A significância do protocolo depende da membrana para a sinalização do núcleo e não afeta diretamente o genoma, como é o caso das células-tronco pluripotentes induzidas. A natureza não teratogênica das células-tronco pluripotentes derivadas do sangue é a principal vantagem da técnica, tornando-a adequada para aplicação clínica segura em vários campos da medicina regenerativa. Anne-Kathrin Schott, líder do projeto, e Oksana Greenacre, assistente de laboratório do meu laboratório.
Para isolar os PBMNCs, adicione 25 mililitros de sangue de um para um diluídos com PBS a 10 mililitros de mídia gradiente de densidade e centrifugar a mistura a 300 vezes G por 30 minutos. Isole a camada de interface entre o plasma e a mídia gradiente de densidade por pipetação. Lave as células isoladas com cinco mililitros de PBS estéreis e centrífuga a 300 vezes G durante 10 minutos.
Depois de repetir o procedimento duas vezes, conte o número de células usando uma câmara de contagem. Adicione 6 por 10 às células mononucleares ao tubo de 15 mililitros e, em seguida, realize a ligação cruzada de anticorpos de anticorpos específicos da membrana ligada ao GPI humano às células em PBS com 1%BSA e incubando por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a ligação cruzada, substitua o meio de incubação pelo Meio De Dulbecco Modificado da Iscove complementado com 10% de FBS.
Cresça as células em tubos de poliestireno de 15 mililitros colocando-as em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 8 a 10 dias sem tremer. No quinto dia, adicione um adicional de um a dois mililitros do Meio iscove complementado com 10% de FBS a cada tubo de 15 mililitros. Conte as células cultivadas com uma câmara de contagem.
Em seguida, centrifugar a suspensão celular de aproximadamente 5 por 10 para as 6 células a 300 vezes G por 10 minutos e aspirar o supernante resultante com uma pipeta Pasteur estéril. Resuspenja a pelota celular em 90 microliters de PBS pré-resfriado de pH 7.2 com 0,5%BSA e dois milimôlares EDTA. Em seguida, adicione 80 microliters CD-45 contas magnéticas nano-dimensionadas positivas à suspensão celular e incubar no gelo por 15 minutos.
Para lavar as células, adicione dois mililitros de tampão PBS e centrífuga a 300 vezes G durante 10 minutos. Resuspense as células em 500 microliters de tampão PBS. Lave a coluna com 500 microliters de tampão PBS pré-resfriado e coloque-a no campo magnético.
Coloque a suspensão da célula na coluna e lave-a duas vezes com 500 microliters de tampão PBS. Recolher as células no Meio iscove suplementado com 1%BSA e contar as células na câmara de contagem. Coloque tampas de vidro em placas de quatro poços e cubra-as com um a cinco poli-l-ornitina diluída e água dupla destilada.
Depois de incubar as tampas a 37 graus Celsius por uma hora, lave-as com água destilada dupla. Descongele lentamente de 0,5 a dois miligramas por mililitro de laminina e adicione-o ao topo das manchas. Incuba-os a 37 graus Celsius por duas horas, depois remova o excesso de laminina por pipetação e adicione o meio neuronal N2 aos pratos da cultura.
Cultura CD-45 células negativas derivadas de BD em N2 médio em tampas de vidro revestidas de laminina ornithine por dois dias em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius para iniciar uma diferenciação neuronal de células recém-geradas por BD. Em seguida, as células de cultura em meio de diferenciação neuronal e colocam as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 16 dias. Prepare um fixador com 75 mililitros de água estéril e quatro gramas de paraformaldeído.
Adicione 10 hidróxido de sódio normal conforme necessário com a agitação até que a solução se limpe. Adicione a mistura de sacarose à solução e titule-a ao pH 7.4 com seis ácidos clorídricos normais. Leve o volume para 100 mililitros com água estéril.
Depois de remover a mídia da cultura celular, incuba-a com fixação pré-inaque por 15 minutos, depois descarte o fixador e lave as células três vezes por cinco minutos cada. Adicione imediatamente uma solução triton-X recém-feita de 0,3% e permeabilize as células por cinco minutos. Lave três vezes com PBS e adicione uma solução de bloqueio de PBS e 5%BSA.
Bloqueie as células à temperatura ambiente em uma placa de roqueiro por uma hora. Prepare uma diluição apropriada de anticorpos em 1%BSA PBS e incuba as células com os anticorpos em uma placa de roqueiro por 1,5 horas à temperatura ambiente. Lave as células três vezes com PBS por cinco minutos por lavagem.
Incubar as células com DAPI e montar as tampas com mídia de montagem para visualização em um microscópio. O aspecto morfológico das células dediferentes da BD foi estudado nos dias um, cinco e dez, mostrando uma tendência de desaparecimento gradual de células não ativadas e uma nova população crescente de células na cultura ativada. As células dediferentes de BD eram pequenas e mostravam as características de células agranulares imaturas com menos organelas e grandes núcleos com cromatina condensada semelhante às ESCs.
As células foram estudadas para a reeferição neuro após a cultura revestida de laminina por 30 dias. Em quatro dias, as primeiras células neuronais com estruturas de ramificação longas poderiam ser detectadas. A maioria das pequenas células esféricas desenvolveu-se em células ramificadas com formas alongadas maiores, implicando um processo ativo para diferenciação das linhagens neuronais.
O corpo celular e os processos das células apresentaram maior complexidade do que as células indiferenciadas, apresentando uma alta densidade de tiquelum endoplasmático áspero e feixes de filamentos de actina. As células crescendo em meios de diferenciação frequentemente estabeleceram contatos célula-célula envolvendo o corpo celular, enquanto outras envolviam processos celulares de forma semelhante à neurita. A análise imunoquímica realizada por anticorpos específicos confirmou que as células dediferentes da DB são capazes de se diferenciar em várias linhagens neuronais, incluindo osstrócitos GFAP.
Essa técnica possibilita a criação de células não teratogênicas autólogas capazes de se diferenciar em células das três camadas de germes, abrindo nova oportunidade na pesquisa de medicina regenerativa.
