This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.

NOTA: Le seguenti procedure sono conformi alle linee guida approvate dal Consiglio canadese dei Animal Care. Tutti gli sforzi sono fatti per minimizzare il dolore e la sofferenza degli animali durante le procedure. 1. Rivestimento di filtri NOTA: Quando inserti del filtro cultura sono poste in pozzetti di piastre multi-pozzetto, due comparti sono definite: vano superiore è la regione sopra l&#39;inserto ed il vano inferiore è quello sotto l&#39;inserto Figura 1A.ab. Espianti vengono seminate nel vano superiore dove essi attribuiscono al lato superiore del filtro; molti assoni crescono attraverso il filtro e si estendono sul lato inferiore del filtro, all&#39;interno del compartimento inferiore Figura 1A.c. I volumi di lavoro standard (ad esempio per l&#39;applicazione di soluzione di rivestimento, lavaggi, terreni di coltura, ecc) sono 2 ml per il comparto inferiore e 1 ml per il comparto superiore e stanno ad essere indicato nel protocollo come &quot;; Volumi standard &quot;. Aggiungere soluzioni a partire con il vano inferiore posizionando la punta della pipetta nel divario tra l&#39;inserto e il lato del bene. Inoltre, l&#39;inserto, inclinarlo su un lato, mentre l&#39;erogazione della soluzione per evitare bolle restino intrappolate sul fondo del filtro. <ol><li> Avviare rivestire i filtri il giorno prima placcatura. Sotto il cofano coltura tissutale sterili, collocare 24 cartucce filtranti mm in una piastra da 6 pozzetti ricezione. Incubare inserti con poli-D-lisina in acqua (1 mg / ml) per 1 ora a temperatura ambiente, usando volumi standard: 2 ml nel comparto inferiore e 1 ml in cima. </li><li> Aspirare poli-D-lisina e lavare una volta con acqua. Aspirare acqua, chiudere il coperchio e lasciare le piastre ad asciugare al cofano O / N. Durante l&#39;aspirazione di liquidi, assicurarsi di rimuovere un residuo di liquido che diventa intrappolato direttamente sotto il filtro. </li><li> La mattina successiva, diluire laminina in acqua (10 mg / ml), mescolare e calda a 37 ° C. Incubare inserti con laminina 1 ora in cell incubatore a 37 ° C, utilizzando volumi standard. </li><li> Aspirare laminina e collagene aggiungere in acqua (0,1 mg / ml) e incubare per 1 ora a RT. In questo caso utilizzare 2 ml per il comparto inferiore e 2 ml per vano superiore. </li><li> Aspirare collagene e lavare una volta con acqua sterile. I filtri sono ora pronti a ricevere terreni di coltura e espianti DRG, come descritto nel passaggio 3. </li></ol> 2. Dissezione embrionali radice dorsale Ganglion (DRG) espianti <ol><li> Anestetizzare un 13-giorno incinta topo femmina da una iniezione IP di Avertin (250 mg / kg). Attendere 10-15 minuti e verificare per mancanza di riflessi di prelievo della cornea e pedali. Una volta che i riflessi sono assenti, eseguire dislocazione cervicale. </li><li> Disinfettare tutti gli strumenti chirurgici e addome femminile con il 70% di etanolo. Lasciare strumenti per asciugare. Tenere la pelle dell&#39;addome e tagliare gli strati cutanei e muscolari per esporre la cavità addominale. </li><li> Rimuovere l&#39;utero staccando dal collo dell&#39;utero e delle ovaie. In un steriLe cappuccio, rimuovere gli embrioni dall&#39;utero con le forbici e raccoglierli in una capsula di Petri pieno di ghiaccio freddo L15 media. Tenere su ghiaccio. NOTA: Fare riferimento a relazioni tecniche precedenti per ulteriori dettagli su come ottenere embrioni di 13 giorni di gestazione 17,18. </li><li> Sotto il microscopio, porre l&#39;embrione da un lato e l&#39;uso di piccole forbici a molla per rimuovere la testa. Fare un&#39;incisione lungo i fianchi laterali per eliminare il petto, ventre, gli arti e la coda. Tenere la schiena che contiene la colonna vertebrale, laici lato ventrale e rimuovere tutti gli organi viscerali. </li><li> Con piccole forbici a molla, esporre l&#39;intero midollo spinale tagliando la colonna vertebrale dal suo lato ventrale lungo la linea mediana. Tenere la carcassa giù con un paio di pinze (# 3) e utilizzando una seconda coppia di tenere il midollo spinale dal suo aspetto più rostrale. </li><li> Lentamente e delicatamente tirare il cavo lontano dalla cavità vertebrale e un pizzico fuori DRG dal midollo spinale con pinze ultra-sottile (# 5). Gruppo DRG devono essere raccolte suil fondo del piatto. </li><li> Raccogliere DRG raggruppati aspirando con 200 microlitri pipetta punta che è stato tagliato per allargare la sua apertura. Mettere i DRG in un tubo e lasciare sul ghiaccio fino alla raccolta DRG è finito. NOTA: consigli Bianco / trasparente sono preferiti perché DRG non si attaccano alle pareti di questa punta (rispetto alle punte gialle standard). Ha Flushing con i media prima dell&#39;uso ulteriore impedisce DRG di attaccarsi alle sue mura. </li></ol> 3. Semina e manutenzione di radice dorsale Ganglio espianti su Filtri <ol><li> Aggiungere supporti DRG completa a 37 ° C per gli inserti rivestiti con volumi standard. Integrare il supporto comparto inferiore a 15 ng / ml di NGF, pur mantenendo il vano superiore NGF-free. NOTA: Anche se NGF diffonde in modo efficiente attraverso il filtro e la sua concentrazione in equilibrio entro poche ore, abbiamo osservato che l&#39;applicazione di NGF per il vano inferiore direttamente prima della semina aumenta significativamente il rendimento assonale sul bottom superficie del filtro. </li><li> Trasferire i DRG dal tubo ai filtri utilizzando una pipetta di 1.000 pl con una punta tagliata per ingrandire sua apertura. </li><li> Disegnare supporto nella punta 2-3x prima di raccogliere i DRG. Questo impedisce loro di attaccarsi al lato interno della punta. La stessa punta può essere riutilizzato per tutti i pozzetti. L&#39;uso di punte incolore (contro punte blu standard) riduce DRG si attacchi alla superficie punta. </li><li> Per trasferire DRG, impostare la pipetta a 800 ml. Aspirare circa 200 ml di media dal lato superiore del filtro, quindi andare al tubo-DRG e pipetta contenente un piccolo volume su e giù - per risospendere DRG che hanno toccato il fondo. Aspirare l&#39;intero volume e DRG pipette sommergere la punta al centro dell&#39;inserto. </li><li> Una volta che tutti gli inserti sono stati caricati, chiudere il coperchio piatto e agitare la piastra 10x, picchiettando delicatamente sul banco cofano tra ogni ricciolo. Questi movimenti aumentano la resa assonale aiutando espianti DRG lavello eallegare al filtro. Questo aiuta anche a distribuire uniformemente espianti modo che assoni di diversi espianti non si sovrappongano. NOTA: La procedura semina espianto descritto nei passaggi precedenti aumenta significativamente il tasso globale di attaccamento espianto al substrato (fino al 75%). Più significativamente, la procedura di pipettaggio impedisce prontamente espianti dal galleggiante sulla superficie del supporto invece di affondare al fondo dell&#39;inserto. </li><li> Per le analisi biochimiche, DRG seme da un embrione (circa 30) per filtro. Per le analisi morfologiche, utilizzare la metà o un terzo dei DRG da un embrione (10-15). Tale decisione deve essere presa prima di raccogliere i DRG in tubi, in modo che tutti i DRG di un tubo vengono seminate in un singolo bene (se si tratta di 30, 15, o 10 DRG). </li><li> Mantenere culture in un incubatore cella a 37 ° C, a cambiare i media ogni 2-3 giorni. Per cambiare supporto, aspirare il vano superiore per primo, seguito dal comparto inferiore. Aggiungi mezzi freschi in volume standards partendo con il vano inferiore. NOTA: per evitare cellule / assoni di asciugatura, non cambiare supporto in più di 3 inserti allo stesso tempo. DRG coltivate su filtri in presenza di NGF estenderà assoni lunghi, raggiungendo fino a 2 mm dopo 2 giorni di coltura. </li></ol> 4. Trofico Factor sospensione del trattamento NGF ritiro induce degenerazione assonale con la frammentazione assonale (determinata dal contrasto di fase e β-III-tubulina IF) che appare prima di circa 12 ore dopo la sospensione. Frammentazione completo si ottiene con 36 hr. Per quanto tempo la degenerazione viene lasciata procedere per deve essere scelta dall&#39;utente finale secondo il disegno sperimentale. <ol><li> Dopo la assonale fase di estensione di 2 giorni, cambiano i media dai compartimenti superiori e inferiori a media che manca di NGF e contiene anticorpi anti-NGF (1 mg / ml) di sequestrare qualsiasi residuo (o produzione endogena) NGF. </li><li> Piastre Return to incubatore cellulare (37 ° C) per consentireNGF degenerazione ritiro indotto a procedere per il tempo desiderato. </li><li> Procedere alla estrazione delle proteine ​​(fase 6) per esame da western blot o esaminare direttamente i filtri da IF (punto 7). </li></ol> 5. Assonale transezione per indurre degenerazione Walleriana Questa procedura lascia gli assoni sul lato inferiore del filtro staccati dalla loro corpo cellulare, ma altrimenti intatto. Successivamente, questi assoni rapidamente avviare walleriana degenerazione. Frammentazione assonale (evidenziato dal contrasto di fase o β-III-tubulina IF) appare per la prima da 3 ore dopo resezione; da 9 ore, gli assoni sono completamente frammentati e si staccano dal filtro. Per quanto tempo la degenerazione viene lasciata procedere per deve essere scelta dall&#39;utente finale secondo il disegno sperimentale. <ol><li> Raschiare il lato superiore del filtro, contenente espianti DRG coltivate, con una cella-raschietto. Assicurare la completa rimozione di materiale superiore spostando raschietto in X, Y e circolareindicazioni. </li><li> Eliminare il supporto dal vano superiore contenente gli espianti galleggianti che sono stati raschiati dal filtro e sostituire con 1 ml di pre-riscaldato, i media DRG completo contenente NGF (10 ng / ml). </li><li> Piastra di ritorno alla cella incubatore (37 ° C) per consentire Wallerian degenerazione procedere per la quantità di tempo scelto dall&#39;utente finale. </li><li> Procedere alla estrazione delle proteine ​​(fase 6) per esame da western blot o esaminare direttamente i filtri da IF (punto 7). </li></ol> 6. Proteine ​​Estrazione di assonale Campioni <ol><li> Riempire tubi di raccolta (1,5 ml) con 75 ml di tampone campione Laemmli. Conservare le provette su ghiaccio mentre la raccolta assoni dall&#39;intera serie di filtri. </li><li> Lavare il filtro con espianti DRG in PBS e raschiare il lato superiore del filtro. Rimuovere l&#39;inserto dalla piastra, pulire la superficie superiore del filtro con un applicatore con punta di cotone e aspirare qualsiasi PBS supplementare dai lati superiore e inferiore. </li><li> Posizionare inserto upsidegiù sulla panca e tagliare il filtro dell&#39;inserto con un bisturi affilato. Tenere il filtro con una pinza, bottom-up. Effettuare un taglio dalla circonferenza al centro del filtro con le forbici. </li><li> Inserire filtro sulla parte superiore del tubo di raccolta, e con una pinza, premere il centro del filtro nel tubo. Nel fare questo, un imbuto dovrebbe formare. Spingere il filtro a imbuto al fondo del tubo in modo che sia immerso nel tampone Laemmli. </li><li> Estrazione di proteine ​​complete facendo bollire le provette per 4 min. Rimuovere il filtro con pinze per posizionarlo capovolto nella parte superiore del tubo e l&#39;esecuzione di una breve rotazione (2.000 xg per 15 sec). Eliminare i filtri secchi. </li><li> Risolvere 10 ml di preparazione proteina assonale in un SDS-PAGE seguita da western blot per rilevare le proteine ​​di interesse. NOTA: Come riferimento, una preparazione assonale da 20 espianti coltivati ​​per 2 giorni e lisati in 100 ml di RIPA Lysis Buffer avrà una concentrazione proteica di 4-6mg / mL. </li></ol> 7. Immunofluorescenza Esame degli assoni su Filtri Le seguenti operazioni delineano le manipolazioni generali da eseguire se la colorazione su inserti filtranti, esemplificate dal rilevamento di β-III-tubulina. Fixative, tempi di incubazione, le concentrazioni e le altre indicazioni devono essere ottimizzati per altre coppie antigene-anticorpo. <ol><li> Utilizzare 6 pozzetti utilizzati in precedenza, accuratamente puliti, per i seguenti lavaggi e incubazione degli inserti. </li><li> Brevemente lavare inserti in PBS. Fissarli in appena preparato 4% paraformaldeide in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente su agitatore. </li><li> Dopo fissazione, raschiare e pulire la superficie superiore dell&#39;inserto per raccogliere gli assoni che crescevano esclusivamente sulla superficie inferiore del filtro. Procedere con incubazione standard per IF. </li><li> Incubare inserti in soluzione di blocco (TBS, 0,05% Tween 20, latte scremato 5%), con volumi standard, per 1 ora a RT agitando delicatamente. </li><li> Trasferimento inserti di anticorpo primario diluito in tampone di bloccaggio (anti-β-III-tubulina, 1/5.000), utilizzando volumi standard. Incubare O / N (~ 18 hr) a 4 ° C con un leggero scuotimento. </li><li> Lavare il primo anticorpo due volte in PBS (2 X 10 min a temperatura ambiente). </li><li> Trasferimento inserti di anticorpi secondari fluorescenti coniugato diluito in tampone di bloccaggio (capra anti-topo, 1:2.000), utilizzando volumi standard. Incubare coperto dalla luce per 2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente. </li><li> Lavare 3x anticorpo secondario in PBS (3 x 10 min a temperatura ambiente). </li><li> Dopo IF è completo, prendere inserire out, svuotare PBS dall&#39;ultimo lavaggio e pulire il lato superiore del filtro con un applicatore di cotone punta. Aspirare il liquido dai lati superiore e inferiore. </li><li> Luogo inserire capovolta sulla panchina, e tagliare il filtro dell&#39;inserto con un bisturi affilato. </li><li> Tenere il filtro con una pinza, ribasso, e mettere al microscopio diapositiva. Overlay con un vetrino e mou-compatibile fluorescentesupporti nting. Lasciate asciugare piatto in camera fredda, coperto dalla luce. Esaminare e catturare immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza. NOTA: Se conservato a 4 ° C e al riparo dalla luce, questi preparati possono essere conservati per settimane con una perdita minima di fluorescenza. </li><li> OPTIONAL: In alternativa, se può essere eseguita su filtri che sono stati rimossi dal dell&#39;inserto. Per fare questo, raschiare e pulire il lato superiore dei filtri direttamente dopo la fissazione. <ol><li> Prendere filtri su inserti con un bisturi e filtri Consiglio tagliente assoni-up sul fondo di una piastra sei pozzetti. </li><li> Successivamente, eseguire incubazione per IF come indicato in 7,4-7,8 e 7.11. Il vantaggio di questa alternativa è che risparmia reagenti, poiché, ad esempio, i volumi di incubazione può scendere a 500 microlitri (rispetto ai 3 ml utilizzati a filtri colorati direttamente sugli inserti come mostrato in 7,1-7,11). </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Parametri importanti da prendere in considerazione quando si adegua questa tecnica includono la popolazione neuronale che sarà studiato, il substrato, dimensione dei pori del filtro e superficie. Tutti questi parametri avranno un impatto la specificità, la qualità e la quantità della preparazione neurite ottenuto, e deve essere considerato con attenzione da parte dell&#39;utente finale. Negli esempi presentati in questo protocollo, l&#39;uso di neuroni DRG ha il vantaggio di estendere solo assoni, dando così una pu...

Il compartimento assonale dei neuroni mostra un buon grado di autonomia funzionale dal compartimento somato-dendritico. In neuroni di proiezione, assoni contengono la maggior parte della proteina 1,2 neuronale. Lo studio della fisiologia e fisiopatologia degli assoni ha avuto un impulso nella comunità neuroscientifica, perché recenti studi hanno dimostrato che inizi la disfunzione assonale sembra essere una caratteristica comune delle malattie neurodegenerative e dei disturbi neuropsichiatrici 3. Sembra probabile che una migliore comprensione dei meccanismi assonale esclusiva in condizioni normali e patologiche farà luce sui primi eventi che guidano erettile. Il presente protocollo descrive come utilizzare inserti di coltura recanti una membrana porosa (filtro) per ottenere grandi quantità di materiale assonale puro che è adatto per biochimica e analisi immunocitochimica. L&#39;uso del filtro inserti a studiare biologia assonale è stato realizzato da Steward ecolleghi 4 e ulteriormente sviluppati da Twiss e colleghi 5 alla sua configurazione attuale. La tecnica è ora in uso corrente da gruppi studiano diversi aspetti della assonale e dendrite biologia, con lievi modifiche in ciascun caso per ospitare per la popolazione di neuroni studiati, i trattamenti eseguiti e del tipo di analisi biochimiche usati 6-9. Il presente protocollo non intende accogliere tutte le alternative per una tale varietà di applicazioni, ma piuttosto di fornire un approccio semplice che è adatto per la maggior parte delle applicazioni. In particolare, il protocollo qui descritto utilizza un triplo strato che massimizza il rendimento assonale per le analisi biochimiche ed è più adatto per studiare i rivestimenti assonale degenerazione-altri descritti nella letteratura prodotta meno assoni che ritraggono e degenerano più rapidamente in caso di privazione di fattori trofici 9. In questa procedura, corpi cellulari neuronali rimangono isolati in cima alle wh filtroassoni ile passano attraverso i pori e crescono lungo la sua superficie di fondo. Assoni puro (esente della glia e contaminanti corpo cellule neuronali) che si sviluppano sulla superficie inferiore del filtro possono essere raccolti per analisi biochimiche o possono essere fissati in situ ed esaminati mediante tecniche immunocitochimiche 9. La procedura si basa sull&#39;utilizzo di neuroni sensoriali embrionali dai gangli della radice dorsale (DRG). DRG embrionali sono ampiamente usati per studiare biologia assonale perché neuriti da queste cellule subiscono quando mantenuto in fattore di crescita nervosa (NGF) crescita veloce e robusto in vitro, e perché rapidamente subiscono degenerazione quando privati ​​di questo fattore. Inoltre, i neuroni DRG mancano dendriti, in modo che tutti i neuriti raccolti da questo metodo sono puramente assoni. Inserti del filtro rappresentano un grande vantaggio rispetto ad altri approcci utilizzati per studiare gli assoni. Studi basandosi sull&#39;uso di microscopia per differenziare i processi che si verificano nel soma cella da quelli di unXON forniscono informazioni biochimiche limitate. Come altro esempio, sistemi di coltura compartimenti (ad esempio, camere Campenot 10 o dispositivi microfluidici 11) sono utili per approcci di imaging e per il trattamento differenziato dei compartimenti cellulari ma forniscono solo piccole quantità di materiale assonale, precludendo l&#39;uso di queste tecniche di analisi biochimiche che richiedono relativamente grandi quantità di campione. Inoltre, il loro uso richiede una formazione significativa così come i dispositivi specializzati, e sono in termini di tempo. Un altro approccio spesso utilizzato per isolare gli assoni da espianti è quello di rimuovere manualmente un centro di espianto (che contiene i corpi cellulari neuronali) prima della raccolta del campione assonale. Anche se questo può produrre grandi quantità di preparazioni assone arricchito, assoni di questa preparazione possono essere avvolti glia e rimuovere rapidamente organi 20 di espianto consecutivamente da 6 pozzetti (come esempio di un esperimento minima) richiede tempo e al limite della fattibilità. Al contrario, il metodo presentato qui produce abbondanti e pure preparati assonale che possono poi essere analizzati da virtualmente qualsiasi tecnica biochimica che viene comunemente utilizzato per analizzare lisati di cellule intere, come western blot, immunoprecipitazione 6, northern blot 5 spettrometria di massa 6, purificazione dell&#39;RNA 7,12,13, tra gli altri. Inoltre, il protocollo può essere applicato a tecniche di immunofluorescenza (IF), in quanto è possibile fissare assoni in crescita nella parte inferiore del filtro di esaminarli ulteriormente IF. Questo approccio facilita notevolmente l&#39;analisi dei processi specifici assonale poiché non esistono corpi cellulari nella preparazione finale. Questo è un vantaggio significativo in quanto un segnale alto immunofluorescenza da corpi cellulari spesso pregiudica esame e l&#39;analisi di un segnale più debole proveniente da strutture sottili come assoni. Due applicazioni del metodo di coltura per studiare assonale degenerazione are descritto; un modello di potatura di sviluppo e un modello di degenerazione lesioni indotte (comunemente indicato come la degenerazione walleriana). La modellazione di potatura sviluppo si basa sul fatto che i neuroni sensoriali in vivo competono per limitare quantità di NGF-bersaglio derivato e quelli non ricevono abbastanza neurotrofico supporto degenerato 14. Questo fenomeno può essere imitato in colture DRG embrionali ritirando NGF dal terreno di coltura, che, come accade in vivo, avvia degenerazione assonale seguito dalla distruzione corpo cellulare. Per modellare degenerazione Wallerian, il lato superiore del filtro con i corpi cellulari viene raschiata via. Gli assoni che erano cresciute sul lato inferiore del filtro diventare fisicamente separati dai corpi cellulari e successivamente subire il processo degenerativo rapido e stereotipico noto come degenerazione Walleriana 15, dal nome A. Waller che per primo ha segnalato il fenomeno nel 1850 16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="972">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">CD-1 mouse, E13 timed pregnancy</td>
			<td style="width:140px;">Charles River</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:416px;">In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353102</td>
			<td>1 &#181;m pore size, fits 6-well receiving plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Cell Culture Companion Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353502</td>
			<td>Receiving plates for inserts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6407</td>
			<td>Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td style="width:416px;">Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 &#176;C and thaw overnight at 4 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureCol Bovine Collagen Solution</td>
			<td>Advanced Biomatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Leibovitz&#39;s L-15 Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>Can be replaced by DMEM.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neurobasal Medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B-27 Serum-Free Supplement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5-Fluoro-2&#8242;-deoxyuridine (FDU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NGF (2.5S, beta subunit)</td>
			<td>Cedarlane</td>
			<td>CLMCNET-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="109" rowspan="2" style="height:109px;width:297px;">Anti-NGF Antibody</td>
			<td style="width:140px;">Prepared in-house</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:416px;">As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. &#38; Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">AN-240</td>
			<td>Commercial option</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Tubulin Antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MAB5564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DRG culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:297px;">Neurobasal Medium 
			2 % B27 Neurobasal Supplement 
			2 mM l-Glutamine 
			1 % Penicillin-Streptomysin 
			10 &#181;M FDU 
			15 ng/ml NGF (bottom compartment only)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1X Laemmli Sample Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:297px;">10 % SDS 
			0.5 M DTT 
			0.5 M Tris (pH 6.8) 
			5 % Glycerol 
			0.01 % (w/v) Bromophenol blue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production and isolation of axons from sensory neurons for biochemical analysis using porous filters

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.

Espianti gangli spinali dei topi E13.5 crescono ampiamente su filtri in sequenza rivestito con poli-D-lisina, laminina e collagene (Figura 1B, a sinistra), arrivando fino a due millimetri entro 2 giorni di coltura. Questa combinazione produce substrato di crescita particolarmente esuberante; altre combinazioni producono assoni che sono notevolmente più brevi (Figura 1B, a destra). Inoltre, DRG mantenuti sui filtri estendere assoni più e più a lungo rispetto DRG coltivate su plastica ...

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Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.

Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l&#39;analisi biochimica Uso dei filtri porosi

Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K Views.  Montreal Neurological Institute, McGill University. This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration. 

Video: Production and Isolation of Axons from Sensory Neurons for Biochemical Analysis Using Porous Filters

Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and other social interactions. The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy to conduct, and reliable method to assay olfactory function at the level of the olfactory epithelium. Since the 1956 description of the EOG by Ottoson in frogs1, the EOG recording has been applied in many vertebrates including salamanders, rabbits, rats, mice, and humans (reviewed by Scott and Scott-Johnson, 2002, ref. 2). The recent advances in genetic modification in mice have rekindled interest in recording the EOG for physiological characterization of olfactory function in knock-out and knock-in mice. EOG recordings have been successfully applied to demonstrate the central role of olfactory signal transduction components3-8, and more recently to characterize the contribution of certain regulatory mechanisms to OSN responses9-12.
Odorant detection occurs at the surface of the olfactory epithelium on the cilia of OSNs, where a signal transduction cascade leads to opening of ion channels, generating a current that flows into the cilia and depolarizes the membrane13. The EOG is the negative potential recorded extracellularly at the surface of the olfactory epithelium upon odorant stimulation, resulting from a summation of the potential changes caused by individual responsive OSNs in the recording field2. Comparison of the amplitude and kinetics of the EOG thus provide valuable information about how genetic modification and other experimental manipulations influence the molecular signaling underlying the OSN response to odor. 
Here we describe an air-phase EOG recording on a preparation of mouse olfactory turbinates. Briefly, after sacrificing the mouse, the olfactory turbinates are exposed by bisecting the head along the midline and removing the septum. The turbinate preparation is then placed in the recording setup, and a recording electrode is placed at the surface of the olfactory epithelium on one of the medial turbinates. A reference electrode is electrically connected to the tissue through a buffer solution. A continuous stream of humidified air is blown over the surface of the epithelium to keep it moist. The vapor of odorant solutions is puffed into the stream of humidified air to stimulate the epithelium. Responses are recorded and digitized for further analysis.

The electroolfactogram (EOG) recording is an informative, easy-to-conduct, and reliable way of assessing olfactory function at the level of the olfactory epithelium. This protocol describes a recording setup, mouse tissue preparation, data collection, and basic data analysis.

Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l&#39;aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Animals depend on olfaction for many critical behaviors, such as finding food sources, avoiding predators, and identifying conspecifics for mating and ...

Ricerca

Neuroscienze

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic development and axonal wiring. Recently the dendritic arborization (DA) sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system (PNS) have become powerful genetic models in which to elucidate both general and class-specific mechanisms of neuron differentiation.
There are four main DA neuron classes (I-IV)1. They are named in order of increasing dendrite arbor complexity, and have class-specific differences in the genetic control of their differentiation2-10. The DA sensory system is a practical model to investigate the molecular mechanisms behind the control of dendritic morphology11-13 because: 1) it can take advantage of the powerful genetic tools available in the fruit fly, 2) the DA neuron dendrite arbor spreads out in only 2 dimensions beneath an optically clear larval cuticle making it easy to visualize with high resolution in vivo, 3) the class-specific diversity in dendritic morphology facilitates a comparative analysis to find key elements controlling the formation of simple vs. highly branched dendritic trees, and 4) dendritic arbor stereotypical shapes of different DA neurons facilitate morphometric statistical analyses.
DA neuron activity modifies the output of a larval locomotion central pattern generator14-16. The different DA neuron classes have distinct sensory modalities, and their activation elicits different behavioral responses14,16-20. Furthermore different classes send axonal projections stereotypically into the Drosophila larval central nervous system in the ventral nerve cord (VNC)21. These projections terminate with topographic representations of both DA neuron sensory modality and the position in the body wall of the dendritic field7,22,23. Hence examination of DA axonal projections can be used to elucidate mechanisms underlying topographic mapping7,22,23, as well as the wiring of a simple circuit modulating larval locomotion14-17.
We present here a practical guide to generate and analyze genetic mosaics24 marking DA neurons via MARCM (Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker)1,10,25 and Flp-out22,26,27 techniques (summarized in Fig. 1).

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

The dendritic arborization sensory neurons of the Drosophila larval peripheral nervous system are useful models to elucidate both general and neuron class-specific mechanisms of neuron differentiation. We present a practical guide to generate and analyze dendritic arborization neuron genetic mosaics.

Analisi morfologica del Drosophila Larvale dendriti sensoriali e periferico Neuron assoni utilizzo Mosaici genetici

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

Isolamento e la coltura di neuroni ippocampali da topi prenatali

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

Isolamento e Cultura della dissociato neuroni sensoriali da embrioni di gallina

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

Rimozione di<em&gt; Drosophila</em&gt; Tessuto muscolare da larvali Filetti per l&#39;analisi di immunofluorescenza dei neuroni sensoriali e cellule epidermiche

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...