The experiments were supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada to CMSP. We thank Koppert Canada for their bumblebee colony donations. Portions of this manuscript, including some figures and tables have been published in Naturwissenschaften11, and reproduced here with permission from Springer.

O Comitê da Universidade de Ottawa Animal Care aprovou nosso protocolo experimental, que delineia os procedimentos de segurança para o pessoal que trabalha com abelhas. 1. Teste de Preparação Ambiente <ol><li> Prepare um espaço vazio (isolado quarto, ou gaiola de vôo de tela metálica coberta) de 2 mx 2 mx 2 m. NOTA: Se a sala é escolhido como o espaço de teste, certifique-se que as abelhas não podem escapar através das janelas, espaços sob as portas, e dutos de troca de ar. </li><li> Adicionar pontos de entrada pequenas (por exemplo, furos aprox. 2 centímetros de diâmetro) para a gaiola de voo em que as abelhas podem entrar e sair do espaço de teste sem obstrução. Criar um mecanismo para bloquear os pontos de acesso das abelhas para manter fora do espaço do teste durante períodos reservados para manutenção e configuração do equipamento. NOTA: Foi utilizado Bombus impatiens trabalhadores Cresson. </li><li> Conecte-se uma ou duas caixas de colônia para o espaço de teste usando um conector. Certifique-se de que uma abelha morta não pode block o conector. NOTA: Aqui, use dois tipos de estruturas de ligação: uma &quot;ponte&quot; estrutura de madeira com uma tampa superior de vidro, e um tubo de malha de arame. Eles são fáceis de limpar e que proporcionam tração para as abelhas. </li><li> Coloque dois titulares de flores artificiais no interior do espaço de teste. <ol><li> Coloque os titulares de flores no centro do espaço-teste, ou anexá-los à parede. </li><li> Ligue um leitor de RFID &quot;cabeça 2K6&quot; ao topo da porção do cilindro da flor artificial usando fita adesiva (veja a Figura 1 para posicionamento). Use um suporte de madeira de 1,2 m de altura para que anexar flores artificiais. NOTA: A parte superior do suporte deve apresentam um mecanismo de fixação em que as flores artificiais podem ser conectados. Ver Figura 2 para um desenho esquemático </li></ol></li><li> Adicione-alta frequência (min. 200 Hz) luminárias fluorescentes para iluminar adequadamente o espaço de testes. Use um reator eletrônico de alta freqüência para garantir que light flicker está acima flicker visuais limiar de fusão &#39;zangões 6. NOTA: Aqui, usar 12 lâmpadas fluorescentes de luz que produzem cerca de 1.200 lux intensidade luminosa para um espaço de 2 x 2 x 2 m. </li></ol><img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig1highres.jpg" /> Figura 1. RFID desenho de flor artificial. Diagrama esquemático da flor artificial RFID usado na Experiência 1. O leitor RFID descansou no topo do cilindro aberto através do centro da flor. Padrões e posições estímulos: a. periférica-concêntrico, b. centro-concêntrico, c. -periférica radial e d. -radial central. Esta figura foi modificada de Orbán et al. 11. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig2highres.jpg" /> <strong&gt; Figura 2. Estímulo stand de exibição. Um desenho esquemático mostrando o design do stand flor estímulo artificial, e apego clipe. O clip de fixação é colada à flor artificial e é usada para conectar rapidamente e retirar os estímulos de e para as arquibancadas estímulos. Esta configuração foi utilizada no experimento de vídeo sensível ao movimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52033/52033fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> 2. Bumblebee Colony Preparação <ol><li> Após a chegada de colônias encomendados comercialmente, ligar a caixa de colônia para a gaiola de vôo. </li><li> Fornecer o pólen (recolhido por abelhas a partir de uma variedade de plantas) e açúcar-água (1: 1 em volume) ad libitum até ao início das sessões de testes. <ol><li> Ferver 1 L de água e misturar no mesmo volume de açúcar para criar a solução de açúcar-água. </li><li> Adquira o pólen de um apicultor ou commercial fornecedor de colônias de abelha. Moer o pólen com um almofariz e pilão, e misture com mel e água (se necessário) para torná-lo em uma pasta úmida. </li></ol></li><li> Uma vez que a experiência se inicia, fornecer 15-40 ml de água com açúcar (quantidade proporcional ao tamanho das colónias) por dia. Continuar a fornecer pólen ad libitum. Ajuste a quantidade de açúcar-água de acordo com os níveis de armazenamento nos potes de mel. Nota: Os níveis de armazenamento de alimentos Manter baixo fornece um incentivo para que os trabalhadores deixam o ninho para procurar mais comida. </li><li> Permitir que as abelhas para entrar no ambiente de teste através da estrutura do conector, tal como descrito na etapa 1.3. NOTA: As abelhas se mover livremente entre o ninho eo ambiente de teste durante todo o experimento. </li></ol> 3. Preparação para a Observação de identificação por radiofrequência <ol><li> Iniciar a colagem de etiquetas RFID ao tórax dos trabalhadores, logo que chega a colónia, e continuar ao longo da experiência, como novo trabalhoers surgir. </li><li> Técnica de colagem <ol><li> Coloque todos os trabalhadores em recipientes individuais durante a marcação inicial. Frescos trabalhadores por aproximadamente 1 hora na geladeira (cerca de 7 ° C) para atrasá-los. NOTA: O resfriamento trabalhadores com antecedência de marcação ajuda a tornar colônias agressivos mais gerenciável. Isto minimiza a possibilidade de picadas. </li><li> Usando o aparelho de marcação e cola não tóxica (fornecido pelo provedor de marca), anexar a tag RFID para o tórax do trabalhador. As etiquetas RFID cola para os trabalhadores à medida que surgem, enquanto eles ainda estão em fase imatura (antes que eles são capazes de voar). </li><li> Espera um mínimo de 10 minutos antes de colocar o trabalhador de volta na colónia para assegurar a etiqueta RFID não pode ser removido pelo trabalhador. </li></ol></li><li> Descarte de trabalhadores que não foram marcados durante a sua fase imatura, ou trabalhadores que perderam seus tags RFID (como visto pelo resíduo de cola ou careca no tórax). NOTA: Estas abelhas podem ter experiência teve outsidenviar um e colônia. </li><li> Software leitor de RFID <ol><li> Usar um computador pessoal (PC) para configurar o software de leitura de RFID. Alterar o formato de data do sistema operacional para hh aaaa-mm-dd: mm: ss para garantir que os dados de RFID baixados são corretamente codificado. Ajuste o programa fornecido com os leitores de RFID, utilizando linguagem de programação C ++ para permitir exportar os dados no leitor RFID como Comma Separated Values ​​(CSV). </li><li> Ligue o leitor de RFID para o computador usando um RS-232 para USB conector. Faça o download dos dados para o leitor RFID periodicamente, antes que o leitor chega a capacidade de armazenamento (até 32.000 registros). Use leitores de RFID para registrar data, hora e uma cadeia exclusiva treze caráter associado a cada tag. Importe o arquivo CSV baixado em um sistema de gerenciamento de banco de dados relacional (RDBMS). </li></ol></li></ol> 4. Artificial Flor Preparação para Leitores RFID <ol><li> Adquira azul e amarelo assar argila de uma loja de artesanato local. </li><li> Criar um blcilindro ue com um diâmetro de 1,5 cm, e cortar um 1,5 centímetros x 3 cm buraco na lateral. NOTA: O orifício do lado do cilindro vai servir de receptáculo para o leitor RFID. </li><li> Criar um cone de azul, com um diâmetro de 8 cm em uma extremidade, e 1,5 cm na outra extremidade. </li><li> Mesclar o cilindro eo cone. </li><li> Criar uma cadeia de 20 cm de comprimento e 0,5 cm de largura de argila amarela. </li><li> Cortar o fio amarelo ao tamanho, e trabalhar para o cone azul e do cilindro. NOTA: formas radiais exigirá cinco centímetros de comprimento de linhas retas e formas concêntricas exigirá 4-8 cm de comprimento linhas circulares. </li><li> Asse argila a 130 ° F até estar completamente endurecido. </li></ol> 5. Preparação para a Observação de gravação Motion-sensível Vídeo <ol><li> Comece colando etiquetas numéricas plástico colorido ao tórax das abelhas operárias, logo que a colônia chega, e continuar durante todo o experimento como novos trabalhadores emergir. </li><li> Remova todos os trabalhadores durante o Taggi inicialng sessão para assegurar que cada indivíduo recebe uma etiqueta de número. Trabalhadores lugar de volta na colônia imediatamente após a aplicação. NOTA: Ao contrário de etiquetas RFID, etiquetas numéricas são mais difíceis para os trabalhadores de remover. </li><li> À medida que novos trabalhadores emergir, marcá-los enquanto eles ainda estão imaturos. Marcação de frequência varia com o estado do ciclo colonial, mas as médias de cerca de 7-10 trabalhadores a cada 2-3 dias. Descarte de trabalhadores que não foram marcados durante a sua fase imatura porque eles podem não estar mais-flor ingênuo. </li><li> Sistema de marcação de mais trabalhadores do que números das etiquetas disponíveis NOTA: Se o experimento continua por um período de meses e várias colônias estão envolvidos, há uma boa chance de que os números de tag disponíveis acabar. Há cerca de sete cores de tag distinguíveis, cada numeradas de 1 a 99, permitindo até 693 trabalhadores simultaneamente marcados. Um experimento em execução por 3 meses usando 3-4 colônias terá bem mais de 693 trabalhadores no total, mas nunca simultaneamente vivo. &lt;ol&gt; <li> Certifique-se de que os números marcas estão posicionadas de forma sistemática (por exemplo, parte de cima do número da etiqueta é sempre alinhado com a cabeça da abelha), especialmente para os seguintes números: 6, 9, 66, 69, 99. </li><li> Remover trabalhadores mortos, e gravar seu número da etiqueta como &quot;liberado&quot;. Manter uma base de dados de números e cores que são tag &quot;disponível&quot; ou &quot;em uso&quot; para garantir que uma marca única, não é usado em vários abelhas ao mesmo tempo. NOTA: Adicionais combinações de tag pode ser produzido adicionando cores cores já existentes. Por exemplo, adicionar um ponto amarelo a um tag azul com uma caneta Sharpie pode criar novas combinações. </li></ol></li><li> Vídeo de Processamento de Dados <ol><li> Coloque duas protocolo de internet (IP) camcorders (resolução mínima da imagem 1 mp) na frente de cada exposição floral, fora do ambiente de teste (ver Figura 3). <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig3highres.jpg" /> <strong&gt; Figura 3. Teste de Meio Ambiente. Uma fotografia do ambiente de teste, mostrando as duas câmaras frontais em primeiro plano, a câmara de teto entre as luminárias e os estímulos se de estímulos no meio da sala. NOTA: Uma divisória de vidro entre as câmaras de vídeo IP e as flores artificiais garante que as flores artificiais são claramente visíveis. As câmaras de vídeo IP pode ser de até 5 m de distância dos estímulos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52033/52033fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> </li><li> Substitua as lentes de ações com lentes vari-focal 1,8 milímetros. Essas lentes permitem zoom suficiente e se concentrar nas flores artificiais. </li><li> Coloque uma câmera IP adicional diretamente acima da flor artificial, com foco em uma área de 1-2 m na frente das flores artificiais. Esta câmara de vídeo capta pairando e antenação comportamentos. </li><li> Ligue as câmaras de vídeo IP<html> a um PC através de um controlador de interface de rede secundária (NIC), e um hub Ethernet. </li><li> Configurar o protocolo de configuração de host dinâmico do PC (DHCP) para distribuir dinamicamente endereços IP para as câmaras de vídeo IP. </li><li> Configurar um servidor de protocolo de transferência de arquivos (FTP) no PC. </li><li> Configure um processo de cliente de FTP para depositar automaticamente clips de vídeo no PC. </li><li> Configure a câmera de vídeo IP para gravar um vídeo de 10 segundos cada movimento do tempo é detectado. </li></ol></li><li> Análise videoclip <ol><li> Abra um clipe de vídeo, e ver o conteúdo frame-by-frame usando um visualizador de vídeo de escolha. </li><li> Gravar uma abelha tag plástico número, data e hora de gravação em uma planilha ou um RDBMS. Aqui, definir um pouso como as pernas de uma abelha entrar em contato com a flor artificial. NOTA: Descarte escolhas que são socialmente influenciados (pouso, enquanto outra abelha está presente no estímulo). </li></ol></li></ol>e &quot;&gt; 6. Artificial flor de Preparação para a Observação de Vídeo <ol><li> Projete propriedades visuais que utilizam um software de edição gráfica. NOTA: Certifique-se que o padrão impresso pode ser cortado e dobrado em um cone. Use cálculos geométricos para produzir a forma do entalhe, que resulta em um cone com um diâmetro de 8 cm. </li><li> Imprimir, recortar e dobrar a propriedade visual em um cone. </li><li> Clipes de fixação de cola ao estímulo (ver Figura 2). </li></ol> 7. Análise estatística <ol><li> Em ambos os experimentos, calcular uma proporção escolha para cada abelha (por exemplo, uma abelha especial feito x escolhas de uma flor, de um total de y). </li><li> Analisar essas proporções com uma bondade replicados de Fit Teste 7. NOTA: Um teste replicado G-calcula um valor de heterogeneidade (L h) que indica a quantidade de variabilidade de repetições (ou seja, cada abelha), e um valor agrupado (L p) que indica a importância global detodas as proporções escolha. Os valores G são comparados com valores χ 2 em testes de significância. </li></ol> 8. Os estímulos Apresentação Sequence <ol><li> Anexar flores artificiais para as bancas de flores no interior do espaço de teste. Altere a combinação ea localização dos estímulos apresentados em intervalos regulares de tempo (por exemplo, diariamente) para evitar os efeitos de localização. </li></ol> Rescisão 9. Estudo <ol><li> Coloque as colônias no congelador a -10 ° C durante 3 dias para matar as abelhas. </li></ol>

<ol>
	<li>Plowright, C. M. S., Evans, S. A., Leung, J. C., Collin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preference+for+symmetry+in+flower-na&#239;ve+and+not-so-na&#239;ve+bumblebees.">The preference for symmetry in flower-na&#239;ve and not-so-na&#239;ve bumblebees.</a> Learn. Motiv. 42 (1), 76-83 (2011).</li><li>Streit, S., Bock, F., Pirk, C. W. W., Tautz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+life-long+monitoring+of+individual+insect+behaviour+now+possible.">Automatic life-long monitoring of individual insect behaviour now possible.</a> Zool. 106, 169-171 (2003).</li><li>Chittka, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+human+are+insects,+and+does+it+matter.">How human are insects, and does it matter.</a> Formosan Entomol. 31, 85-99 (2011).</li><li>Lihoreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radar+tracking+and+motion-sensitive+cameras+on+flowers+reveal+the+development+of+pollinator+multi-destination+routes+over+large+spatial+scales.">Radar tracking and motion-sensitive cameras on flowers reveal the development of pollinator multi-destination routes over large spatial scales.</a> PLoS Biol. 10 (9), e1001392 (2012).</li><li>Brodbeck, D. R., Shettleworth, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matching+location+and+color+of+a+compound+stimulus:+Comparison+of+a+food-storing+and+a+nonstoring+bird+species.">Matching location and color of a compound stimulus: Comparison of a food-storing and a nonstoring bird species.</a> J. Exp. Psychol. Anim. Behav. 21 (1), 64-77 (1995).</li><li>Srinivasan, M., Lehrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+resolution+of+colour+vision+in+the+honeybee.">Temporal resolution of colour vision in the honeybee.</a> J. Comp. Physiol. A. 157 (5), 579-586 (1985).</li><li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J., Freeman, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> , (2011).</li><li>Lunau, K., Fieselmann, G., Heuschen, B., van de Loo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+targeting+of+components+of+floral+colour+patterns+in+flower-na&#239;ve+bumblebees+(Bombus+terrestris;+Apidae).+.">Visual targeting of components of floral colour patterns in flower-na&#239;ve bumblebees (Bombus terrestris; Apidae). .</a> Naturwissenschaften. 93 (7), 325-328 (2006).</li><li>Lehrer, M., Horridge, G. A., Zhang, S. W., Gadagkar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shape+vision+in+bees:+Innate+preference+for+flower-like+patterns.">Shape vision in bees: Innate preference for flower-like patterns.</a> Phil. Trans. R. Soc. B. 347 (1320), 123-137 (1995).</li><li>Thompson, E. L., Plowright, C. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+images+may+or+may+not+represent+flowers:+picture-object+correspondence+in+bumblebees+(Bombus+impatiens).">How images may or may not represent flowers: picture-object correspondence in bumblebees (Bombus impatiens).</a> Anim. Cognit. , (2014).</li><li>Orb&#225;n, L. L., Plowright, C. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+flower-like+and+non-flower-like+visual+properties+on+choice+of+unrewarding+patterns+by+bumblebees.">The effect of flower-like and non-flower-like visual properties on choice of unrewarding patterns by bumblebees.</a> Naturwissenschaften. 100 (7), 621-631 (2013).</li><li>Leonard, A. S., Papaj, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X&#8221;+marks+the+spot:+The+possible+benefits+of+nectar+guides+to+bees+and+plants.">X&#8221; marks the spot: The possible benefits of nectar guides to bees and plants.</a> Funct. Ecol. 25 (6), 1293-1301 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

A tecnologia RFID permite que estudam centenas de trabalhadores individuais com facilidade e de alta precisão, mas as características do comportamento gravado é diferente a partir de observações por seres humanos e gravações de vídeo. O comportamento de escolha registrado por RFID pode ser descrito como a exploração floral. Este é um critério muito rigoroso de preferência em comparação com critérios utilizados em outros estudos, como a abordagem 8, a entrada em um labirinto de braço 9,10, a reação da antena 8, ou pouso em um padrão de 11,12. A fim de comparar a validade das definições comportamento de escolha, e para validar o novo método de RFID para o comportamento sem recompensa, gravações de vídeo de pouso foi observada no experimento 2. Todas as medidas de escolha não são iguais: o critério de RFID como medido por entrada floral, indicou que a propriedade visual do padrão de posicionamento é mais importante para escolha de abelha, enquanto os dados de vídeo indicaram que a propriedade visual do tipo de padrão é mais importante para escolha de abelha. Um dos desafios gerais em estudar o comportamento de escolha inculto é que é muito difícil atrair flor ingênua, abelhas sem treinamento para flores artificiais que não oferecem qualquer pólen ou néctar. De fato, muitas das experiências anteriores recorreram a treinar abelhas no ambiente de testes em estímulos que são pensados ​​para ser irrelevante para o comportamento de escolha de estímulos de teste. RFID e gravações de vídeo sensíveis ao movimento superar esse obstáculo, permitindo a gravação contínua, 24 horas por dia, sem a supervisão constante do pesquisador, e aumentando o tamanho da amostra 15-20 abelhas para várias centenas de abelhas. Enquanto escolhas sem recompensa por abelhas sem formação continuam a ser uma ocorrência rara, estes novos parâmetros de projeto experimental fazer a observação possível. Outras melhorias oferecidas por estas duas técnicas incluem a eliminação do viés da amostra, a melhoria da validade externa e acompanhamento das diferenças individuais. Sample viés podem ser introduzidos quando apenas estudar uma dúzia de abelhas em uma colônia. Há diferenças significativas nas idiossincrasias comportamentais em todo os trabalhadores individuais, mesmo dentro de uma mesma colônia que são provavelmente perdida, porque só os trabalhadores são observados que acontecer a &quot;cooperar&quot; com o pesquisador em um determinado momento. Estudar 15-20 abelhas em uma colônia de 300 ou mais abelhas, representa tão pouco como 5% do total da colónia, no qual viés caso de amostragem pode ser significativo. Marcação e observar o comportamento de todos os trabalhadores elimina este problema completamente. O número de escolhas estímulos simultâneas pode também ser manipulado. Oferecemos opções binárias em nosso experimento, por motivos técnicos, mas única escolha ou vários projetos de escolha também são viáveis. Em termos de validade externa, estudando as abelhas em um ambiente de laboratório tem sido tradicionalmente muito artificial, o que tem impedido a generalização dos resultados. Por exemplo, os pesquisadores tiveram que ser present para coleta de dados, as abelhas tiveram de forragem em um ambiente de teste um por um, e os testes foram restritos a uma pequena janela de tempo. As novas técnicas descritas neste documento remover essas limitações artificiais, fazendo a observação sem supervisão e sem restrições. Finalmente, as diferenças individuais de comportamento pode ser documentado, pois podemos verificar se estas foram repetidas escolhas por uma única abelha ou por várias abelhas. Sensível ao movimento, câmaras de vídeo de alta resolução espacial têm a vantagem sobre as técnicas de RFID em termos de flexibilidade de modelos de estímulos: o aparecimento de um estímulo visual pode ser praticamente qualquer configuração ou forma, desde que a identificação do sujeito pode ser capturada em pelo menos um alguns fotogramas. Processamento de vídeos é um pouco mais demorada do que o processamento de dados de RFID, pois a identificação precisa ser lido pelo pesquisador, que exige a inspeção manual de cada videoclipe. Se o projeto de estímulo visual pode satisfazer as restrições de RLeitor FID (ou seja, as etiquetas RFID sobre a abelha deve chegar a pelo menos 3-4 mm do leitor RFID), então a tecnologia RFID tem a vantagem sobre coleta automatizada de dados em grande escala. A pesquisa qualitativa provavelmente continuará a ser favorecido por meio de análise de vídeo. Como mostrado neste experimento, os leitores de RFID podem acumular grandes conjuntos de dados, que não requer codificação manual. Os ligeiramente diferentes vantagens associadas com cada técnica sugerem que no futuro eles poderiam ser utilizados de uma forma complementar. O futuro de ambas as tecnologias pode estar na quantificação precisa dos comportamentos que ocorrem raramente. Por exemplo, uma possibilidade distinta para futuras aplicações é empregar essas técnicas em estufas e outros ambientes mais naturalistas. A combinação de naturalismo e controle experimental permitiria abordar questões que não eram possíveis antes de responder. Em termos gerais, estas técnicas oferecem duas novas formas de observar o comportamento em um um rigorosoforma eficiente nd. RFID e vídeo sensível ao movimento é um passo significativo não apenas para pesquisadores que estudam ou insetos polinizadores, mas estas técnicas também podem recorrer a outros cientistas comportamentais.

Um problema-chave no estudo de comportamento de escolha desaprendido por abelhas e as abelhas é que de flores ingênuo, trabalhadores sem treinamento não são facilmente entrar no espaço de testes em que as preferências podem ser medidos. Como resultado, muitos pesquisadores dependem de uma técnica menos do que ideal: trabalhadores pré-treinamento para alimentar dentro do espaço de teste a partir de estímulos aparentemente neutros que os pesquisadores julgam ser diferente dos estímulos experimentais. No entanto, experiências recentes têm mostrado que os estímulos que foram pensados ​​para ser neutros (ou seja, estímulos que não influenciam o comportamento de escolha subsequente em uma sessão de testes) influenciaram preferências de forma inesperada um. Os sistemas automatizados que incluem identificação por radiofrequência (RFID) 2 e gravações de vídeo com sensores de movimento podem oferecer uma oportunidade resolver este problema. O objectivo do estudo era duplo: (1) principalmente para contribuir para a literatura sobre preferências florais desaprendizados por abelhas, (2) e, secundariamente, para evaliar dois sistemas de medição de escolha, como registrado por dois dispositivos diferentes de gravação automatizadas. Dois sistemas automatizados 3 foram implementados no presente estudo para observar o comportamento de escolha desaprendido: RFID e gravações de vídeo sensíveis ao movimento. Dois elementos cruciais de ambos os sistemas são de que as escolhas não são recompensados, ea exibição de diferentes pistas visuais podem ser manipuladas. Sensível ao movimento de vídeo (alta definição, gravação em uma resolução mp) não só permite a observação contínua de trabalhadores que exploram livremente em um quarto vôo, mas é fundamental para a observação eficiente de eventos relativamente raros 4. A questão de pesquisa no experimento 1 refere-se a como as diferentes propriedades visuais interagem quando exibidos juntos. Este estudo busca explorar a importância relativa do padrão de posicionamento em relação ao tipo de padrão. Usando um projeto 2 x 2, radial (ou seja, sunburst) e concêntrica (ou seja, e do touroye) tipos de padrão são colocados central ou periférica em uma flor artificial (ver Figura 1 para exemplos de estímulos). Leitores RFID são construídas para estes estímulos de flores artificiais especialmente desenhados, e os zangões receber etiquetas RFID permitiu que nos permitem gravar cada trabalhador com etiquetas que entra o estímulo flor artificial. Observação de RFID funciona pelo mecanismo leitor (incorporada nas flores artificiais) o envio de sinais a frequências de rádio (13,56 MHz, neste caso), que são moduladas pela presença de etiquetas passivas. O leitor pode detectar e gravar estas modulações de sinais, que variam ligeiramente em todo etiquetas que permitem tag de identificação único. As questões de Experimento 2 são três. Em primeiro lugar, são flor-entrada, medida pelo RFID e desembarque, medida pelo gravações de vídeo critérios de escolha equivalentes? Escolha é medida em pontos diferentes (pouso para o vídeo, e entrada flor para RFID), o que pode traduzir-se em medidas diferentesde preferência. Em segundo lugar, qual é o efeito do centro vs posicionamento periférico? Desconhece-se se ou não os trabalhadores escolheria um padrão central, se uma combinação que consiste em dois padrões em diferentes posições radiais foram apresentadas (ver Figura 4b). Em terceiro lugar, qual é a importância relativa de posição padrão vs tipo de padrão? Em outras palavras, vai abelhas pousar em padrões do tipo padrão preferido, ou a posição padrão preferido? Abelhas podem preferir centro-radial a um padrão periférico-concêntrico, mas a preferência pode ser devido ao tipo de padrão ou o seu posicionamento central. Neste experimento, duas variáveis ​​foram colocados uns contra os outros 5 (ver Figura 4c, d). No Experimento 2, foram utilizados gravações de vídeo sensível ao movimento em estímulos flor-like. Flores artificiais foram colocados dentro de uma gaiola de vôo, e câmeras de alta definição sensível ao movimento foram apontou para estas flores de front e no topo. Mais especificamente, duas câmaras de vídeo foram posicionados de modo a capturar a vista frontal de cada um dos dois estímulos no espaço do teste. Uma câmera de vídeo adicional foi posicionado entre os estímulos para gravar pairando comportamento de cima, eo comportamento de ambas as flores artificiais capturado. Os zangões foram identificados usando o número de marcas que podem ser lidos em clipes de vídeo de alta definição. Pairando, foram observados antenação e aterragem comportamentos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="708">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:143px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:231px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Miniaturized mic3 tags</td>
			<td style="width:143px;">Microsensys</td>
			<td style="width:119px;">mic3 TAG 64 bit RO</td>
			<td>RFID tags to glue to bee</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RFID reader 2k6 head</td>
			<td style="width:143px;">Microsensys</td>
			<td style="width:119px;">2k6</td>
			<td>RFID readers built into artificial flowers</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IP camcorders</td>
			<td style="width:143px;">Vivotek</td>
			<td style="width:119px;">IP8161</td>
			<td>Motion-sensitive video recorders</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Opalith Plattchen number tags and non-toxic glue</td>
			<td style="width:143px;">Beeworks.com</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>Number tags to glue to bees</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bumblebee Colony for Research</td>
			<td style="width:143px;">Koppert Canada</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Artificial flowers</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Developed by campus biology shop</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Artificial flower stand</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Developed by campus biology shop</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Flight room</td>
			<td style="width:143px;">N/A</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Developed by campus biology shop</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laptop with Windows</td>
			<td style="width:143px;">Generic hardware / Microsoft software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to download RFID data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">RS 232 to USB converter</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Connect RFID reader to computer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Desktop</td>
			<td style="width:143px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to transmit video data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Second NIC</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">10/100M NIC PCI</td>
			<td>Used to transmit video data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Network hub</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;">4-port</td>
			<td>Used to transmit video data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">High precision tweezer</td>
			<td style="width:143px;">SPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to glue number and RFID tags to bees</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sugar</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to mix with water to create sugar-water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pollen</td>
			<td style="width:143px;">Any local apiarist</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Fed to bumblebees</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Marking cage with plunger</td>
			<td style="width:143px;">Beeworks.com</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aids tagging process</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Honey</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Used to mix with water ot create pollen paste</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bake clay</td>
			<td style="width:143px;">Sculpey</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for RFID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Clay shaping tools</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for RFID</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">White paper</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for Video</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Laser printer</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for Video</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wood</td>
			<td style="width:143px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Stimulus for Video -- attachment clip</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radio frequency identification and motion-sensitive video efficiently automate recording of unrewarded choice behavior by bumblebees

Nós apresentamos dois métodos para observar o comportamento de escolha Bumblebee em um espaço de testes fechado. O primeiro método consiste na identificação por radiofrequência (RFID) leitores construídas em flores artificiais que exibem várias pistas visuais e tags RFID (ou seja, transponders passivos) colados ao tórax de trabalhadores zangão. A novidade em nossa implementação é que os leitores de RFID são construídos diretamente em flores artificiais que são capazes de exibir várias propriedades visuais distintas, como cor, tipo de padrão, freqüência espacial (ie, &quot;ocupação&quot; do padrão) e simetria (freqüência espacial e simetria não foram manipulados neste experimento). Além disso, esses displays visuais em conjunto com os sistemas automatizados são capazes de gravar o comportamento de escolha sem recompensa e sem treinamento. O segundo método consiste em comportamento de escolha de gravação em flores artificiais, usando câmeras de alta definição sensível ao movimento. Bumblebees têm etiquetas numéricas colados aos seus thoraces de identificação único. A vantagem desta aplicação sobre RFID é que, além de observar o comportamento de pouso, também pode ser observada medidas alternativas de preferência, como pairando e antenação. Ambos os métodos de automação de aumentar o controle experimental, e validade interna, permitindo que os estudos de maior escala que levam em conta as diferenças individuais. A validade externa também é melhorada, pois as abelhas podem livremente entrar e sair do ambiente de teste, sem restrições, tais como a disponibilidade de um assistente de pesquisa no local. Em comparação com a observação humana em tempo real, os métodos automatizados são mais rentáveis ​​e, possivelmente, menos propenso a erros.

Experimento 1: Os dados RFID Todos os 375 trabalhadores da colônia foram RFID tags, e 318 desses trabalhadores (85%) entraram na gaiola de vôo em algum momento durante o estudo. Um total de 197 (62% das abelhas que deixaram a colônia) visitaram pelo menos um dos quatro estímulos de flores artificiais. Definição de uma escolha A escolha foi definida como um trabalhador de entrar na flor artificial (ver Figura 1). Nós marcado este comportamento como &quot;exploração floral.&quot; Essa definição de uma escolha é mais rigoroso do que os usados ​​na literatura, que, dependendo do estudo, utilizam uma combinação de pairar, antenação ou desembarque. Exploração floral é uma definição mais rigorosa de escolha, porque exige que as abelhas não só assistir a um estímulo ao passar, antennating e pouso sobre ele, mas também por explorá-la. Gestão de dados <p class="jove_content"&gt; técnicas de RFID tem a capacidade de recolher uma quantidade enorme de dados em relação a outros métodos. Esta experiência produziu 310.221 registros. Um programa de banco de dados, como MySQL é uma ferramenta indispensável para armazenar esta quantidade de dados e igualmente importantes são as consultas SQL usados ​​para destrinchar as respostas às perguntas da pesquisa. Por exemplo, um problema é a definição de uma escolha. Os leitores de RFID foram configurados para gravar a presença de uma marcação a cada 1 ms, o que, no caso de abelhas que permaneceram dentro das flores artificiais durante minutos ou mesmo horas, pode traduzir-se em vários milhares de gravações. Nossa definição de uma escolha foi uma visita que durou pelo menos 1 ms, mas uma nova visita não seria contado até a cadeia atual de gravações foi quebrado por, pelo menos, a 1 min pausa. Resumo da experiência Bondade de quatro replicados de testes de ajuste foram realizados em todas as escolhas de &quot;sessão ingênua&quot; de abelhas para comparar escolha proportions para um valor teórico de azar 7. Sessão ingênuo de uma abelha refere-se à primeira condição de testes em que a abelha &quot;participou&quot;. Os G-testes revelam uma preferência para o posicionamento central (ver Tabela 1) e do tipo de padrão radial. A Figura 4b mostra que o padrão de preferência é invertido quando o padrão concêntrico está posicionada centralmente e o padrão radial está posicionado perifericamente. No entanto, se o posicionamento é mantido constante, como na Figura 4a e d, padrão de preferência é para o padrão radial. A Figura 4 mostra que as proporções relativas das primeiras escolhas para cada padrão para cada combinação foi comparável às proporções indicadas para todas as escolhas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig4highres.jpg"/> Figura 4. Resultados Experimentais RFID. As frequências em tele quatro combinações diferentes da flor no Experimento 1. A barra de gráficos castanhos escuros mostrar todas as opções de sessão ingênua da abelha (eixo-y-lateral esquerdo), ea luz barras marrons indicam a primeira escolha de cada trabalhador (eixo-y-direita ). &quot;Todas as escolhas&quot; padrões comparáveis ​​mostra a &quot;primeira escolha&quot;, mas com maior poder estatístico. Os gráficos de barras que mostram o posicionamento de padrões é mais importante do que o tipo de um padrão. Um padrão posicionado centralmente foi preferido, mesmo que o tipo de padrão exibido um padrão concêntrico de outra forma menos preferível. Os asteriscos indicam uma proporção escolha que é significativamente diferente do acaso. Nota. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001. Esta figura foi modificada de Orbán et al. 11. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Condições </td><td colspan="3"> Pooled </td><td colspan="3"> Heterogeneidade </td><td></td></tr><tr><td> Gp </td><td> df </td><td> p </td><td> Gh </td><td> df </td><td> p </td><td></td></tr><tr><td> Centro-Radial vs Central-concêntrico </td><td> 3.96 </td><td> 1 </td><td> 0,047 </td><td> 197,55 </td><td> 41 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr><tr><td> Peripheral-Radial vs Central-concêntrico </td><td> 33.77 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 210,81 </td><td> 42 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr><tr><td> Centro-Radial vs Peripheral-concêntrico </td><td> 508,31 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 345,78 </td><td> 30 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr><tr><td> Periférico-radial periférica vs-concêntrico </td><td> 7.42 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 84.06 </td><td> 24 </td><td> 0.000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. </sTrong&gt; Inferência Estatística de Dados RFID. Experimento 1. Esta tabela foi modificada a partir de Orbán et al. (2013) 11. G p refere-se ao desvio significativo de uma parte do grupo do acaso, e G h refere-se aos testes de diferenças individuais ( ou seja, a heterogeneidade). Por favor, consulte o manuscrito para mais detalhes sobre os testes estatísticos. Experimento 2: Dados de Vídeo Um total de 264 escolhas foram registrados nos quatro condições ao longo de três sessões de testes. A Tabela 2 mostra o número de trabalhadores e escolhas contribuíram de cada colônia. Definição de uma escolha Os dados de vídeo permite a gravação de três tipos de comportamento de escolha: pairar, antenação e desembarque. Embora todos os três tipos de comportamentos podem ser observados, pairando e antenação são difficult associar com um número de etiqueta devido a movimentos rápidos que câmaras de vídeo com baixa resolução, ou baixa velocidade não pode gravar. É fundamental usar uma câmara de vídeo de alta definição (embora este não estava disponível para nós, o ideal é uma câmara de vídeo de alta taxa de quadro devem ser usados ​​para minimizar o desfoque) para garantir números das etiquetas que podem aparecer apenas em um pequeno número de quadros pode ser lido . Este método também foi utilizado para comparar padrões de escolha com a técnica de RFID, o qual detecta a exploração floral. Considerações de sensibilidade de movimento Uma das questões-chave na produção de uma experiência bem sucedida é a configuração das câmaras sensíveis ao movimento. Uma câmara de vídeo que é muito sensível irá gravar muitos dados que é impraticável e pode tornar-se muito caro para processar. Por exemplo, inicialmente nossa câmera foi desencadeada por vibrações regulares do edifício (por exemplo, as pessoas que passam no corredor, ar condicionado, etc.), o que resultou no 1R11; 2 pontos de dados válidos para cada 150-200 videoclipes gravados. Por outro lado, um erro ainda mais grave é uma configuração de sensibilidade baixa, o que pode perder dados de chave. É crucial para configurar todas as câmeras de vídeo da mesma forma, caso contrário, os erros de amostragem podem distorcer os resultados. Resumo da experiência Quatro bondade replicados de testes de ajuste encontrados três proporções de grupo que desviou significativamente de azar, e uma proporção global não significativo (ver Tabela 3 e Figura 5). (1) Padrão é importante: uma preferência significativa para a radial central sobre o padrão centro-concêntrica foi encontrado (ver Tabela 3). (2) Posição do padrão radial é menos importante: a apresentação da combinação centro-radial e radial periférica não mostrou nenhuma diferença significativa do acaso. (3) A-radial central e periférico combinação-concêntrica resultou numa forte preferência em direçãoé o padrão centro-radial. A combinação centro-concêntrica e periférica radial provocada preferência significativa para o padrão periférico-radial. Padrão superou localização. As diferenças individuais eram não-significativa em todas as quatro combinações (ver Tabela 3). <img alt="A Figura 5" src="/files/ftp_upload/52033/52033fig5highres.jpg"/> . Figura 5. Resultados de vídeo sensível ao movimento freqüências escolha em quatro combinações diferentes da flor no Experimento 2. Os resultados mostram a importância do tipo de padrão ao longo do padrão de posicionamento: padrões radiais foram preferidos, mesmo que os padrões foram posicionados perifericamente. Os valores indicam o número de escolhas do padrão exibido. Os asteriscos indicam uma proporção escolha que é significativamente diferente do acaso. Nota. ** P &lt;0,01, *** p &lt;0,001. Esta figura foi modificada de Orbán 11. <table border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Condições </td><td> Sessão 1 </td><td colspan="2"> Sessão 2 </td><td colspan="2"> Sessão 3 </td></tr><tr><td> Colônia 1 </td><td> Colônia 2 </td><td> Colônia 3 </td><td> Colônia 4 </td><td> Colony 5 </td></tr><tr><td> Número de Trabalhadores </td><td> 45 </td><td> 7 </td><td> 2 </td><td> 8 </td><td> 23 </td></tr><tr><td> Nº de escolhas </td><td> 151 </td><td> 25 </td><td> 2 </td><td> 20 </td><td> 65 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Estatística descritiva de dados de vídeo Motion-Sensitive. Número total de escolhas registrados para as flores artificiais no Experimento 2 para cada colônia, eo número de trabalhadores que fazem essas escolhas. Este quadro foi modificado a partir Orbán et al. 11. Por favor, consulte o manuscritopara maiores detalhes. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> Condições </td><td colspan="3"> Agrupada </td><td colspan="3"> Heterogeneidade </td></tr><tr><td> Gp </td><td> df </td><td> p </td><td> Gh </td><td> df </td><td> p </td></tr><tr><td> Centro-Radial vs Central-concêntrico </td><td> 17.98 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 40.72 </td><td> 29 </td><td> 0,073 </td></tr><tr><td> Centro-Radial vs periférica Radial </td><td> 1.85 </td><td> 1 </td><td> 0,173 </td><td> 53.63 </td><td> 39 </td><td> 0.060 </td></tr><tr><td> Periférica Radial vs Central concêntrico </td><td> 6.57 </td><td> 1 </td><td> 0,010 </td><td> 26.31 </td><td> 27 </td><td> 0.500 </td></tr><tr><td> Central Radial vs periférica concêntrico </td><td> 18.18 </td><td> 1 </td><td> 0.000 </td><td> 41.92 </td><td> 37 </td><td>0,256 </td></tr></tbody></table> Dados de Vídeo Tabela 3. Inferência Estatística Motion-Sensitive. Experimento 2. Este quadro foi modificado a partir Orbán et al. 11. G p refere-se ao desvio significativo de uma parte do grupo do acaso, e G h refere-se aos testes de diferenças individuais ( ou seja, a heterogeneidade). Por favor, consulte o manuscrito para mais detalhes sobre os testes estatísticos.

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Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

This video describes Radio-Frequency Identification (RFID) and motion-sensitive video recording methods to monitor choice behavior by bumblebees.

Radio Frequency Identification and Video Motion-sensível eficiente Automatizar Gravação de unrewarded escolha Comportamento por Zangões

We present two methods for observing bumblebee choice behavior in an enclosed testing space. The first method consists of Radio Frequency Identification ...

radio-frequency-identification-motion-sensitive-video-efficiently

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.9K visualizações.  University of Ottawa. This video describes Radio-Frequency Identification (RFID) and motion-sensitive video recording methods to monitor choice behavior by bumblebees. 

Vídeo: Radio Frequency Identification and Motion-sensitive Video Efficiently Automate Recording of Unrewarded Choice Behavior by Bumblebees

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Único Recordings Sensillum na Insetos Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Neurociência

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. For this protocol the freezing medium used is 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) diluted in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS). Blocks of cortical tissue are transferred to cryovials containing the freezing medium and slowly frozen at -1&deg;C/min in a rate-controlled freezing container. Post-thaw processing and dissociation of frozen tissue blocks consistently produced neuronal-enriched cultures which exhibited rapid neuritic growth during the first 5 days in culture and significant expansion of the neuronal network within 10 days. Immunocytochemical staining with the astrocytic marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and the neuronal marker beta-tubulin class III, revealed high numbers of neurons and astrocytes in the cultures. Generation of neural precursor cell cultures after tissue block dissociation resulted in rapidly expanding neurospheres, which produced large numbers of neurons and astrocytes under differentiating conditions. This simple cryopreservation protocol allows for the rapid, efficient, and inexpensive preservation of cortical brain tissue blocks, which grants increased flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Here, we describe a method for efficient cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly enriched neuronal cultures. This simple protocol provides flexibility for later generation of neuronal, astrocyte, and neuronal precursor cell cultures.

Criopreservação de tecido cortical Blocos de Geração de culturas altamente enriquecido Neuronal

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Large-scale Recording of Neurons by Movable Silicon Probes in Behaving Rodents

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of neurons and circuits requires methods with the spatial selectivity and temporal resolution appropriate for mechanistic analysis of neural ensembles in the behaving animal, i.e. recording of representatively large samples of isolated single neurons. Ensemble monitoring of neuronal activity has progressed remarkably in the past decade in both small and large-brained animals, including human subjects1-11. Multiple-site recording with silicon-based devices are particularly effective because of their scalability, small volume and geometric design.
Here, we describe methods for recording multiple single neurons and local field potential in behaving rodents, using commercially available micro-machined silicon probes with custom-made accessory components. There are two basic options for interfacing silicon probes to preamplifiers: printed circuit boards and flexible cables. Probe supplying companies (<a href="http://www.neuronexustech.com/" >http://www.neuronexustech.com/</a>; <a href="http://www.sbmicrosystems.com/">http://www.sbmicrosystems.com/</a>; <a href="http://www.acreo.se/">http://www.acreo.se/</a>) usually provide the bonding service and deliver probes bonded to printed circuit boards or flexible cables. Here, we describe the implantation of a 4-shank, 32-site probe attached to flexible polyimide cable, and mounted on a movable microdrive. Each step of the probe preparation, microdrive construction and surgery is illustrated so that the end user can easily replicate the process.

We describe methods for large-scale recording of multiple single units and local field potential in behaving rodents with silicon probes. Drive fabrication, probe attachment to the drive and probe implantation processes are illustrated in sufficient details for easy replication.

Em larga escala de gravação de Neurônios por sondas de silicone móveis em Comportando Roedores

A major challenge in neuroscience is linking behavior to the collective activity of neural assemblies. Understanding of input-output relationships of ...

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated. Thus, simultaneous recordings of neuronal activity and behavior are essential to correlate brain activity to behavior. For such behavioral analyses, the fruit fly, Drosophila melanogaster, allows us to incorporate genetically encoded calcium indicators such as GCaMP1, to monitor neuronal activity, and to use sophisticated genetic manipulations for optogenetic or thermogenetic techniques to specifically activate identified neurons2-5. Use of a thermogenetic technique has led us to find critical neurons for feeding behavior (Flood et al., under revision). As a main part of feeding behavior, a Drosophila adult extends its proboscis for feeding6 (proboscis extension response; PER), responding to a sweet stimulus from sensory cells on its proboscis or tarsi. Combining the protocol for PER7 with a calcium imaging technique8 using GCaMP3.01, 9, I have established an experimental system, where we can monitor activity of neurons in the feeding center &#x2013; the suboesophageal ganglion (SOG), simultaneously with behavioral observation of the proboscis. I have designed an apparatus ("Fly brain Live Imaging and Electrophysiology Stage": "FLIES") to accommodate a Drosophila adult, allowing its proboscis to freely move while its brain is exposed to the bath for Ca2+ imaging through a water immersion lens. The FLIES is also appropriate for many types of live experiments on fly brains such as electrophysiological recording or time lapse imaging of synaptic morphology. Because the results from live imaging can be directly correlated with the simultaneous PER behavior, this methodology can provide an excellent experimental system to study information processing of neuronal networks, and how this cellular activity is coupled to plastic processes and memory.

Simultaneous Recording of Calcium Signals from Identified Neurons and Feeding Behavior of Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, extends its proboscis for feeding, responding to a sugar stimulus from its proboscis or tarsus. I have combined observations of the proboscis extension response (PER) with a calcium imaging technique, allowing us to monitor the activity of neurons in the brain, simultaneously with behavioral observation.

De gravação simultânea de sinais de cálcio dos neurônios identificados e comportamento alimentar de Drosophila melanogaster</em

To study neuronal networks in terms of their function in behavior, we must analyze how neurons operate when each behavioral pattern is generated.  Thus, ...

Vertical T-maze Choice Assay for Arthropod Response to Odorants

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, various technologies are being developed as control tools. A subset of these tools focuses on modifying the behavior of arthropods by attraction or repulsion. Therefore, arthropods are often the focus of behavioral investigations. Various tools have been developed to measure arthropod behavior, including wind tunnels, flight mills, servospheres, and various types of olfactometers. The purpose of these tools is to measure insect or arachnid response to visual or more often olfactory cues. The vertical T-maze oflactometer described here measures choices performed by insects in response to attractants or repellents. It is a high throughput assay device that takes advantage of the positive phototaxis (attraction to light) and negative geotaxis (tendency to walk or fly upward) exhibited by many arthropods. The olfactometer consists of a 30 cm glass tube that is divided in half with a Teflon strip forming a T-maze. Each half serves as an arm of the olfactometer enabling the test subjects to make a choice between two potential odor fields in assays involving attractants. In assays involving repellents, lack of normal response to known attractants can also be measured as a third variable.

A vertical, T-maze olfactometer is described for assaying the behavioral response of arthropods. The olfactometer allows the experimenter to measure choices performed by test subjects when subjected to two potential odor fields. Both attraction to and repulsion from odorants can be measured with this device.

Ensaio Escolha Vertical labirinto em T para a resposta de Artrópodes para odores

Given the economic importance of insects and arachnids as pests of agricultural crops, urban environments or as vectors of plant and human diseases, ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Medindo Spinal pré-sináptica Inibição em Ratos por raiz dorsal Gravação Potencial<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Um Processo de Implantação de uma Câmara Spinal para Longitudinal<em&gt; In Vivo</em&gt; Criação de Imagens do Cordão do rato Spinal

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Quantifying Fish Swimming Behavior in Response to Acute Exposure of Aqueous Copper Using Computer Assisted Video and Digital Image Analysis

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.

Measuring the impacts of environmental contaminants on fish behavior is often subjective and challenging particularly when dealing with sublethal endpoints. We describe methods including video technology to quantify swimming behavior of early life stage white sturgeon (Acipenser transmontanus) during and after 96 hr acute exposures to various concentrations of copper.

Quantificar Peixe Natação comportamento em resposta à exposição aguda de Aqueous Copper Usando Computer Assisted Vídeo e Análise de Imagem Digital

Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction.  ...

Insect-machine Hybrid System: Remote Radio Control of a Freely Flying Beetle (Mercynorrhina torquata)

The rise of radio-enabled digital electronic devices has prompted the use of small wireless neuromuscular recorders and stimulators for studying in-flight insect behavior. This technology enables the development of an insect-machine hybrid system using a living insect platform described in this protocol. Moreover, this protocol presents the system configuration and free flight experimental procedures for evaluating the function of the flight muscles in an untethered insect. For demonstration, we targeted the third axillary sclerite (3Ax) muscle to control and achieve left or right turning of a flying beetle. A thin silver wire electrode was implanted on the 3Ax muscle on each side of the beetle. These were connected to the outputs of a wireless backpack (i.e., a neuromuscular electrical stimulator) mounted on the pronotum of the beetle. The muscle was stimulated in free flight by alternating the stimulation side (left or right) or varying the stimulation frequency. The beetle turned to the ipsilateral side when the muscle was stimulated and exhibited a graded response to an increasing frequency. The implantation process and volume calibration of the 3 dimensional motion capture camera system need to be carried out with care to avoid damaging the muscle and losing track of the marker, respectively. This method is highly beneficial to study insect flight, as it helps to reveal the functions of the flight muscle of interest in free flight.

Insect-machine Hybrid System: Remote Radio Control of a Freely Flying Beetle Mercynorrhina torquata

This protocol describes the process of constructing an insect-machine hybrid system and carrying out wireless electrical stimulation of the flight muscles required to control the turning motion of a flying insect.

Insect-máquina Sistema Híbrido: Controle de rádio remoto de um Beetle Livremente Aeronáutica (<em&gt; Torquata Mercynorrhina</em&gt;)

The rise of radio-enabled digital electronic devices has prompted the use of small wireless neuromuscular recorders and stimulators for studying in-flight ...

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their worlds when trying to understand their behavior and ecology. Sensitivity to the ultraviolet spectrum (UV; 300 - 400 nm) is found across multiple genera of birds, fish, reptiles, amphibians, and even mammals. This protocol describes a technique for examining organisms for the presence of UV-reflecting structures and a method for testing whether these cues are used as social signals in the context of mate choice. A spectrophotometer is used to detect the presence of UV reflectance and variation in reflective intensity between individuals and sexes. An example of this technique is presented in which a dichotomous mate choice test exposes sexually receptive individuals to opposite sex individuals whose visual appearance can be manipulated by filters that either transmit full spectrum or block UV wavelengths. This system allowed for the determination that female, but not male, sailfin mollies (Poecilia latipinna) were using UV markings as part of their mating decisions. These types of studies serve to expand our knowledge of the range of organisms that utilize UV and provide insight into how UV plays a role in their lives.

Assays to Detect UV-reflecting Structures and Determine their Importance in Mate Preference using the Sailfin Molly Poecilia latipinna

This protocol outlines the use of spectrophotometry to detect ultraviolet-reflecting structures on organisms (in this example, the sailfin molly Poecilia latipinna) and describes dichotomous choice tests for fish that allow inferences to be made on the role of ultraviolet cues during mate selection.

Ensaios para detectar estruturas de reflexão de UV e determinar a sua importância na preferência do companheiro usando o Sailfin Molly<em&gt; Poecilia latipinna</em

Many organisms use cues and signals beyond human sensitivity during social interactions. It is important to take into account how organisms perceive their ...