Alguns detalhes deste protocolo foram otimizados com a assistência do Dr. Adam Dobson, que também forneceram comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Fundação para o National Institutes of Health (FNIH) número de concessão R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD, e AED). FNIH número de concessão 1F32GM099374-01 (PDN) e da Universidade Brigham Young fundos de inicialização (JMC, MLK, MV). Os custos de publicação foram apoiadas pela Academia Brigham Young University de Ciências da Vida e do Departamento de plantas e animais selvagens Sciences.

1. Cultura das bactérias (Start ~ 1 semana antes da colheita dos ovos) <ol><li> Prepare MRS modificado 20 (RMM) placas e tubos de caldo (Tabela 1). Introduzir 20 ml de agar RMM em cada placa de Petri de 100 mm e deixe esfriar / secar durante a noite, ou 5 ml Mmrs caldo para 18 tubos de ensaio mm. </li><li> Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis, e L. plantarum na RMM placas de agar. Incubar durante a noite a Acetobacter 30 ° C. Incubar Lactobacillus anaeróbia, colocando as placas em um recipiente hermético e inundações com dióxido de carbono antes de selar. Incubar a 30 ° C durante a noite. Nota: L. colónias brevis pode não ser visível até 24-48 h. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C e as colónias pode ser usado durante até 3 semanas. </li><li> Dois ou três dias antes de transferir os ovos dechorionated à dieta estéril (seção 5), escolher uma única colónia da placa RMM em um con tubo de ensaioRMM Taining caldo. Acetobacter crescer com agitação e crescer Lactobacillus estaticamente durante 24 horas ou até turva, tanto a 30 ° C. </li></ol> 2. Prepare estéril Diet <ol><li> Prepare dieta estéril (Tabela 2) num balão Erlenmeyer de 2 L. Microondas A dieta até que tenha fervido 3 vezes sequenciais; misturar entre cada fervura. </li><li> Colocar o balão sobre uma placa de agitação para manter a agitação durante a transferência de dieta para tubos de centrífuga cónicos. Transferir 7,5 ml de dieta para 50 ml tubos de centrífuga. Vagamente tampar os tubos, e coloque em uma cremalheira de polipropileno coberto, autoclave. </li><li> Esterilizar dieta mosca utilizando um autoclave a 121 ° C e 15 psi durante 25 min. Retire prateleiras de autoclave, e agitar imediatamente cada rack horizontal para garantir a dieta não separar durante o resfriamento. Tenha cuidado para não apertar as prateleiras verticalmente para evitar a transferência de dieta para a tampa ou bordas dos tubos. Permitir que a dieta arrefecer num agitador durante exactamente 45 min enovamente agitar a dieta horizontalmente com a mão. Nota: A dieta pode ser armazenada a 4-15 ° C durante até uma semana. </li><li> Como uma alternativa ao uso de racks de autoclaváveis ​​cobertos (passos 2,1-2,3), ou para levantar as moscas com dietas contendo conservante ácido, execute os seguintes passos: <ol><li> Prepare 1 L dieta líquida num frasco de 2 L com uma barra de agitação no frasco. Autoclave a dieta. </li><li> Após autoclavagem, adicione 10 ml conservante e mexa continuamente numa placa de agitação aquecida. Quando o agar foi arrefecida a 50-60 ° C, mover o balão para uma placa de agitação aquecida numa cabine de segurança biológica e manter a temperatura do balão de aquecimento a 50-60 ° C. </li><li> Na cabine de segurança biológica, pipeta ~ 7,5 ml individualmente em tubos cônicos. </li></ol></li></ol> 3. Prepare gaiolas de postura <ol><li> Fazer placas de agar de sumo de uva por microondas a 100 ml de água, 10 g de levedura de cerveja, 10 g de glucose, e 1 g de ágar. Leve para ferver 3 vezes no passo 1.1 e adicione 10 g de uvas congeladas suco de concentrate para aumentar a visibilidade dos ovos na placa de agar. </li><li> Quando agar foi arrefecida a 55 ° C, verter em 20 ml de 100 mm de placas de Petri e deixa-se solidificar. </li><li> Cobrir a superfície das placas de agar com uma pasta de levedura por mistura de 1 g de levedura de cerveja com 15 g de água. Pour pasta de levedura sobre a placa de agar para garantir que a superfície é coberta, em seguida, deitar fora o excesso, deixando um resíduo de levedura fina atrás. Se forem utilizadas múltiplas placas, a pasta pode ser sequencialmente vertida para múltiplas placas. </li><li> Transferir placas de agar na parte inferior de uma gaiola. Nota: Um recipiente deli 32 oz é um bom substituto para gaiolas mosca acrílico. <ol><li> Faça tampas para recipientes deli 32 oz cortando um furo na parte superior e colando uma malha respirável sobre o buraco com cola não tóxica. Se a cola é solúvel em água prevenir a exposição a água para a tampa. </li></ol></li><li> Transferência 200-300 voa dentro do recipiente e cobrir com tampa. Cobrir o buraco protegido de malha com uma tampa vazio placa de Petri para Prevent evaporação a partir da superfície do agar e adicionar um papel de tecido húmido no interior da tampa, se desejado. Incubar as moscas a 25 ° C durante a noite durante 16-20 horas. </li></ol> 4. recolher ovos <ol><li> Prepara-se uma peneira para a recolha de ovos, colocando uma malha de nylon para o casquilho de plástico. </li><li> Para recuperar o prato com ovos nele, remova moscas da gaiola, transferindo para um recipiente vazio. Se mesmas moscas será utilizado no dia seguinte, transferir imediatamente para uma nova gaiola contendo uma placa de agar de uva recém-sumo fermentado. As moscas podem ser utilizadas para 3-5 dias sequenciais </li><li> Remover moscas mortas do agar com um pincel limpo, tomando cuidado para não quebrar o agar. </li><li> Recolhe ovos por lavagem da placa de agar com água destilada, escovando levemente os ovos a partir da superfície do agar, e vertendo a suspensão sobre a malha. Repetir 3-4 vezes até que todo ou a maioria dos ovos foram retirados da placa de agar. </li></ol> 5. Dechorionate Ovos e Transferência para estéril Diet <ol><li> Prepara-se o cabine de segurança biológica por pulverização do interior (incluindo os lados) com 70% de etanol. Limpe o fundo com um tecido laboratório, e esterilizar o capô com luz UV para ~ 15 min. Esterilizar todos os suprimentos não-biológicos (copos de amostra, pincel, fórceps, recipiente de resíduos, a 400 ml de água esterilizada, e 100 ml de 0,6% de hipoclorito de sódio) por pulverização com etanol e imediatamente colocar na cabine de segurança biológica. Esterilizar com luz UV durante 15 min. </li><li> Inicie o primeiro de 2 lavagens de hipoclorito de sódio, colocando a bucha com os ovos em um copo de 120 ml de amostra ou outro recipiente estéril. Lentamente, deitar ~ 90 ml de solução de hipoclorito de sódio a 0,6% para o casquilho até pouco abaixo do rebordo. </li><li> Lavar ovos para 2,5 min. Periodicamente re-suspender os ovos utilizando uma pinça para mover o casquilho cima e para baixo na solução de hipoclorito. </li><li> Transfira a bucha diretamente em um segundo copo espécime, pré-carregada com 90 ml de lixívia, no interior da cabine de segurança biológica. </li><li> RepetirPasso 5.3 dentro da cabine de segurança biológica. No final do segundo tratamento de branqueamento, os ovos devem começar a aderir aos lados da bucha. </li><li> Realizar os passos 5,7-5,8 na cabine de segurança biológica. </li><li> Descarte a lixívia e lavar a bucha com água estéril 3 vezes. Re-suspender os ovos várias vezes durante cada lavagem, movendo a bucha com uma pinça. No final da terceira lavagem mais ovos devem ser ligado ao lado da bucha. </li><li> Usando um pincel esterilizado em etanol, transferir os ovos a partir do lado da bucha para a dieta estéril. Transferir os ovos individualmente ou em pequenos lotes. Objectivo para 30-50 ovos por frasco. Deixar as tampas soltas para permitir que o oxigênio para entrar no tubo. Se frascos devem permanecer axênico, transferir para uma incubadora de insetos; de outra forma, adicionar bactérias como abaixo. </li></ol> 6. Faça gnotobióticos Moscas Usando 4 espécies bacterianas <ol><li> Prepare bactérias <ol><li> Prepare uma cabine de segurança biológica esterilizados com suprimentos necessários (pipettes, caixas de ponta da pipeta, tubos de centrífuga esterilizados, caldo MRS, e racks tubo de ensaio) como no passo 4.1. Limpe a parte externa de tubos de ensaio com um laboratório encharcada de etanol limpe antes de colocar no gabinete de biossegurança. </li><li> Sedimentar as bactérias, em primeiro lugar a transferência de 500 ul de crescimento durante a noite para um tubo de microcentrífuga estéril. Se a densidade bacteriana é baixa, adiciona-se 1,5 ml a cada tubo sequencialmente ou remover o sobrenadante e adicionar cultura extra para o mesmo tubo. Retirar amostras a partir da cabine de segurança biológica e centrifugar durante 10 min a 10.000 x g. Use pontas com filtro para evitar a contaminação entre amostras. </li><li> Determinar a densidade de cada cultura por medição OD 600. Se utilizando um leitor de placa de multi-poços, transferir 200 ul de cada cultura para uma placa de 96 poços em 1-, 2-, 4- e diluições. </li><li> Determinar a quantidade de RMM em que para diluir cada sedimento celular (5.2.2) utilizando um espectrofotómetro de leitura de placas e as seguintes equações. Planejamos adicionar caldo suficiente para inocular 50 &amp;# 956; l a cada frasco mosca. <ol><li> Recolhe OD 600 leituras para uma mistura 1: 1, 1: 2 e 1: 4 de diluição de cada cultura bacteriana num espectrofotómetro de leitura de placas. Selecione a diluição para cada estirpe bacteriana que produz um 600 valor OD entre 0,1 e 0,2 e usar esse valor e seu fator de diluição correspondente como &#39;O&#39; e &#39;D&#39; na fórmula indicada no 6.1.4.2 ou 6.1.4.3. </li><li> Se estiver usando as 4 espécies descritas aqui, normalizar as células a colónia equivalente unidade de formação (UFC) / ml densidades (OD 600 a conversão CFU previamente determinado 20) usando esta equação: E = ((OB) x V x D) / C onde E = volume para ressuspender sedimento em (l), O = OD 600 bactérias, B = OD 600 mídia em branco, D = fold-diluição, V = cultura bacteriana ul antes da centrifugação, C = OD 600 de constante predeterminado. Veja arquivo de código suplementar para exemplos de cálculos usando estas equações. para espectrofotômetros que automaticamente em branco, use &quot;O&quot; no lugar de &quot;OB&quot;. Nota: As constantes predeterminadas (600 unidades OD, normalizadas para 10 7 UFC ml-1, constantes derivadas em 20) são como se segue: A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077). </li><li> Se utilizar outras espécies de bactérias (sem CFU / OD 600 constante está disponível), normalizar a densidade de DO600 = 0,1 usando esta equação: E = ((OB) x V x D) /0.1 OD 600 Nota: As unidades são as mesmas como no passo 6.1.4.2. Veja arquivo de código suplementar para exemplos de cálculos usando estas equações. </li></ol></li><li> Na cabine de segurança biológica, remover o sobrenadante com uma ponta de pipeta e ressuspender o sedimento em Mmrs frescas ou PBS como calculado no passo 6.1.4.2. </li></ol></li><li> inocular bactérias <ol><li> Transferir 50 uL das bactérias aos tubos cónicos com uma dieta estérild dechorionated ovos em cabine de segurança biológica. Adicionar bactérias após a transferência de ovos para evitar a contaminação entre frascos. </li><li> Colocar os tubos inoculados numa incubadora a 25 ° C. </li></ol></li></ol> 7. Medida CFU Load / controlo de esterilidade <ol><li> Para medir a carga de CFU em homogeneizados de todo o corpo da mosca, transferência de 5 moscas (5-7 dias após a eclosão) para um tubo de 1,7 ml de microcentrífuga contendo 125 ul de contas de cerâmica e 125 mL de caldo de RMM. Homogeneizar moscas usando um homogeneizador de tecidos durante 30 segundos a 4,0 m / seg. <ol><li> Como alternativa, omitir contas e mão homogeneizar em microtubos com pilões plástico para 1 min. </li><li> Se a quantificação da microbiota intestinal, a superfície esterilizar as moscas para remover micróbios exógenos 22. Transferência de moscas para um tubo de microcentrifugadora contendo 100 ul de etanol a 70% durante 1 minuto, aspirar o etanol, e transferir para um novo tubo de microcentrífuga para homogeneizações. Se o teor de ADN do intestino irá ser medido, lavar fou 1 min com 0,6% de hipoclorito de sódio antes da lavagem com etanol. </li></ol></li><li> Dilui-se o homogeneizado com 875 ul, RMM vortex durante 5 segundos, e pipetar com 120 ul de homogeneizado para a primeira cavidade de uma placa de microtitulação. </li><li> Realizar dois seqüenciais 1: 8 diluições utilizando 10 homogeneizado ul e 70 ul MRS nos próximos dois poços. <ol><li> Retirar 10 jul do primeiro poço e adicioná-lo para o segundo poço contendo 70 ul MRS. Misturar os conteúdos do segundo poço completamente, a transferência de 10 uL de o segundo poço para os terceiros poços contendo 70 ul MRS, e homogeneiza-se. Isto leva a 3 concentrações totais do original homogenato 1000 ul: não diluído, 1: 8 e 1:64. </li></ol></li><li> Transferir 10 uL de cada diluição a uma placa de RMM (utilizando uma pipeta multi-canal, se desejado). Ligeiramente inclinar o prato de diluição para espalhar a alguns milímetros abaixo da superfície de agar e permitir que o líquido a secar antes de mover a placa. O líquido seca sobre the rapidamente placa se as placas a 2 dias de idade, reduzir a mistura de duas gotas de vizinhos. </li><li> Incubar a 30 ° C durante 1-2 dias. Remover as placas da incubadora, uma vez distintos, colónias individuais são visíveis, e contar a partir de uma diluição com 10-100 colônias isoladas. </li><li> Calcular CFU por mosca, utilizando a equação E = C x D / P x V / F, em que E = CFU por mosca, C = número de colónias contadas, D = diluição, P = ul chapeado, V = volume do homogenato de mosca, e F = número de moscas homogeneizados. </li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+resident+microbiota+on+the+nutritional+phenotype+of+Drosophila+melanogaster.">Impact of the resident microbiota on the nutritional phenotype of Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 7 (5), e36765 (2012).</li><li>Newell, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+function+and+comparative+genomic+analyses+of+the+Drosophila+gut+microbiota+identify+candidate+symbiosis+factors.">In vivo function and comparative genomic analyses of the Drosophila gut microbiota identify candidate symbiosis factors.</a> Front Microbiol. 5, 576 (2014).</li><li>Dewhirst, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+of+the+defined+murine+microbiota:+altered+Schaedler+flora.">Phylogeny of the defined murine microbiota: altered Schaedler flora.</a> Appl Environ Microbiol. 65 (8), 3287-3292 (1999).</li><li>Min, K. T., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia,+normally+a+symbiont+of+Drosophila,+can+be+virulent,+causing+degeneration+and+early+death.">Wolbachia, normally a symbiont of Drosophila, can be virulent, causing degeneration and early death.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (20), 10792-10796 (1997).</li></ol>

Os autores não têm nada para revelar.

<html> O método descrito aqui é uma das várias abordagens para embrião dechorionation 8,11,18,25,26,27, juntamente com métodos alternativos de criação de moscas axênicas, incluindo a transferência de série dos adultos axênicas 18,27 ou tratamento antibiótico 13,18. Outros métodos incluem dechorionation lavagens de etanol e reduzir ou estender 11,25,26 8 tratamento de hipoclorito. Diferentes etapas de lavagem pode auxiliar criação de diferentes genótip...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/54219/rearing-fruit-fly-drosophila-melanogaster-under-axenic-gnotobiotic">Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions</a>. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation: 
E = ((O-B) x V x D)/C 
where E = volume to resuspend pellet in (&#956;l), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = &#181;l bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use &#34;O&#34; in place of &#34;O-B&#34;. 
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation: 
E = ((O-B) x V x D)/C 
where E = volume to resuspend pellet in (&#956;l), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = &#181;l bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use &#34;O&#34; in place of &#34;O-B&#34;. 
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).

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Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A maioria dos animais estão intimamente associados com bactérias ( &#39;microbiota&#39;) desde o nascimento até a morte 1. Comparações de ( &quot;convencional&quot;) animais livres de microrganismos ( &#39;axênico&#39;) e associada a microorganismos têm demonstrado micróbios influenciar diversos aspectos da saúde animal, incluindo metabólica, nutricional, vascular, hepática, respiratória, imunológicos, endócrino e função neurológica 2. A mosca da fruta Drosophila melanogaster é um modelo fundamental para a compreensão de muitos desses processos na presença de micróbios 3,4 e para o estudo da influência microbiota em 5,6 a saúde animal. Nenhuma espécie bacteriana está presente em cada indivíduo ( &#39;core&#39;), mas Acetobacter e Lactobacillus espécies numericamente dominar a microbiota de ambos D. pego wild-criados em laboratório e melanogaster. Outros Acetobacteraceae (incluindo Komagataeibacter e Gluconobacter), Firmicútis (tais como Enterococcus e Leuconostoc) e Enterobacteriaceae ou são frequentemente presentes em indivíduos de Drosophila em baixa abundância, ou irregularmente presente em grande abundância 7-12. A microbiota de Drosophila e mamíferos é inconstante dentro e entre gerações 14,19. Microbiota inconstância pode levar ao ruído fenotípica ao medir traços dependente da microbiota. Por exemplo, o armazenamento Acetobacteraceae influência lipídico (triglicéridos) em Drosophila 15-18. Se Acetobacteraceae são mais abundantes em moscas de um frasco do que nos outros 19, moscas isogênicos podem ter diferentes fenótipos 20. Uma solução para o problema da inconstância microbiota em camundongos 14 tem sido na prática desde 1960, através da introdução de uma comunidade definida de 8 espécies microbianas dominantes para filhotes de rato cada nova geração (alterada SCHAEDLER flora),garantindo que cada filhote está exposto aos mesmos membros-chave da microbiota mouse. Esta prática controla a composição da microbiota, mesmo quando a microbiota não é o alvo primário do estudo 32, e define precedente para assegurar a presença de micróbios chave numa variedade de condições experimentais. Para definir a influência de micróbios em Drosophila nutrição, vários protocolos para derivar linhas mosca axênicas têm sido desenvolvidos, incluindo dechorionation hipoclorito de embriões (derivada quer de novo cada geração ou mantida generationally por transferência para uma alimentação esterilizada) e 13 tratamento com antibióticos. Há benefícios para diferentes abordagens, tais como a facilidade e rapidez para os dois tratamentos antibióticos e transferência de série, contra um maior controle de variáveis ​​de confusão com de novo dechorionation (por exemplo, densidade de ovos, micróbios contaminantes residuais, longe do alvo efeitos antibióticos). Independentemente do método depreparação, a introdução de espécies microbianas especificados para axênicas embriões permite cultura de Drosophila com as comunidades ( &#39;gnotobióticos&#39;) definidas. Alternativamente, imitando o uso de flora SCHAEDLER, esta comunidade poderia ser inoculado aos ovos convencionalmente-estabelecidas (seguindo os passos 6-7 somente) para assegurar a presença de micróbios que influenciam a característica em cada frasco e evitar complicações da inconstância microbiota. Aqui descrevemos o protocolo para elevar e gnotobiótico axénica de Drosophila por dechorionation de novo de embriões e para a confirmação da presença dos taxa microbiana introduzido ou contaminantes.

<table><tbody><tr><td>Brewer&#039;s Yeast</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>903312</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158968-3KG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher--Lab Scientific</td><td>fly802010</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177</td></tr><tr><td>Welch&#039;s 100% Grape Juice Concentrate</td><td>Walmart or other grocery store</td><td>9116196</td><td>http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406</td></tr><tr><td>Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container</td><td>Webstaurant Store</td><td>999L5032Y</td><td>http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html</td></tr><tr><td>Translucent Round Deli Container Lid</td><td>Webstaurant Store</td><td>999YNL500</td><td>http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html</td></tr><tr><td>Stock Bottles</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130</td></tr><tr><td>Droso-Plugs</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-101</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101</td></tr><tr><td>Nylon Mesh</td><td>Genesee Scientific</td><td>57-102&amp;nbsp;</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102</td></tr><tr><td>Plastic Bushing</td><td>Home Depot</td><td>100404002</td><td>http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002</td></tr><tr><td>Plastic Bushing Cap</td><td>Home Depot</td><td>100153897</td><td>http://www.homedepot.com/p/1-1-4- in-Rigid-Plastic-Insulated-Bushing-2-Pack-27529/100153897</td></tr><tr><td>Specimen Cup</td><td>MedSupply Partners</td><td>K01-207067</td><td>http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html</td></tr><tr><td>Repeater M4</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html</td></tr><tr><td>50 ml Centrifuge Tubes</td><td>TrueLine Centrifuge Tubes</td><td>TR2003</td><td>https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003</td></tr><tr><td>Food Boxes</td><td>USA Scientific</td><td>2316-5001</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001</td></tr><tr><td>Lysing Matrix D Bulk</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>116540434</td><td>http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&amp;amp;s=Search</td></tr><tr><td>Filter Pipette Tips, 300 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific</td><td>1120-9810</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810</td></tr><tr><td>Petri Dishes</td><td>Laboratory Product Sales</td><td>M089303</td><td>https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, INC.</td><td>2701</td><td>http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88</td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Walmart</td><td>5133</td><td>http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher</td><td>08-882</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693</td></tr><tr><td>Household Bleach (6-8% Hypochlorite)</td><td>Walmart</td><td>550646751</td><td>http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295</td></tr><tr><td>Universal Peptone</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-260</td><td>https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>&amp;nbsp;Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500</td></tr><tr><td>Dipotassium Phosphate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-1KG</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&amp;amp;interface=All&amp;amp;&lt;br/&gt;
N=0&amp;amp;mode=match%20partialmax&amp;amp;lang=&lt;br/&gt;
en&amp;amp;region=US&amp;amp;focus=product</td></tr><tr><td>Ammonium Citrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>25102-500g</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&amp;amp;interface=All&amp;amp;N&lt;br/&gt;
=0&amp;amp;mode=match%20partialmax&amp;amp;lang=&lt;br/&gt;
en&amp;amp;region=US&amp;amp;focus=product</td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>VWR</td><td>97061-994</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500</td></tr><tr><td>Manganese Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10034-96-5</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&amp;amp;interface=CAS%20No.&amp;amp;N=0&amp;amp;mode=match&lt;br/&gt;
%20partialmax&amp;amp;lang=en&amp;amp;region&lt;br/&gt;=US&amp;amp;focus=product</td></tr><tr><td>MRS Powder</td><td>Sigma Aldrich</td><td>69966-500G</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>96 Well Plate Reader</td><td>BioTek (Epoch)&amp;nbsp;</td><td>NA</td><td>http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_&lt;br/&gt;spectrophotometer.html</td></tr><tr><td>1.7 ml Centrifuge Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500</td></tr><tr><td>Filter Pipette Tips, 1,000 &amp;mu;l</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830</td></tr><tr><td>96 Well Plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/&lt;br/&gt;13243/</td></tr><tr><td>Ceramic Beads</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>6540-434</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434</td></tr><tr><td>Tissue Homogenizer</td><td>MP Biomedicals, LLC.</td><td>116004500</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500</td></tr><tr><td>Class 1 BioSafety Cabinet</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>Model 1395</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html</td></tr></tbody></table>

rearing the fruit fly drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Criação bem-sucedida de moscas axênicas é confirmado pelo isolamento de não UFCs de homogeneizações todo o corpo de D. adultos melanogaster (figura 1). Alternativamente, se o homogeneizado chapeado produz colónias, os frascos são contaminada e deve ser descartado. Para gnotobióticos moscas, cada um dos quatro isolados bacterianos foram isolados a partir de misturas de 5 adultos do sexo masculino, demonstrando diferenças em CFUs totais viávei...

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Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

Um método para a criação de Drosophila melanogaster sob condições axénicas e gnotobióticos é apresentada. embriões voam são dechorionated em hipoclorito de sódio, transferidos assepticamente à dieta estéril, e criados em recipientes fechados. Inoculando dieta e embriões com bactérias leva a associações gnotobióticos e presença de bactérias é confirmada por plaqueamento de corpo inteiro de Drosophila homogeneizados.

Elevando a mosca da fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Sob axênicas e gnotobióticos Condições

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

rearing-fruit-fly-drosophila-melanogaster-under-axenic-gnotobiotic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

21.0K visualizações.  Brigham Young University.  Um método para a criação de Drosophila melanogaster sob condições axénicas e gnotobióticos é apresentada. embriões voam são dechorionated em hipoclorito de sódio, transferidos assepticamente à dieta estéril, e criados em recipientes fechados. Inoculando dieta e embriões com bactérias leva a associações gnotobióticos e presença de bactérias é confirmada por plaqueamento de corpo inteiro de Drosophila homogeneizados. 

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A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various intrinsic and extrinsic inhibitory factors involved in the restriction of axon regeneration have been identified. However, simply removing these inhibitory cues is insufficient for successful regeneration, indicating the existence of additional regulatory machinery. Drosophila melanogaster, the fruit fly, shares evolutionarily conserved genes and signaling pathways with vertebrates, including humans. Combining the powerful genetic toolbox of flies with two-photon laser axotomy/dendriotomy, we describe here the Drosophila sensory neuron &#8211; dendritic arborization (da) neuron injury model as a platform for systematically screening for novel regeneration regulators. Briefly, this paradigm includes a) the preparation of larvae, b) lesion induction to dendrite(s) or axon(s) using a two-photon laser, c) live confocal imaging post-injury and d) data analysis. Our model enables highly reproducible injury of single labeled neurons, axons, and dendrites of well-defined neuronal subtypes, in both the peripheral and central nervous system.

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Here, we present a protocol using the Drosophila sensory neuron - dendritic arborization (da) neuron injury model, which combines in vivo live imaging, two-photon laser axotomy/dendriotomy, and the powerful fly genetic toolbox, as a platform for screening potential promoters and inhibitors of neuroregeneration.

Um modelo de lesão in vivo em Drosophila para estudar a neuroregeneração do sistema nervoso periférico e central

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Medicina

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly and raise ethical issues. Unconventional models are notoriously cheap, easy to handle and culture, and do not take much space. They are genetically amenable and possess complete genome sequences, and their use presents no ethical considerations. The fruit fly Drosophila melanogaster, for instance, has provided great insights into a variety of behavior, development, metabolism, and immunity research. More specifically, D. melanogaster adult flies and larvae possess several innate defense reactions that are shared with vertebrate animals. The mechanisms regulating immune responses have been mostly revealed through genetic and molecular studies in the D. melanogaster model. Here a novel larval injection technique is provided, which will further promote investigations of innate immune processes in D. melanogaster larvae and explore the pathogenesis of a wide range of microbial infections.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Drosophila melanogaster adult flies have been extensively utilized as model organisms to investigate the molecular mechanisms underlying host antimicrobial innate immune responses and microbial infection strategies. To promote the D. melanogaster larva stage as an additional or alternative model system, a larval injection technique is described.

Melanogaster drosophila Protocolo de injeção de larvas

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Imunologia e Infecção

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes are controlled by the complex interplay between NSC intrinsic genetic programs with NSC extrinsic factors, local and systemic. In the genetic model organism, Drosophila melanogaster, NSCs, known as neuroblasts (NBs), switch from quiescence to proliferation during the embryonic to larval transition. During this time, larvae emerge from their eggshells and begin crawling, seeking out dietary nutrients. In response to animal feeding, the fat body, an endocrine organ with lipid storage capacity, produces a signal, which is released systemically into the circulating hemolymph. In response to the fat body-derived signal (FBDS), Drosophila insulin-like peptides (Dilps) are produced and released from brain neurosecretory neurons and glia, leading to downstream activation of PI3-kinase growth signaling in NBs and their glial and tracheal niche. Although this is the current model for how NBs switch from quiescence to proliferation, the nature of the FBDS extrinsic cue remains elusive. To better understand how NB extrinsic systemic cues regulate exit from quiescence, a method was developed to culture early larval brains in vitro before animal feeding. With this method, exogenous factors can be supplied to the culture media and NB exit from quiescence assayed. We found that exogenous insulin is sufficient to reactivate NBs from quiescence in whole-brain explants. Because this method is well-suited for large-scale screens, we aim to identify additional extrinsic cues that regulate NB quiescence versus proliferation decisions. Because the genes and pathways that regulate NSC proliferation decisions are evolutionarily conserved, results from this assay could provide insight into improving regenerative therapies in the clinic.

Neural Stem Cell Reactivation in Cultured Drosophila Brain Explants

A method to reactivate quiescent neural stem cells in cultured Drosophila brain explants has been established. Using this method, the role of systemic signals can be uncoupled from tissue-intrinsic signals in the regulation of neural stem cell quiescence, entry and exit.

Reativação de células-tronco neurais em explantes cerebrais de Drosophila cultivadas

Neural stem cells (NSCs) have the ability to proliferate, differentiate, undergo apoptosis, and even enter and exit quiescence. Many of these processes ...

Neurociência

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Manutenção de um<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Gaiola População

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

Biologia

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Protocolo experimental para o uso de drosófila como um sistema modelo invertebrados para testes de toxicidade em laboratório

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic infections, there has been a recent increase of interest in the mechanisms of gut immunocompetence to pathogens, which require methods to orally infect flies. Here we present a protocol to orally expose individual flies to an opportunistic bacterial pathogen (Pseudomonas aeruginosa) and a natural bacterial pathogen of D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). The goal of this protocol is to provide a robust method to expose male and female flies to these pathogens. We provide representative results showing survival phenotypes, microbe loads, and bacterial shedding, which is relevant for the study of heterogeneity in pathogen transmission. Finally, we confirm that Dcy mutants (lacking the protective peritrophic matrix in the gut epithelium) and Relish mutants (lacking a functional immune deficiency (IMD) pathway), show increased susceptibility to bacterial oral infection. This protocol, therefore, describes a robust method to infect flies using the oral route of infection, which can be extended to the study of a variety genetic and environmental sources of variation in gut infection outcomes and bacterial transmission.

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

This protocol describes methods to orally expose and infect the fruit fly Drosophila melanogaster with bacterial pathogens, and to measure the number of infectious bacteria shed following gut infection. We further describe the effect of immune mutants on fly survival following oral bacterial infection.

Infecção bacteriana e oral Shedding em Drosophila melanogaster.

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Simple Homemade Tools to Handle Fruit Flies&#8212;Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in practice, as adult flies fly. Demonstrated here is how to make some simple and cost-effective tools to address difficult issues in the handling of Drosophila. Holes in foam stoppers are made and pipette tips or funnels are inserted into the holes. Flies then move only in one direction into the pipette tip/funnel assemblage, allowing efficient control of the transfer of adult Drosophila into or out of a vial. Existing protocols have been modified for cool-anesthetizing flies by chilling in crushed ice and transferring them onto a cold, hard icepack surface. The icepack is covered with a piece of medical gauze that keeps immobilized flies from the condensed water when examined under a stereomicroscope. The flies are finally euthanized for counting and sorting or discarded by microwaving. A bottle-shaped cage has also been developed for collecting eggs, as well as a labor-saving device and accompanying protocol for cleaning glass culture vials.

Described here is the use of several homemade tools to transfer, chill, and kill adult Drosophila, as well as to clean glass culture vials and collect eggs. These tools are easy to make and are rather efficient in handling Drosophila.

Ferramentas caseiras simples para lidar com moscas de frutas —Drosophila melanogaster

The fruit fly, Drosophila melanogaster, is widely used both in biological research and biology education. Handling adult flies is common but difficult in ...

An Introduction to Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster, also known as the fruit fly, is a powerful model organism widely used in biological research that has made significant contributions to the greater scientific community over the last century. First, this video introduces the fruit fly as an organism, including its physical characteristics, life cycle, environment, and diet. Next, the reasons why fruit flies make an excellent model organism are discussed. For example, fruit flies are inexpensive to maintain in the laboratory, have simplified genetics, and short generation times allow for quick experiments with high sample numbers. Then, key discoveries and important Drosophila researchers, such as Thomas Hunt Morgan are profiled. Finally, applications of Drosophila research, ranging from genetics to cardiac and neurological development and disease, are provided. This video serves as an overview of the highly-important and influential model organism that is Drosophila melanogaster.

Drosophila melanogaster Fruit Fly as a Model Organism

Uma Introdução a Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster, also known as the fruit fly, is a powerful model organism widely used in biological research that has made significant ...

Education

JoVE Science Education

Biologia Básica

Biologia I: levedura, Drosophila e C. elegans

Drosophila Maintenance

Drosophila melanogaster, commonly known as fruit flies, are a frequently used model organism for life science research. Although starting a collection of these critters may seem as easy as leaving a banana on your kitchen counter for too long, a productive fly colony in the lab requires careful husbandry and maintenance.
This video demonstrates the necessary steps for maintaining a healthy fly stock. The overview begins with the preparation and storage of the yeast and sugar-containing media on which flies feed. Next, the vessels most commonly used for housing Drosophila are shown, as well as how and when to move flies between these containers. Finally, the presentation also includes examples of the ways in which housing and feeding conditions are manipulated for biological experiments.

Maintenance and Husbandry of Drosophila melanogaster

Manutenção de Drosophila

Drosophila melanogaster, commonly known as fruit flies, are a frequently used model organism for life science research. Although starting a collection of ...

Drosophila Egg Collection and Dechorionation: A Method to Remove the Outermost Egg Layer

Source: Koyle, M. L., et al. <a href="https://www.jove.com/video/54219/" target="_blank">Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila embryo is surrounded by protective outer membranes. To gain access to the embryo, the chorion&#8211;the outermost of the membranes&#8211;is often removed. This video describes a commonly used method of dechorionation using sodium hypochlorite. The example protocol demonstrates the procedure while employing sterile techniques necessary for axenic or gnotobiotic animal rearing.

drosófila Coleta e descorionação de ovos: um método para remover a camada mais externa do ovo

Source: Koyle, M. L., et al. Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

Elevando a mosca da fruta

Resumo

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