Name: production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters
Uploaded: 2014-07-08T23:45:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters at JoVE.com

This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

참고 : 다음 절차는 동물 보호의 캐나다 협의회의 승인 지침에 따라 수 있습니다. 모든 노력이 과정에서 고통과 동물의 고통을 최소화 할 수 있습니다. 필터 1. 코팅 참고 : 문화 필터 삽입이 멀티 웰 플레이트의 우물에 배치하는 경우, 두 개의 구획이 정의되어있다 : 최고 구획은 삽입 위의 지역이며, 아래 칸은 삽입 그림 1A.ab 아래의 하나입니다. 이식편들은 필터의 상부 측에 부착 상부 구획에 시딩; 많은 축삭은 필터를 통해 성장하고 하부 격실도 1A.c 이내에, 필터의 하부 측에 연장되어있다. (즉, 코팅 용액, 액체, 배양액 등을인가하는) 표준 작업 볼륨은 하부 구획 2 ㎖ 및 상부 구획 대 1 ㎖이며 &quot;로 프로토콜로 지칭 될 예정; 표준 볼륨 &quot;. 삽입 및 웰의 측면 사이의 간극에 피펫 팁을 배치하여 하부 격실로 시작 솔루션을 추가. 필터의 하단에 갇히는 기포를 방지하는 용액을 분배하면서 또, 한쪽으로 기울 인서트. <ol><li> 필터 도금 전날 코팅 시작합니다. 무균 조직 문화 후드에서 6 잘받는 판에 24mm 필터 삽입을 배치합니다. 맨 아래 칸에 2 ㎖ 및 상단에 1 ㎖ : 표준 볼륨을 사용하여 실온에서 1 시간 동안 물에 폴리-D-라이신 (1 ㎎ / ㎖)로 삽입을 품어. </li><li> 기음 폴리-D-라이신과 물에 한 번 씻어. 대기음 물, 뚜껑을 닫고 후드 O / N.에 건조 플레이트를 남겨 액체를 흡입하는 동안, 직접 필터 아래에 갇혀되어 액체의 잔재를 제거해야합니다. </li><li> 다음 날 아침, 물에 라미닌 (10 ㎍ / ml)에 희석 혼합 따뜻한 37 ℃에서 CEL에 1 시간을 라미닌으로 삽입을 품어표준 볼륨을 사용하여 37 ° C에서 L 인큐베이터. </li><li> 기음 라미닌 물에 콜라겐 (0.1 ㎎ / ㎖)을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 이 경우 최고 구획을위한 바닥 구획을위한 2 ㎖ 및 2 ㎖를 사용합니다. </li><li> 기음 콜라겐과 멸균 물에 한 번 씻는다. STEP 3에서 설명한 바와 같이 필터 해주기 배양 배지 및 DRG 이식편을 수신 할 준비가되어있다. </li></ol> 2. 해부 배아 배근 신경절 (DRG)의 Explants <ol><li> 에버 틴 (250 ㎎ / ㎏)의 IP 주입하여 13 일간의 임신 여성 마우스를 마취. 10 ~ 15 분을 기다린 후 각막 및 페달 철수 반사의 부족을 확인합니다. 반사 신경이 결석하면, 자궁 전위를 수행합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 모든 수술기구와 여성의 복부를 소독. 악기를 건조하도록 허용합니다. 복부의 피부를 잡고 복강을 노출 피부와 근육 레이어를 잘라. </li><li> 자궁 경부와​​ 난소에서 분리하여 자궁을 제거합니다. steri에서르 후드, 가위로 자궁에서 배아를 제거하고 얼음처럼 차가운 L15 매체로 가득 페트리 접시에 그들을 수집합니다. 얼음에 보관하십시오. 참고 : 임신 17, 18 13 일 배아를 얻는 방법에 대한 자세한 내용은 이전의 기술 보고서를 참조하십시오. </li><li> 현미경, 옆에있는 배아를 놓고 머리를 제거하는 작은 봄 가위를 사용합니다. 측면을 따라 절개 가슴, 배, 사지와 꼬리를 취소 할 수 있습니다. 모든 내장 기관을 복부 측면을 놓고 제거, 척추가 들어있는 백을 유지합니다. </li><li> 작은 봄 가위, 정중선을 따라 복부 측면에서 척추를 절단하여 전체 척수를 노출합니다. 집게 일쌍 (# 3)와 함께 시체를 누른 상태에서 가장 주동이의 측면에 의해 척수를 개최하는 두 번째 쌍을 사용합니다. </li><li> 천천히 그리고 부드럽게 떨어져 척추 공동의 코드를 뽑아 초박형 집게 (# 5)를 이용하여 척수 개의 DRG를 꼬집어. 그룹 개의 DRG를 수집 할접시의 바닥. </li><li> 의 개방을 확대 절단 된 200 μL 피펫 팁과 흡입에 의해 그룹화 개의 DRG를 수집합니다. 튜브 개의 DRG를 놓고 DRG 수집이 완료 될 때까지 얼음에 둡니다. 참고 : 개의 DRG이 팁의 벽에 붙어 있지 않기 때문에 (표준 노란색 팁에 비해) 화이트 / 투명 팁이 바람직하다. 미디어 플러싱 팁을 사용하기 전에 더 이상의 벽에 달라 붙는 개의 DRG를 방지 할 수 있습니다. </li></ol> 필터 3. 시드와 배근 신경절 외식 유지 <ol><li> 표준 볼륨을 사용하여 코팅 인서트에 37 ° C에서 전체 DRG 미디어를 추가합니다. NGF가없는 최고 구획을 유지하면서, NGF의 15 겨 / ㎖로 바닥 구획 미디어를 보충합니다. 참고 : NGF 효율​​적으로 필터를 통해 확산과 농도가 시간 이내에 평형을하지만, 우리는 직접 파종하기 전에 아래 칸에 NGF를 적용하는 것은 상당히 B의 축삭의 수율을 증가시키는 것으로 관찰필터의 ottom면. </li><li> 의 개방을 확대 손질 끝으로 1000 μL 피펫을 사용하여 필터에 튜브에서 DRG를 대체 전송합니다. </li><li> 개의 DRG를 수집하기 전에 팁 2 - 3 배에 용지를 그립니다. 이 팁의 안쪽에 달라 붙는 것을 방해. 같은 팁은 모든 우물에 다시 사용할 수 있습니다. (표준 블루 팁 대) 무색 팁의 사용 팁 표면에 DRG의 고집을 줄일 수 있습니다. </li><li> DRG를 대체 전송 800 μL에 피펫을 설정합니다. 기음 필터의 상단의 용지 약 200 μL는 다음 DRG 함유 튜브로 이동 위아래로 작은 볼륨을 피펫 - 바닥에 침몰 한 개의 DRG를 재현 탁 할 수 있습니다. 전체 볼륨과 삽입의 중간에 끝을 잠수 피펫 개의 DRG를 대기음. </li><li> 일단 모든 삽입이로드, 플레이트 뚜껑을 닫고 판 10 배 소용돌이, 각각의 소용돌이 사이의 후드 벤치에 가볍게 두드리는. 이러한 움직임을 지원하여 축삭 수율을 증가 DRG 외식 싱크 및필터에 부착합니다. 이것은 또한 다른 이식편에서 축삭 겹치지 않도록 균등 이식편을 분배 돕는다. 참고 : 이전 단계에서 설명하는 이식편 파종 절차는 크게 기판 (최대 75 %)로 이식편 첨부의 전반적인 속도를 증가시킨다. 가장 중요한 것은, 피펫 절차는 쉽게 미디어 표면에 떠있는 대신 삽입의 바닥에 가라 앉는에서 외식을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 생화학 적 분석을 위해, 필터 당 (30 정도) 하나의 배아에서 시드 개의 DRG. 형태 학적 분석을 위해, 절반 또는 하나의 배아 (10 ~ 15)에서 개의 DRG의 제 중 하나를 사용합니다. 관의 모든 개의 DRG는 (은 30, 15, 또는 10 개의 DRG 여부) 하나의 우물에 씨앗을 품고되도록이 결정은, 튜브에 개의 DRG를 수집하기 전에 이루어져야합니다. </li><li> 2-3 일마다 미디어를 변경, 37 ° C에서 세포 배양기에서 문화를 유지한다. 미디어를 변경 먼저 최고 구획을 대기음하려면 아래 구획 하였다. 표준 볼륨에 추가 신선한 미디어맨 아래 칸부터 시작이야. 참고 : 건조 세포 / 축삭을 방지하기 위해, 동시에 3 개 이상 삽입 미디어를 변경하지 않습니다. NGF의 존재에 필터에 성장 개의 DRG 문화 2 일 후에 2mm까지 도달하는 긴 축삭을 확장 할 것입니다. </li></ol> 4. 영양 인자 탈퇴 처리 NGF 철수는 먼저 철수 후 약 12​​ 시간을 표시 (IF 상 대비 및 β-III-tubulin에 의해 결정) 축삭 조각화 축삭 변성을 유도한다. 전체 조각은 36 시간에 의해 달성된다. 변성는 실험 디자인에 따라 최종 사용자에 의해 선택되어야 동안 진행하도록 방치 얼마나. <ol><li> 2 일 축삭 확장 단계 후, NGF가 부족하고, 나머지 (또는 내생 적 생산) NGF를 격리시키는 안티-NGF 항체 (1 ㎍ / ㎖)에 포함 된이 미디어에 상단과 하단 구획에서 미디어를 변경합니다. </li><li> 수 있도록 세포 배양기 (37 ° C)에 번호판을 반환원하는 시간 동안 진행 NGF 탈퇴 유도 변성. </li><li> 서양 얼룩 검진 단백질 추출 (6 단계)로 이동하거나 직접 IF (7 단계)에 의해 필터를 검사합니다. </li></ol> 5. 축삭 절개는 Wallerian 변성을 유도하는 이 절차는 전지 본체로부터 분리 필터의 하부 측에 축삭을 남겨 두지 만, 그렇지 않으면 그대로. 그 후,이 축삭이 빠르게 Wallerian 변성을 시작합니다. 첫 번째 절개 후 3 시간으로 나타납니다 (IF 상 대비 또는 β-III-tubulin에 의해 입증) 축삭 분열; 9 시간으로, 축삭이 완전히 분할되어 필터에서 분리됩니다. 변성는 실험 디자인에 따라 최종 사용자에 의해 선택되어야 동안 진행하도록 방치 얼마나. <ol><li> 셀 스크레이퍼로 재배 DRG 이식편을 함유하는 필터의 상부 측 긁어. X-, Y-원형에 스크레이퍼를 이동하여 최고 물자의 완전한 제거를 확인방향. </li><li> 필터에서 긁어 NGF (10 NG / ML)를 포함 예열 완료 DRG 미디어 1 ㎖로 교체 된 부동 외식을 포함하는 상위 함에서 용지를 버리십시오. </li><li> Wallerian 변성는 최종 사용자가 선택한 시간 동안 진행 할 수 있도록 인큐베이터 (37 ° C)를 셀에 플레이트를 반환합니다. </li><li> 서양 얼룩 검진 단백질 추출 (6 단계)로 이동하거나 직접 IF (7 단계)에 의해 필터를 검사합니다. </li></ol> 축삭 샘플 6. 단백질 추출 <ol><li> 램리 샘플 버퍼 75 μL로 수집 튜브 (1.5 ㎖)를 입력합니다. 필터의 전체 집합에서 축삭을 수확하는 동안 얼음에 튜브를 유지합니다. </li><li> PBS에서 DRG 외식으로 필터를 세척하고 필터의 상단을 다 쳤어요. 플레이트에서 삽입물을 분리면 팁 어플리케이터 필터의 상단을 청소하고 상단과 하단 측면에서 여분의 PBS를 대기음. </li><li> 삽입 거꾸로 배치벤치에 예리한 메스를 사용하여 삽입 밖으로 필터를 잘라. 집게, 바닥을 위로 필터를 누릅니다. 가위로 필터의 중심 주위에서 상처를 확인합니다. </li><li> 포집 관의 상단에 장소 필터 및 집게와, 다운 튜브 필터의 가운데를 누르십시오. 이 일을하는 동안, 깔때기 형성한다. 이 램리 샘플 버퍼에 빠져들도록 튜브의 바닥에 깔때기 모양의 필터를 밀어 넣습니다. </li><li> 4 분 동안 튜브를 자비 완전한 단백질을 추출합니다. 튜브의 상단에 거꾸로 배치하는 집게를 사용하여 간단한 스핀 (15 초 동안 2,000 XG)를 수행하는 필터를 제거합니다. 건조 된 필터를 폐기하십시오. </li><li> 관심의 단백질을 감지하는 서양 얼룩 뒤에 SDS-PAGE에있는 축삭 단백질 제제의 10 μl를 해결합니다. 참고 : 참고로, 2 일 동안 성장과 RIPA 100 μL에 용해 (20) 외식에서 축삭 준비 버퍼가 4-6의 단백질 농도를해야합니다 용해㎍ / μL. </li></ol> 필터에 축삭의 7. 면역 형광 시험 다음 단계는 β-III-튜 불린의 검출에 의해 예시 필터 삽입에 염색 경우 수행 할 수있는 일반적인 조작을 설명합니다. 정착액, 배양 시간, 농도와 다른 내용이 다른 항원 - 항체 쌍에 최적화되어야한다. <ol><li> 삽입의 다음 세척 및 배양을 위해 철저하게 청소 이전에 사용 된 6 - 웰 플레이트를 활용. </li><li> 간단히 PBS에 삽입을 씻는다. 셰이커에 실온에서 10 분 동안 PBS에서 갓 준비 4 % 파라 포름 알데히드에 수정합니다. </li><li> 고정 후, 긁어 필터의 저면에 독점적 성장 축삭을 수집 인서트의 위쪽면을 청소한다. IF 표준 배양을 진행합니다. </li><li> 부드럽게 진탕하면서 실온에서 1 시간 동안의 표준 볼륨을 사용하여, (TBS, 0.05 % 트윈 20, 5 % 탈지 우유) 용액을 블로킹 인서트를 배양한다. </li><li> 전송 표준 볼륨을 사용, 버퍼 (안티 - β-III-튜 불린, 1:5,000)를 차단에 희석 차 항체에 삽입합니다. 부드러운 흔들림으로 4 ° C에서 O / N (~ 18 시간)을 품어. </li><li> PBS (RT에서 2 X 10 분)에 두 번 첫 번째 항체를 씻으십시오. </li><li> 전송 표준 볼륨을 사용, (1:2,000을 염소 항 - 마우스) 버퍼를 차단에 희석 형광 - 복합 이차 항체에 삽입합니다. 부드러운 흔들림과 실온에서 2 시간 동안 빛에서 적용을 품어. </li><li> PBS (RT에서 3 × 10 분)의 차 항체의 3 배를 씻으십시오. </li><li> IF가 완료되면, 삽입물 가지고 마지막 세척에서 PBS를 멀리 부어면 - 팁 어플리케이터 필터의 상단을 청소합니다. 위쪽과 아래쪽에서 액체를 대기음. </li><li> 장소는 벤치에 거꾸로 삽입하고 날카로운 메스 삽입 밖으로 필터를 잘라. </li><li> , 집게와 필터를 잡고 위로 하방 및 현미경 슬라이드에 배치합니다. coverslip에 형광 호환 양해 각서 (MOU)와 오버레이nting 미디어. 빛에 덮여 차가운 방에서 건조 평면을 보자. 검사와 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다. 참고 : 4 ° C에 저장하고 빛으로부터 보호 할 때, 이러한 준비는 형광의 손실을 최소화 주 동안 유지 될 수있다. </li><li> 옵션 : 또한, IF는 삽입에서 제거 된 필터를 수행 할 수 있습니다. 이를 위해 긁어 직접 고정 후 필터의 상단면을 청소합니다. <ol><li> 여섯 잘 플레이트의 바닥에 날카로운 메스와 장소 필터 축삭 업에 삽입의 필터링을 가져 가라. </li><li> 7.4-7.8 7.11에 표시된대로 그 후, I​​F에 대한 배양을 수행합니다. 이 대안의 장점은 예를 들어, 배양 볼륨 (7.1-7.11 같이 필터를 직접 삽입에 염색 할 때 사용되는 3 ㎖에 비해) 500 μL까지 갈 수 있기 때문에이 시약을 절약 할 수 있다는 것입니다. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 기술을 채택 할 때 고려해야 할 중요한 매개 변수는 공부한다 신경 세포의 인구, 기판, 필터의 기공 크기 및 표면 영역을 포함한다. 이러한 모든 파라미터가 얻어 신경 돌기 제제의 특이성, 질 및 양에 영향을 미칠 것이며, 최종 사용자에 의해 신중하게 고려되어야한다. 이 프로토콜에 제시된 예에서, DRG 신경 세포의 사용, 따라서 순수 (특정) 축삭 제제를주는 유일한 축삭 연장되는 이점이있다. ...

신경 세포의 축삭 구획 somato-돌기 실에서 기능적 독립의 큰 정도를 보여줍니다. 투사 뉴런의 축삭은 신경 세포의 단백질 1,2의 대부분을 포함하고 있습니다. 최근의 연구는 초기 축삭 장애는 신경 퇴행성 질환 및 신경 정신 장애 3의 공통적 인 특징이 나타납니다 것으로 나타났습니다 때문에 축삭의 생리와 병리 생리학의 연구 결과는 신경 과학 사회에서 힘을 얻고있다. 그것은 정상 및 병적 인 조건에서 축삭 독점 메커니즘에 대한 이해가 장애를 구동 초기 이벤트에 빛을 발산 할 것으로 보인다. 이 의정서는 생화학에 적합하며 면역 세포 화학 분석 순수 축삭 물질의 많은 양을 얻기 위해 다공성 막 (필터) 베어링 문화 삽입물을 사용하는 방법에 대해 설명합니다. 필터의 사용은 축삭 생물학 처음 스튜 워드에 의해 구현 된 공부를 삽입하고또한 현재의 구성에 Twiss의 동료 (5)에 의해 개발 된 동료 4. 기술은 연구 뉴런의 인구를 수용하는 각각의 경우에 약간의 수정과 함께, 축삭과 수상 돌기 생물학의 다양한 측면을 연구 그룹에 의해 현재 사용중인 지금, 수행먼트와 생화학 적 분석의 유형 6-9을 사용했다. 본 프로토콜은 응용 프로그램 같은 다양한 모든 대안을 수용 할 생각입니다 만, 오히려 대부분의 응용 프로그램에 적합한 간단한 방법을 제공하지 않습니다. 특히, 여기에서 설명하는 프로토콜은 철회 및 영양 요인 9 박탈 때 더 빨리 퇴화 적은 축삭을 생산 생화학 적 분석에 대한 축삭의 수율을 극대화하고, 문헌에 기술 된 축삭 변성 - 다른 코팅을 공부하기에 최적 인 트리플 코팅을 사용합니다. 이 과정에서 신경 세포 기관은 필터 WH 꼭대기에 고립 된 상태로 유지일의 축색 돌기가 모공을 통과 및 바닥면을 따라 성장한다. 필터의 저면에 성장 (아교 및 신경 세포체 오염물) 순수한 축삭 생화학 분석을 위해 수집하거나 반응계에서 고정 및 면역 세포 화학 기법 (9)에 의해 조사 될 수있다. 절차는 후근 신경절 (DRG)에서 배아 감각 뉴런의 사용에 의존한다. 이 요인을 박탈 때 빠르게 퇴보를 받아야하기 때문에 배아 개의 DRG 널리 신경 성장 인자 (NGF)에 유지하면 이들 세포에서 신경 돌기는 체외에서 빠르고 강력한 성장을 받아야하기 때문에 축삭 생물학을 연구하는 데 사용하고있다. 이 방법에 의해 수집 된 모든 신경 돌기가 순수 축삭 수 있도록 또한, DRG의 신경 세포는 수상 돌기 부족합니다. 필터 삽입은 축삭을 연구하는 데 다른 방법에 비해 큰 이점을 나타냅니다. 프로세스 에서와는 셀 ​​소마에서 발생 차별화 현미경의 사용에 의존 연구xons 제한 생화학 적 정보를 제공합니다. 다른 예로서, 구획화 배양 시스템 (예 Campenot 챔버 (10) 또는 미세 유동 장치 (11))은 촬상 방법 및 세포 구획 차동 치료에 유용하지만 필요 생화학 적 분석에 대한 이러한 기술의 사용을 배제, 축삭 물질의 소량 만 제공 샘플의 비교적 다량. 또한, 자신의 사용은 중요한 교육뿐만 아니라 전문 장비를 필요로하고, 그들은 시간이 소요됩니다. 종종 이식편에서 축삭을 분리하는 데 사용하는 또 다른 방법은 수동 축삭 시료 채취 전에 (신경 세포의 세포체 함유) 이식편 센터를 제거하는 것이다. 이 축삭 농축 제제의 대량 생산 할 수 있지만,이 준비 축삭이 아교에 싸여 빠르게 (최소 실험의 예를 들어) 6 우물에서 연속 20 이식편의 몸을 제거 할 수있는 시간이 오래 걸릴하고 가능성의 한계에. 대조적으로, 여기에 제시된 방법은 서양 얼룩, 면역 6, 북부 오점 5 질량 분석 6, RNA 정화와 같은 일반적으로 전체 세포 용 해물을 분석하는 데 사용되는 거의 모든 생화학 적 기법에 의해 분석 될 수있다 풍부하고 순수 축삭 준비를 생산 7,12,13, 다른 사람의 사이에서. 또한, 프로토콜은 상기 IF에서이를 검사하는 필터의 바닥 측에서 성장하는 축삭을 고정 할 수있는 한, (IF)를 면역 형광 기법에 적용될 수있다. 제공된 세포체는 최종 준비가 없기 때문에이 접근법은 크게 축삭 특정 프로세스의 분석을 용이하게한다. 세포 기관에서 높은 면역 신호가 자주 검사와 같은 축삭 얇은 구조에서 발생하는 약한 신호의 분석을 저해하기 때문에 이것은 큰 장점이다. 축삭 변성 AR을 연구하는 배양 방법의 두 가지 응용 프로그램전자 기술; 발달 전정 부상 유도 퇴화 모델의 모델 (통상 Wallerian 변성 함). 발달 전정의 모델링은 생체 내 감각 뉴런 타겟 유래 NGF의 양 및 충분한 신경성지지 축퇴 (14)를 수신하지 못하고 그 제한에 대해 경쟁한다는 사실에 근거한다. 이 현상은 생체 내에서 일어나는로서, 균체 파괴 다음에 축삭 변성을 시작, 배양 배지에서 NGF를 철수하여 배아 DRG의 문화에서 모방 할 수 있습니다. Wallerian 변성을 모델링하기 위해, 균체와 함께 필터의 상부 측이 긁어된다. 물리적으로 균체로부터 분리 한 후, 제 1850 16 현상을보고 A. 월러 따서 Wallerian 변성 (15)로서 알려진 신속하고 진부한 퇴행성 과정을 거칠되어 필터의 바닥 측 상에 성장한 축삭.

<table><tbody><tr><td>CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td><td>Charles River</td><td></td><td>In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td></tr><tr><td>Falcon cell culture inserts</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>1 &amp;micro;m pore size, fits 6-well receiving plate</td></tr><tr><td>Falcon cell culture companion plates</td><td>Corning</td><td>353502</td><td>Receiving plates for inserts</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>Used at 10 &amp;micro;g/ml in water. Take 100x stock from -80 &amp;deg;C and thaw O/N at 4 &amp;deg;C&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PureCol bovine collagen solution</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&#039;s L-15 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td>Can be replaced by DMEM</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 serum-free supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&amp;prime;-deoxyuridine (FDU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>NGF (2.5S, beta subunit)</td><td>Cedarlane</td><td>CLMCNET-001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NGF antibody</td><td>Prepared in-house</td><td></td><td>As described in: Acheson, A. &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron. &lt;strong&gt;7&lt;/strong&gt;, 265-75, (1991).</td></tr><tr><td>Alomone Labs</td><td>AN-240</td><td>Commercial option</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB5564</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11029</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;DRG culture medium&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Neurobasal Medium&lt;br/&gt; 2% B27 Neurobasal Supplement&lt;br/&gt; 2 mM l-Glutamine&lt;br/&gt; 1% Penicillin-streptomysin&lt;br/&gt; 10 &amp;micro;M FDU&lt;br/&gt; 15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;1x Laemmli sample buffer&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">2% SDS&lt;br/&gt; 50 mM DTT&lt;br/&gt; 60 mM Tris (pH 6.8)&lt;br/&gt; 5% Glycerol&lt;br/&gt; 0.01% (w/v) Bromophenol blue</td></tr></tbody></table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

E13.5 마우스에서 후근 신경절 외식 문화 2 일 이내에 2mm에 도달, 필터에 광범위하게 폴리-D-라이신, 라미닌 및 콜라겐 (그림 1B, 왼쪽)와 코팅을 순차적으로 성장한다. 이 기판의 조합이 특히 풍부한 성장을 수득; 다른 조합은 상당히 짧은 축삭 수익률 (그림 1B를, 오른쪽). 또한, 필터를 유지 개의 DRG 플라스틱 그림 1C에 성장 개의 DRG보다 더 긴 축삭을 확장합니다....

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

생화학 적 분석에 대한 감각 뉴런에서 생산 및 축삭의 분리는 다공성 필터를 사용하여

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

production-isolation-axons-from-sensory-neurons-for-biochemical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K 조회수.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

비디오: Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we demonstrate and describe a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on the following steps: (1) dissection of nerve fascicles and separation of connective tissue; (2) incubation of short segments of nerve fascicles in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures; and (3) extraction of the remaining axon-enriched material. Proteomic and biochemical characterization of this preparation has confirmed a high degree of enrichment for axonal components.

We demonstrate a protocol for axoplasm isolation from adult rat sciatic nerve based on dissection of nerve fascicles and incubation in hypotonic medium to release myelin and lyse non-axonal structures, followed by extraction of the remaining axon-enriched material.

쥐 좌골 신경에서 Axoplasm 격리

Isolation of pure axonal cytoplasm (axoplasm) from peripheral nerve is crucial for biochemical studies of many biological processes. In this article, we ...

연구

신경과학

Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

불연속 Percoll - 자당 밀도 구배를 사용하여 마우스를 접속에서 Synaptoneurosomes의 준비

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

의 감각 뉴런의 분리<em&gt; 군소 californica</em&gt; 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ganglia that line the spinal column. Understanding the receptors and channels expressed by these sensory afferent neurons could lead to novel therapies for disease. The initial step is to identify the specific subset of sensory neurons of interest. Here we describe a method to identify afferent neurons innervating the muscles by retrograde labeling using a fluorescent dye DiI (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate). Understanding the contribution of ion channels to excitation of muscle afferents could help to better control excessive excitability induced by certain disease states such as peripheral vascular disease or heart failure. We used two approaches to identify the voltage dependent ion channels expressed by these neurons, patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry. While electrophysiology plus pharmacological blockers can identify functional ion channel types, we used immunocytochemistry to identify channels for which specific blockers were unavailable and to better understand the ion channel distribution pattern in the cell population. These techniques can be applied to other areas of the nervous system to study specific neuronal groups.

Afferent sensory neurons signal sensory information from the periphery to the central nervous system. Identifying specific afferent neurons will help in understanding their physiology. We describe a method of retrograde labeling to identify afferent neurons, and study the voltage-gated ion channels in these neurons using patch clamp electrophysiology and immunocytochemistry.

표현 이온 채널 연구에 대한 특정 감각 신경 세포 인구의 식별

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

발생학

Designing Porous Silicon Films as Carriers of Nerve Growth Factor

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the protein does not cross the blood-brain barrier, owing to its chemical properties, and thus requires long-term delivery to the brain to have a biological effect. This work describes fabrication of nanostructured PSi films as degradable carriers of NGF for sustained delivery of this sensitive protein. The PSi carriers are specifically tailored to obtain high loading efficacy and continuous release of NGF for a period of four weeks, while preserving its biological activity. The behavior of the NGF-PSi carriers as a NGF delivery system is investigated in vitro by examining their capability to induce neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and dissociated DRG neurons. Cell viability in the presence of neat and NGF-loaded PSi carriers is evaluated. The bioactivity of NGF released from the PSi carriers is compared to the conventional treatment of repetitive free NGF administrations. PC12 cell differentiation is analyzed and characterized by the measurement of three different morphological parameters of differentiated cells; (i) the number of neurites extracting from the soma (ii) the total neurites' length and (iii) the number of branching points. PC12 cells treated with the NGF-PSi carriers demonstrate a profound differentiation throughout the release period. Furthermore, DRG neuronal cells cultured with the NGF-PSi carriers show an extensive neurite initiation, similar to neurons treated with repetitive free NGF administrations. The studied tunable carriers demonstrate the long-term implants for NGF release with a therapeutic potential for neurodegenerative diseases.

Here, we present a protocol to design and fabricate nanostructured porous silicon (PSi) films as degradable carriers for the nerve growth factor (NGF). Neuronal differentiation and outgrowth of PC12 cells and mice dorsal root ganglion (DRG) neurons are characterized upon treatment with the NGF-loaded PSi carriers.

신경 성장 인자의 사업자로 서 다공성 실리콘 필름을 디자인

Despite the great potential of NGF for treating neurodegenerative diseases, its therapeutic administration represents a significant challenge as the ...

생체공학

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

체외에서 감각 및 모터 신경에서 섬유 아세포와 슈완 세포의 정화

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...

Microfluidics-Assisted Selective Depolarization of Axonal Mitochondria

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many neurodegenerative diseases. Given some axons' elaborate architecture and extreme length, it is not surprising that mitochondria in axons can experience different environments compared to their cell body counterparts. Interestingly, dysfunction of axonal mitochondria often precedes effects on the cell body. To model axonal mitochondrial dysfunction in vitro, microfluidic devices allow treatment of axonal mitochondria without affecting the somal mitochondria. The fluidic pressure gradient in these chambers prevents diffusion of molecules against the gradient, thus allowing for analysis of mitochondrial properties in response to local pharmacological challenges within axons. The current protocol describes the seeding of dissociated hippocampal neurons in microfluidic devices, staining with a membrane-potential sensitive dye, treatment with a mitochondrial toxin, and the subsequent microscopic analysis. This versatile method to study axonal biology can be applied to many pharmacological perturbations and imaging readouts, and is suitable for several neuronal subtypes.

The present protocol describes the seeding and staining of neuronal mitochondria in microfluidic chambers. The fluidic pressure gradient in these chambers allows for the selective treatment of mitochondria in axons to analyze their properties in response to pharmacological challenges without affecting the cell body compartment.

축삭 미토콘드리아의 미세 유체 보조 선택적 탈분극

Mitochondria are the primary suppliers of ATP (adenosine triphosphate) in neurons. Mitochondrial dysfunction is a common phenotype in many ...

Isolation of Cells from Sensory Ganglia

Source: Kaelberer, M. M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/53917">A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the isolation of cells from the sensory ganglia of mice. Ganglia are subjected to enzymatic digestion to dissolve the extracellular matrix. Single cells are then collected via filtering through a cell strainer followed by density gradient centrifugation for debris removal. Finally, washing and centrifugation are done to collect the isolated cells for future analysis.

감각신경절(Sensory Ganglia)로부터 세포의 격리(Isolation of Cells from Sensory Ganglia)

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#8217;s IRB guidelines.
1. Sensory Ganglia Dissociation

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