として、20外植片を2日間増殖させ、RIPA溶解緩衝液100μlで溶解製剤からの軸索は4-6のタンパク質濃度を有する。μgの/μL。 </li></ol>フィルターに軸索の7。免疫蛍光検査次の手順は、β-III-チューブリンの検出により例示フィルターインサート上で染色した場合に実行する一般的な操作の概要を説明します。固定剤、インキュベーション時間、濃度およびその他の詳細は、他の抗原抗体対に対して最適化されるべきである。 <ol><li>インサートの次の洗浄およびインキュベーションのために完全に洗浄以前に使用した6ウェルプレートを利用する。 </li><li>簡単に言えば、PBS中のインサートを洗う。シェーカー上で室温で10分間PBS中の新たに調製した4％パラホルムアルデヒドで固定します。 </li><li>固定後、フィルターの下面に排他的に成長した軸索を収集するために、インサートの上面をこすり、清掃。 IFのための標準的なインキュベーションを進める。 </li><li>穏やかに振盪しながらRTで1時間、標準的なボリュームを使用して、（TBS、0.05％のTween20、5％スキムミルク）をブロッキング溶液中にインサートをインキュベートする。 </li><li>転送は、標準的なボリュームを使用して、バッファー（抗β-III-チューブリン、1:5,000）をブロックで希釈した一次抗体に挿入されます。穏やかに振盪しながら4℃でO / N（〜18時間）インキュベートする。 </li><li> PBSで2回、第一の抗体（室温で2×10分間）洗浄します。 </li><li>転送は、標準的なボリュームを使用して、（1:2,000をヤギ抗マウス）を、ブロッキング緩衝液中に希釈し、蛍光結合二次抗体に挿入する。穏やかに振盪しながら室温で2時間光から覆わインキュベートする。 </li><li> PBS（室温で3×10分）で、二次抗体3回洗浄します。 </li><li> IFが完了したら、出挿入取る最後の洗浄から、PBSを離れて注ぎ、綿チップアプリケーターでフィルターの上面を清掃してください。上側と下側から任意の液体を吸引する。 </li><li>場所はベンチに上下逆に挿入して、鋭いメスでインサートの外にフィルタをカット。 </li><li> 、ピンセットでフィルターを保持するまで下振れし、顕微鏡スライド上に配置します。カバーガラスと蛍光互換MOUとオーバーレイntingメディア。光から覆わ低温室で乾燥フラットを、してみましょう。検査し、蛍光顕微鏡を用いて画像を取り込む。 NOTE：4℃で保存し、光から保護した場合、これらの製剤は、蛍光の損失を最小限に抑えて週間にわたって維持することができる。 </li><li>オプション：別の方法として、IFが挿入から削除されたフィルタで実行することができます。そのためには、直接、固定後のフィルターの上側をこすりして清掃してください。 <ol><li> 6ウェルプレートの底に鋭いメスで、場所フィルター軸索アップしてインサートからフィルタを取る。 </li><li> 7.4から7.8と7.11に示すように、その後、IFのためのインキュベーションを行う。この代替の利点は、例えば、インキュベーションボリュームが（7.1から7.11に示すようにフィルターを直接インサート上で染色されているときに使用される3ミリリットルと比較して）500μLにまで行くことができ、ので、それは、試薬を保存することです。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

この技術を適応させる際に考慮すべき重要なパラメータは、検討するニューロン集団は、基板、フィルターの細孔径および表面積を含む。これらのすべてのパラメータが得られ、神経突起の準備の特異性、質と量に影響を与える、とエンドユーザーが慎重に検討されなければならない。このプロトコルで示す実施例では、DRGニューロンの使用は、純粋な（特定の）軸索の製剤を与えるだけ軸?...

神経細胞の軸索の区画は、体性樹状区画から機能的自立度が大きく表示されます。投射ニューロンでは、軸索は、神経タンパク質1,2のほとんどが含まれています。最近の研究では、早期の軸索の機能障害は、神経変性疾患や精神神経疾患3の共通の特徴であるように思われることが示されているので、軸索の生理学および病態生理学の研究では、神経科学のコミュニティで勢いを得ています。これは、正常および病的条件下における軸索独占的メカニズムのよりよい理解が機能障害を運転初期事象を解明する可能性が高いようです。 この議定書は、生物化学的に適しており、免疫細胞化学分析の純粋な軸索材料を大量に取得するために多孔質膜（フィルター）を有する培養インサートを使用する方法について説明します。軸索生物学を研究するためのフィルターインサートの使用は、最初のスチュワードによって実装され、同僚4、さらにその現在の構成にトウィスと同僚5によって開発された。技術が研究されたニューロンの集団に対応するために、それぞれの場合にわずかな変更を加えて、軸索と樹状突起生物学のさまざまな側面を研究するグループによる、現在使用中である、行わトリートメント、生化学的分析のタイプは6-9を使用していました。この議定書は、アプリケーションのような様々なすべての選択肢に対応するつもりではなく、ほとんどのアプリケーションに適しています簡単な方法を提供していません。具体的には、ここで説明するプロトコルは、撤回し、栄養因子9から奪わとき速く退化少ない軸索を生産生化学分析のための軸索の歩留まりを最大化し、文献に記載された軸索変性、他のコーティングを勉強するのに最適であるトリプルコーティングを使用しています。 この手順では、神経細胞体は、フィルターの上に分離されたままのWHパリの軸索は、孔を通過し、その底面に沿って成長する。フィルタの下面に成長する（グリアおよびニューロン細胞体の混入物を含まない）純粋な軸索 ​​は、生化学分析のために収集することができ、またはその場で固定し、免疫細胞化学的技法9により調べることができる。手順は、後根神経節（DRG）からの胚性感覚ニューロンの使用に依存している。神経成長因子（NGF）に維持するとき、これらの細胞からの神経突起は、インビトロで迅速かつ強固な増殖を受けるので、この要因を奪われたとき、彼らは急速に変性を受けるため、胚性DRGを広く軸索の生物学を研究するために使用される。この方法で収集されたすべての神経突起は、純粋に軸索になるように、また、DRGニューロンは、樹状突起を欠いている。 フィルタインサートは、軸索を研究するために使用される他のアプローチに比べて大きな利点を示す。 Aのものとは細胞体で発生するプロセスを区別するために顕微鏡を使用することに頼った研究xonsは、限られた生化学的な情報を提供します。別の例として、区画化培養システム（ 例えば 、Campenotチャンバー10又はマイクロ流体デバイス11）は、撮像アプローチのためおよび細胞区画の差分治療に有用であるが、軸索の材料を少量しか提供し、必要とする生化学的分析のためのこれらの技術の使用を排除する試料の比較的大量。また、それらの使用はかなりの訓練並びに特殊な装置を必要とし、それらは時間がかかる。多くの場合、外植片からの軸索を単離するために使用される別のアプローチは、手動で、軸索試料収集の前に（ニューロン細胞体を含む）を外植片の中心部を除去することである。これは軸索に富む準備を大量に生成することができますが、この準備の軸索は、グリアに包まれ、急速に連続して（最小限の実験の例として）6ウェルから20外植片の本体を取り外すことができ、時間がかかり、実現可能性の限界にある。 対照的に、ここに示された方法は、次いで、ウェスタンブロット、免疫沈降6、ノーザンブロット5質量分析計6、RNA精製の ​​ような一般的に全細胞溶解物を分析するために使用される実質的に任意の生化学的手法で分析することができ、豊かで純粋な軸索 ​​の製剤を生成する7,12,13等が挙げられる。それはさらに、IFによってそれらを調べるために、フィルタの下側で成長する軸索を固定することができるように、また、このプロトコルは、免疫蛍光（IF）技術を適用することができる。ない細胞体は、最終的な準備ではありませんので、このアプローチは、大幅に軸索固有のプロセスの分析を容易にします。細胞体からの高免疫蛍光信号は、多くの場合、軸索のような薄い構造から生じる弱い信号の検査および分析を損なうので、これは重要な利点である。 軸索変性ARを研究する培養方法の2つのアプリケーションE説明し;発達剪定や損傷誘発変性のモデルのモデルは、（一般的にウォーラー変性と呼ばれる）。発達剪定のモデル化は、 生体内での感覚ニューロンがターゲット由来のNGFの量を制限し、それらが十分な栄養サポート縮退14の受信に失敗のために競争するという事実に基づいています。この現象は、インビボで起こるように、細胞体の破壊に続いて軸索変性を開始し、培養培地からNGFを引き出すことによって、胚DRG培養物に模倣することができる。ウォーラー変性をモデル化するために、細胞体を持つフィルタの上面が削り取られている。物理的に細胞体から分離し、その後、最初の1850年16現象を報告したA. Wallerの名にちなんで名付けウォーラー変性症15、として知られている迅速かつステレオタイプ変性過程を経るとなり、フィルタの下側に成長していた軸索。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td>
			<td style="width:140px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:416px;">In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353102</td>
			<td>1 &#181;m pore size, fits 6-well receiving plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Companion Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353502</td>
			<td>Receiving plates for inserts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td style="width:416px;">Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 &#176;C and thaw overnight at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureCol Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>Can be replaced by DMEM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum-Free Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGF (2.5S, beta subunit)</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLMCNET-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="109" rowspan="2" style="height:109px;width:297px;">Anti-NGF Antibody</td>
			<td style="width:140px;">Prepared in-house</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:416px;">As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. &#38; Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">AN-240</td>
			<td>Commercial option</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Tubulin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRG culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:297px;">Neurobasal Medium 
			2 % B27 Neurobasal Supplement 
			2 mM l-Glutamine 
			1 % Penicillin-Streptomysin 
			10 &#181;M FDU 
			15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Laemmli Sample Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:297px;">10 % SDS 
			0.5 M DTT 
			0.5 M Tris (pH 6.8) 
			5 % Glycerol 
			0.01 % (w/v) Bromophenol blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

E13.5マウスから後根神経節外植片を培養液中で2日以内に、2ミリメートルまで到達し、フィルター上で広範囲にポリ-D-リジン、ラミニンおよびコラーゲン（ 図1B、左）でコーティングされた順に成長する。この基質の組み合わせは、特に熱狂的な成長をもたらす。他の組み合わせは、かなり短い軸索得た（ 図1B、右）。また、フィルターに保持さDRGをプラスチック<str...

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

多孔質フィルタを使用した生化学分析のための感覚ニューロンからの軸索の産生および単離

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K ビュー.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

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Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

の形態素解析ショウジョウバエ</em遺伝モザイクを使用>幼虫末梢感覚ニューロンの樹状突起と軸索

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

神経科学

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

の感覚ニューロンの分離<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em&gt;グルタミン酸作動電流のパッチクランプ記録のために

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

ニワトリ胚から解離感覚ニューロンの単離および培養

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

の除去<em&gt;ショウジョウバエ</em感覚ニューロンおよび表皮細胞の免疫蛍光分析のための幼虫の切り身から&gt;筋肉組織

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...