This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

HINWEIS: Die folgenden Verfahren sind in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council von Animal Care genehmigt. Alle Anstrengungen gemacht werden, um Schmerzen und Leiden der Tiere während der Verfahren zu minimieren. 1. Beschichtung der Filter HINWEIS: Wenn Kultur Filtereinsätze in Vertiefungen der Multiwellplatten gelegt werden zwei Kammern definiert: die obere Kammer ist der Bereich oberhalb des Einsatzes und die untere Kammer ist der unterhalb des Einsatzes Fig. 1A.ab. Explantate werden im oberen Fach, wo sie an der Oberseite des Filters befestigen ausgesät; viele Axone wachsen durch den Filter erstrecken, und an der Unterseite des Filters, in dem Bodenfach Fig. 1A.c. Die Standard-Arbeitsvolumen (dh zum Auftragen von Beschichtungslösung, Waschanlagen, Kulturmedien, etc) sind 2 ml für das Bodenfach und 1 ml für die obere Fach und gehen, um im Protokoll als &quot;bezeichnet werden, Standard-Bände &quot;. Hinzufügen Lösungen, beginnend mit der unteren Kammer, indem die Spitze der Pipette in den Spalt zwischen dem Einsatz und der Seite der Vertiefung. Auch neigen die Einlage an einer Seite unter Verzicht auf die Lösung von Blasen auf der Unterseite des Filters eingeschlossen werden. <ol><li> Starten Sie die Beschichtung der Filter am Tag vor der Beschichtung. Unter der sterilen Gewebekultur Haube, legen 24 mm Filtereinsätze in einer 6-Well-Aufnahmeplatte. Einsätze inkubieren mit Poly-D-Lysin in Wasser (1 mg / ml) für 1 h bei RT unter Verwendung von Standardvolumen: 2 ml in der unteren Kammer und 1 ml in der Spitze. </li><li> Saugen Poly-D-Lysin und einmal mit Wasser spülen. Saugen Sie Wasser, schließen Sie den Deckel, und die Platten in der Haube O / N. trocknen Während der Aspiration von Flüssigkeiten, stellen Sie sicher, einen Rest von Flüssigkeit, die direkt unter dem Filter aufgefangen wird zu entfernen. </li><li> Am nächsten Morgen, verdünnte Laminin in Wasser (10 g / ml), mischen und warm bei 37 ° C Einsätze Inkubation mit Laminin 1 Stunde in cell bei 37 ° C, unter Verwendung von Standardmengen. </li><li> Saugen Laminin und fügen Kollagen in Wasser (0,1 mg / ml) und Inkubation für 1 h bei RT. In diesem Fall verwenden 2 ml für das Bodenfach und 2 ml für den oberen Teil. </li><li> Saugen Kollagen und einmal mit sterilem Wasser waschen. Die Filter sind nun bereit, Kulturmedien und DRG Explantate erhalten, wie in Schritt 3 beschrieben. </li></ol> 2. Dissecting Embryonale Spinalganglion (DRG) Explantate <ol><li> Betäuben eine 13-Tage-schwangeren weiblichen Maus durch eine IP-Injektion von Avertin (250 mg / kg). Warten Sie 10-15 Minuten und überprüfen Sie die fehlende Hornhaut-und Pedal Rückzug Reflexe. Sobald Reflexe fehlen, führen Genickbruch. </li><li> Desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumenten und weiblichen Unterleib mit 70% Ethanol. Instrumente erlauben zu trocknen. Halten Sie die Haut am Bauch und schnitt durch die Haut-und Muskelschichten der Bauchhöhle aus. </li><li> Entfernen des Uterus durch Ablösen von der Zervix und Eierstöcke. In einer Sterile Haube, entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter mit einer Schere und sammeln sie in einer Petrischale mit eiskaltem L15 Medien gefüllt. Halten Sie auf dem Eis. HINWEIS: Siehe vorherige technische Berichte für weitere Informationen darüber, wie man Embryonen von 13 Tagen der Trächtigkeit 17,18 zu erhalten. </li><li> Unter dem Mikroskop zu legen, den Embryo auf einer Seite und mit kleinen Feder Schere, um den Kopf zu entfernen. Einen Einschnitt entlang den Seiten, um die Brust, Bauch, Gliedmaßen und Schwanz zu verwerfen. Halten Sie den Rücken mit der Wirbelsäule, lag Bauchseite nach oben und entfernen Sie alle inneren Organe. </li><li> Mit kleinen Feder Schere, setzen die gesamte Rückenmark, indem die Wirbelsäule aus ihrer Bauchseite entlang der Mittellinie. Halten Sie die Karkasse unten mit einer Pinzette (# 3) und mit einem zweiten Paar, um das Rückenmark von seiner rostralen Bereich zu halten. </li><li> Langsam und ziehen Sie das Kabel von den Wirbelhöhle und kneifen Sie DRGs aus dem Rückenmark mit ultra-dünnen Pinzette (# 5). Gruppe die DRGs auf gesammelt werdender Boden der Schale. </li><li> Sammeln gruppiert DRGs durch Absaugen mit einer 200 ul Pipettenspitze, die abgeschnitten wurde, um seine Öffnung zu vergrößern. Legen Sie die DRGs in einem Rohr und lassen auf Eis, bis die DRG-Kollektion ist fertig. HINWEIS: Weiß / transparent Tipps werden bevorzugt, weil DRGs nicht den Mauern dieser Spitze haften bleiben (im Vergleich zu Standard-gelben Spitzen). Flushing Spitzen mit Medien vor dem Gebrauch verhindert ferner, dass DRGs vom Kleben an seinen Wänden. </li></ol> 3. Saat und Pflege von Wurzel-Knotenrücken Explantate auf Filter <ol><li> Fügen komplette DRG Medien bei 37 ° C zu den beschichteten Einsätze mit Standard-Bände. Ergänzen Sie die Bodenfach-Medien mit 15 ng / ml NGF, während NGF frei halten die obere Fach. HINWEIS: Obwohl NGF effizient diffundiert durch den Filter und seine Konzentration im Gleichgewicht innerhalb weniger Stunden haben wir beobachtet, dass die Anwendung von NGF auf die Bodenfach direkt vor der Aussaat axonalen Rendite der b deutlich erhöhtottom Oberfläche des Filters. </li><li> Übertragen Sie die DRGs aus der Tube auf die Filter mit einem 1000 ul Pipette mit einer Spitze getrimmt, um ihre Öffnung zu vergrößern. </li><li> Zeichnen Medien in der Spitze 2-3x vor der Erhebung der DRGs. Dies verhindert ein Festkleben an der Innenseite der Spitze. Das gleiche Spitze kann für alle Vertiefungen wieder verwendet werden. Die Verwendung von ungefärbten Tipps (gegenüber Standard-blauen Spitzen) reduziert DRG Festhalten an der Oberfläche der Spitze. </li><li> So übertragen DRGs, stellen Sie die Pipette in 800 ul. Saugen Sie ca. 200 ul Medium von der Oberseite des Filters, dann auf die DRG-haltigen Rohr gehen und Pipette eine kleine Menge auf und ab - auf DRGs, die auf den Boden versenkt haben resuspendieren. Saugen Sie das ganze Volumen und Pipetten DRGs Eintauchen der Spitze in der Mitte des Einsatzes. </li><li> Sobald alle Einsätze geladen werden, schließen Sie den Deckel und Platte schwenken Sie die Platte 10x, leichte Schläge auf die Motorhaube Bank zwischen jedem Wirbel. Diese Bewegungen erhöhen axonalen Ausbeute, indem DRG Explantate Waschbecken undbefestigen des Filters. Dies hilft auch, verteilen Explantate gleichmäßig, so dass Axone aus verschiedenen Explantaten nicht überlappen. HINWEIS: Die in den vorherigen Schritten beschrieben Explantation Impfvorgangs signifikant die Gesamtrate der Explantation Bindung an das Substrat (bis 75%) erhöht. Am wichtigsten ist, die Pipettiervorgang leicht verhindert Explantaten aus schwimmend auf der Oberfläche des Mediums statt sinken auf den Boden des Einsatzes. </li><li> Für biochemische Analysen, Samen DRGs von einem Embryo (ca. 30) pro Filter. Für morphologische Analysen, verwenden Sie entweder die Hälfte oder ein Drittel der DRGs von einem Embryo (10-15). Diese Entscheidung muss vor der Erhebung der DRGs in Rohre hergestellt werden, so dass alle DRGs eines Rohres in einem einzigen Well ausgesät (ob es 30, 15 oder 10 DRGs). </li><li> Pflegen Kulturen in einer Zellbrutschrank bei 37 ° C, verändernden Medien alle 2-3 Tage. Um Medien zu ändern, saugen Sie den oberen Fach ersten, von der Bodenfach gefolgt. In frischem Medium in Standardvolumens, beginnend mit dem Bodenfach. HINWEIS: Um Zellen / Axone Austrocknen zu verhindern, Medien in mehr als 3 Einsätze ändern sich nicht zur gleichen Zeit. DRGs auf Filter in Gegenwart von NGF gezüchtet wird Axone zu verlängern, die bis zu 2 mm nach 2 Tagen in Kultur. </li></ol> 4. Trophic Factor Entzugsbehandlung NGF Rückzug induziert axonale Degeneration mit axonalen Fragmentierung (durch Phasenkontrast-und β-III-Tubulin bestimmt IF), die zuerst erscheint rund 12 Stunden nach der Entnahme. Komplette Fragmentierung wird von 36 h erreicht. Wie lange die Degeneration läßt gehen für muss durch den Anwender gemäß der Versuchsanordnung gewählt werden. <ol><li> Nach der 2-Tages-axonalen Verlängerungsphase, ändern Sie Medien von oben und unten Fächer für Medien, die NGF fehlt und enthält Anti-NGF-Antikörper (1 ug / ml), um alle verbleibenden (oder endogen produziert) NGF maskieren. </li><li> Zurück Platten zu Zelle Inkubator (37 ° C), damitNGF-Entzug induzierte Degeneration für die gewünschte Zeitdauer fort. </li><li> Gehen Sie zur Proteinextraktion (Schritt 6) zur Prüfung durch Western-Blot-oder die Filter direkt untersuchen von IF (Schritt 7). </li></ol> 5. Axonal Trennung zu Waller-Degeneration herbei Dieses Verfahren lässt die Axone auf der Unterseite des losgelöst von ihrer Zellkörperfilter, aber ansonsten unversehrt. Danach diese Axone schnell einzuleiten Waller-Degeneration. Axonal Fragmentierung (durch Phasenkontrast-oder β-III-Tubulin belegt IF) zuerst erscheint nach 3 h nach Durchtrennung; um 9 h, sind Axone völlig zersplittert und werden von dem Filter gelöst. Wie lange die Degeneration läßt gehen für muss durch den Anwender gemäß der Versuchsanordnung gewählt werden. <ol><li> Kratzen Sie die Oberseite des Filters enthält gewachsen DRG Explantate, mit einem Zellschaber. Achten Sie darauf, die vollständige Entfernung von Top-Material, indem Sie Schaber in X-, Y-und KreisRichtungen. </li><li> Entsorgen Sie die Medien aus dem oberen Fach mit den schwimmenden Explantate, die aus dem Filter gekratzt worden sind, und ersetzen mit 1 ml vorgewärmten, komplett DRG Medien mit NGF (10 ng / ml). </li><li> Das Rückplatte Inkubator (37 º C) Zell Waller-Degeneration für die Zeitdauer von dem Endbenutzer ausgewählt ablaufen zu lassen. </li><li> Gehen Sie zur Proteinextraktion (Schritt 6) zur Prüfung durch Western-Blot-oder die Filter direkt untersuchen von IF (Schritt 7). </li></ol> 6. Proteinextraktion von Axonal Proben <ol><li> Füllen Röhrchen (1,5 ml) mit 75 ul Laemmli-Probenpuffer. Halten Röhrchen auf Eis, während der Ernte Axone aus der gesamten Reihe von Filtern. </li><li> Waschen Sie den Filter mit DRG Explantate in PBS und kratzen die Oberseite des Filters. Entfernen Sie den Einsatz aus der Platte, reinigen Sie die Oberseite des Filters mit einem Baumwoll-Spitze-Applikator und saugen Sie keine zusätzliche PBS aus den Ober-und Unterseite. </li><li> Ort eingeben Kopfauf der Werkbank und schneiden Sie den Filter aus dem Einsatz mit einem scharfen Skalpell. Halten Sie den Filter mit einer Pinzette, unten nach oben. Einen Schnitt von dem Umfang zu der Mitte des Filters mit einer Schere. </li><li> Platzieren Sie den Filter auf der Oberseite der Sammelröhrchen und mit einer Pinzette, drücken Sie die Mitte des Filters in den Schlauch. Während dies zu tun, sollte ein Trichter bilden. Drücken Sie die trichterförmige Filter mit dem Boden des Rohres, so daß er in Laemmli-Probenpuffer eingetaucht. </li><li> Komplette Proteinextraktion durch Kochen der Rohre für 4 min. Entfernen Sie den Filter mit einer Pinzette auf der Oberseite nach unten in die Oberseite der Röhre legen und die Durchführung einer kurzen Spin (2.000 g für 15 sec). Die getrockneten Filter entsorgen. </li><li> Beheben 10 ul der axonalen Proteinpräparat in einer SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot der Proteine ​​von Interesse zu detektieren. HINWEIS: Als Referenz eine axonale Herstellung von 20 Explantaten für 2 Tage gezüchtet und in 100 ul RIPA-Lysepuffer eine Proteinkonzentration von 4-6 habenug / ul. </li></ol> 7. Immunfluoreszenz-Untersuchung der Axone auf Filter Die folgenden Schritte beschreiben die allgemeinen Manipulationen durchführen, wenn der Färbung auf Filtereinsätze, durch den Nachweis von β-III-Tubulin veranschaulicht. Fixiermittel, Inkubationszeiten, Konzentrationen und andere Angaben sollten für andere Antigen-Antikörperpaare optimiert werden. <ol><li> Nutzen bisher verwendeten 6-well-Platten, gründlich gereinigt, für die folgenden Waschschritte und die Inkubationen der Einsätze. </li><li> Kurz waschen Einsätze in PBS. Beheben sie in frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd in PBS für 10 min bei RT auf Schüttler. </li><li> Nach der Fixierung, kratzen und reinigen Sie die Oberseite des Einsatzes, um die Axone, die ausschließlich auf der Bodenfläche des Filter wuchs zu sammeln. Fahren Sie mit dem Standard-Inkubationen für IF. </li><li> Einsätze inkubieren in Blockierlösung (TBS, 0,05% Tween 20, 5% Magermilch), unter Verwendung von Standardmengen, für 1 h bei RT unter leichtem Schütteln. </li><li> Übereinsätze zur primären Antikörper in Blockierungspuffer (anti-β-III-Tubulin, 1:5000) unter Verwendung von Standardvolumen verdünnt. Inkubieren O / N (~ 18 h) bei 4 ° C unter leichtem Schütteln. </li><li> Zweimal in PBS (2 × 10 min bei RT) Waschen des ersten Antikörpers. </li><li> Über fügt Fluoreszenz-konjugierten Sekundärantikörper in Blockierungspuffer (Ziege-Anti-Maus, 1:2000) unter Verwendung von Standardvolumen verdünnt. Inkubieren bedeckt von Licht für 2 Stunden bei RT unter leichtem Schütteln. </li><li> In PBS (3 x 10 min bei RT) Waschen Sie den sekundären Antikörper 3x. </li><li> Nach IF abgeschlossen ist, nehmen Einsatz aus, abgießen PBS aus dem letzten Waschen und reinigen Sie die Oberseite des Filters mit einem Baumwoll-Spitze-Applikator. Saugen Sie keine Flüssigkeit aus den Ober-und Unterseite. </li><li> Ort eingeben Upside-Down auf der Bank, und schneiden Sie den Filter aus dem Einsatz mit einem scharfen Skalpell. </li><li> Halten Sie den Filter mit einer Pinzette, von unten nach oben, und legen Sie auf Mikroskopie Rutsche. Overlay mit einem Deckglas und Leuchtstoffröhren-kompatiblen mounting Medien. Lassen Sie trocknen in Kühlraum, von Licht bedeckt. Untersuchen und Bilder zu erfassen mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops. HINWEIS: Wenn bei 4 ° C gelagert und vor Licht geschützt sind, können diese Präparate Wochen mit minimalem Verlust an Fluoreszenz gehalten werden. </li><li> OPTIONAL: Alternativ, wenn Sie auf Filter, die aus dem Einsatz entfernt wurden, durchgeführt werden. Um das zu tun, kratzen und reinigen Sie die Oberseite der Filter direkt nach der Fixierung. <ol><li> Nehmen Sie Filter aus den Einsätzen mit einem scharfen Skalpell und Ort Axone Filter-up auf dem Boden einer sechs-Well-Platte. </li><li> Danach durchführen Inkubationen für IF wie in 7,4-7,8 und 7.11 angegeben. Der Vorteil dieser Alternative ist, dass es speichert Reagenzien, da beispielsweise die Inkubation Volumina bis 500 ul (im Vergleich zu den 3 ml verwendet, wenn Filter direkt an den Einsätzen angefärbt, wie in 7,1-7,11 dargestellt) gehen. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Wichtige Parameter, die bei der Anpassung dieser Technik nehmen sind die neuronalen Population, die untersucht werden sollen, ist das Substrat, Porengröße des Filters und Fläche. Alle diese Parameter beeinflussen die Spezifität, die Qualität und Quantität der Neuriten Zubereitung erhalten, und müssen durch den Anwender betrachtet werden. In den in diesem Protokoll angegebenen Beispiele die Verwendung von DRG-Neuronen hat den Vorteil, der sich nur Axone, wodurch ein reines (spezifischen) axonalen Zubereitung. ...

Die axonalen Kompartiment von Neuronen zeigt ein hohes Maß an funktionaler Unabhängigkeit von der somato-dendritischen Fach. In Projektionsneuronen, enthalten die meisten Axone der neuronalen Protein 1,2. Das Studium der Physiologie und Pathophysiologie von Axonen hat Schwung in den Neurowissenschaften gewonnen, weil neuere Studien haben gezeigt, dass die frühe axonalen Dysfunktion scheint ein gemeinsames Merkmal der neurodegenerativen Erkrankungen und neuropsychiatrischen Störungen 3 sein. Es scheint wahrscheinlich, dass ein besseres Verständnis der axonalen-exklusive Mechanismen unter normalen und pathologischen Bedingungen wird Licht auf die frühen Ereignisse, die Dysfunktion fahren zu vergießen. Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie Kultureinsätze verwenden, die mit einem porösen Membran (Filter), um große Mengen von reinem axonalen Material, das geeignet ist für die biochemische und immunzytochemische Analysen zu erhalten. Der Einsatz von Filtereinsätze zu studieren axonalen Biologie wurde zuerst von Steward umgesetzt undKollegen 4 und weiter durch Twiss und Kollegen fünf seiner derzeitigen Konfiguration entwickelt. Die Technik ist jetzt in der aktuellen Nutzung durch Gruppen studieren verschiedene Aspekte der axonalen Dendriten und Biologie, mit leichten Modifikationen in jedem Fall für die Population von Neuronen untersucht zubringen, die durchgeführten Behandlungen und die Art der biochemischen Analysen 6-9. Das vorliegende Protokoll hat nicht die Absicht, alle Alternativen für eine solche Vielzahl von Anwendungen unterzubringen, sondern eine einfache Methode, die für die meisten Anwendungen geeignet ist. Insbesondere die hier beschriebenen Protokoll verwendet eine Dreifach-Beschichtung, die axonalen Ausbeute für biochemische Analysen maximiert und ist bestens geeignet, um in der Literatur beschrieben axonalen Degeneration-anderen Beschichtungen studieren produziert weniger Axone, zurückziehen und schneller degenerieren, wenn sie von Nahrungsfaktoren 9 beraubt. Bei diesem Verfahren bleiben die neuronale Zellkörper oberhalb der Filter wh isoliertile Axone verlaufen durch die Poren und wachsen entlang der Bodenoberfläche. Reine Axone (ohne Glia und neuronale Zellkörper Verunreinigungen), die auf der unteren Oberfläche des Filter wachsen kann für biochemische Analysen gesammelt werden oder kann in situ fixiert und durch immunzytochemische Methoden 9 untersucht werden. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von embryonalen sensorischen Neuronen der dorsalen Wurzelganglien (DRG). Embryonale DRGs sind weit verbreitet, um Biologie zu studieren, weil axonalen Neuriten aus diesen Zellen eine schnelle und robuste Wachstum in vitro, wenn sie in den Nervenwachstumsfaktor (NGF) gehalten, und weil sie schnell unterziehen Degeneration, wenn dieses Faktors beraubt. Auch DRG-Neuronen fehlt Dendriten, so dass alle mit dieser Methode gesammelt Neuriten sind rein Axone. Filtereinsätze stellen im Vergleich zu anderen Ansätzen verwendet, um Axone zu studieren einen großen Vorteil. Untersuchungen sich auf die Verwendung der Mikroskopie zu unterscheiden Prozesse in der Zelle Soma von den in a vorkommendenXON-Fluß einen begrenzten biochemische Information. Als weiteres Beispiel teilten Kultursysteme (zB Campenot Kammern 10 oder 11 Mikrofluidvorrichtungen) sind nützlich zur Bildgebung Ansätze und für eine unterschiedliche Behandlung von Zellkompartimenten, bieten aber nur geringe Mengen des axonalen Material, was die Verwendung dieser Techniken für biochemische Analysen, die erfordern, relativ große Probenmengen. Weitere, ihre Verwendung erfordert eine umfassende Ausbildung sowie spezielle Geräte, und sie zeitaufwendig sind. Ein weiterer Ansatz oft verwendet, um Axone aus Explantaten isolieren ist es, eine Explantation Zentrum (mit neuronalen Zellkörpern), bevor axonalen Probensammlung manuell entfernen. Dies kann zwar große Mengen von Axon-angereicherten Präparationen erzeugen können Axone in dieser Zubereitung in Glia umhüllt und schnell nacheinander Entfernen Körper 20 Explantat von 6 Vertiefungen (als Beispiel eines minimalen Experiment) ist zeitaufwendig und an der Grenze des Machbaren. Im Gegensatz dazu ist die hier vorgestellte Methode liefert reichlich und rein axonalen Vorbereitungen, die dann von nahezu jedem biochemischen Technik, die häufig verwendet wird, um ganze-Zelllysaten analysieren, wie Western-Blot, Immunpräzipitation 6, Northern Blot-5-Massenspektrometrie 6, RNA-Reinigung analysiert werden können 7,12,13, unter anderem. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um (IF)-Techniken Immunfluoreszenz, wie es möglich ist, Axone wachsen in der unteren Seite des Filters weiter zu untersuchen, indem sie IF fixieren. Dieser Ansatz erleichtert die Analyse der axonalen spezifische Prozesse, da es keine Zellkörper in der letzten Vorbereitung. Dies ist ein bedeutender Vorteil, da eine hohe Immunfluoreszenzsignal vom Zellkörper oft untergräbt Prüfung und Analyse von einem schwächeren Signal von dünnen Strukturen wie Axone stammen. Zwei Anwendungen der Methode zur Kultur axonalen Degeneration ar studierene beschrieben; ein Modell der Entwicklungs Beschneiden und Modell Verletzungs-induzierte Degeneration (gemeinhin als Waller-Degeneration bezeichnet). Die Modellierung der Entwicklungs Beschneiden basiert auf der Tatsache, daß sensorische Neuronen in vivo für limitierende Mengen an Ziel-abgeleitete NGF und diejenigen weil es nicht genug neurotrophen Unterstützung degenerierten 14 empfangen Wettbewerb basiert. Dieses Phänomen kann in embryonalen DRG-Kulturen durch Abziehen von NGF aus den Kulturmedien, die, wie es in vivo auslöst axonale Degeneration, gefolgt von Zellkörper Zerstörung nachgeahmt werden. Waller-Degeneration zu modellieren, wird die obere Seite des Filters mit den Zellkörpern abgeschabt. Die Axone, die auf der Unterseite des Filters werden physikalisch von den Zellkörpern getrennt und danach die schnelle und stereotype degenerativen Prozess wie Waller-Degeneration 15 bekannt ist, nach A. Waller genannt, der als erster das Phänomen berichtet, im Jahr 1850 16 ziehen gewachsen.

<table><tbody><tr><td>CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td><td>Charles River</td><td></td><td>In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td></tr><tr><td>Falcon cell culture inserts</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 &amp;micro;m pore size, fits 6-well receiving plate</td></tr><tr><td>Falcon cell culture companion plates</td><td>Corning</td><td>353502</td><td>Receiving plates for inserts</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Used at 10 &amp;micro;g/ml in water. Take 100x stock from -80 &amp;deg;C and thaw O/N at 4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PureCol bovine collagen solution</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Can be replaced by DMEM</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 serum-free supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&amp;prime;-deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, beta subunit)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGF antibody</td><td>Prepared in-house</td><td></td><td>As described in: Acheson, A. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. &lt;strong&gt;7&lt;/strong&gt;, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Commercial option</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DRG culture medium&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal Medium&lt;br/&gt; 2% B27 Neurobasal Supplement&lt;br/&gt; 2 mM l-Glutamine&lt;br/&gt; 1% Penicillin-streptomysin&lt;br/&gt; 10 &amp;micro;M FDU&lt;br/&gt; 15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1x Laemmli sample buffer&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS&lt;br/&gt; 50 mM DTT&lt;br/&gt; 60 mM Tris (pH 6.8)&lt;br/&gt; 5% Glycerol&lt;br/&gt; 0.01% (w/v) Bromophenol blue</td></tr></tbody></table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Dorsalwurzelganglion Explantate von E13.5 Maus wachsen weitgehend auf Filter nacheinander beschichtet mit Poly-D-Lysin, Laminin und Kollagen (1B, links), von bis zu 2 mm innerhalb von 2 Tagen in Kultur. Dieses Substrat Kombination ergibt besonders üppige Wachstum; andere Kombinationen ergeben Axone, die wesentlich kürzer sind (Abbildung 1B, rechts). Darüber hinaus DRGs auf Filtern beibehalten erweitern mehr und mehr als Axone DRGs auf Kunststoff 1C gewachsen. <p ...

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Produktion und Isolierung der Axone von Sinneszellen für Biochemische Analyse mit Porous Filter

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

production-isolation-axons-from-sensory-neurons-for-biochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Aufrufe.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

Serie: Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we demonstrate and describe a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on the following steps: (1) dissection of nerve fascicles and separation of connective tissue; (2) incubation of short segments of nerve fascicles in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures; and (3) extraction of the remaining axon-enriched material. Proteomic and biochemical characterization of this preparation has confirmed a high degree of enrichment for axonal components.

We demonstrate a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on dissection of nerve fascicles and incubation in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures, followed by extraction of the remaining axon-enriched material.

Axoplasma Isolation von Rat Ischiasnerv

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

Forschung

Neurowissenschaften

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

Vorbereitung E18 Kortikale Rattenneuronen für Kompartimentierung in einer mikrofluidischen Vorrichtung

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

Biologie

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Vorbereitung der Synaptoneurosomen von Maus Cortex mit einem diskontinuierlichen Percoll-Saccharose-Dichtegradienten

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

Genetic Study of Axonregeneration mit kultivierten adulten Spinalganglienneuronen

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolation von sensorischen Neuronen von<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Für Patch-Clamp-Recordings von Glutamaterge Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

Eine Co-Kultur-Methode zur Untersuchung des Neuriten-Auswuchss als Reaktion auf Dental Pulp Paracrine Signale

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

Entwicklungsbiologie

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolation und Kultur der Dissoziierte sensorischen Neuronen aus Hühnerembryonen

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

Gestaltung von porösem Silizium Filme als Träger von Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

Biotechnik

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Isolation of Cells from Sensory Ganglia

Source: Kaelberer, M. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53917">A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the isolation of cells from the sensory ganglia of mice. Ganglia are subjected to enzymatic digestion to dissolve the extracellular matrix. Single cells are then collected via filtering through a cell strainer followed by density gradient centrifugation for debris removal. Finally, washing and centrifugation are done to collect the isolated cells for future analysis.

Isolierung von Zellen aus sensorischen Ganglien

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#8217;s IRB guidelines.
1. Sensory Ganglia Dissociation

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