VJ e HS reconhecem apoio de NIH R01 GM094246 a VJ. HS reconhece fundos de arranque do Clemson University Creative Inquérito Programa e do Centro de Materiais Ópticos Ciência e Engenharia de Tecnologias Clemson University. Este projeto foi também apoiado por uma bolsa de treinamento do Centro Keck para Treinamento Interdisciplinar de Biociências dos Consórcios da Costa do Golfo (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) e da Fundação Schissler para Estudos Translacionais de Doenças Humanas Comuns a DD. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.

Todos os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes com o conteúdo deste artigo.

Neste trabalho, apresenta-se o protocolo para alinhar, calibrar e medir distâncias de interdise com alta precisão usando experimentos FRET de molécula única PIE-MFD. Ao calibrar cuidadosamente todos os parâmetros instrumentais, pode-se aumentar a precisão das distâncias medidas e alcançar a precisão de Angstrom. Para isso, são utilizados vários histogramas multidimensionais para analisar e identificar populações para posterior caracterização. Utilizando o tempo macro médio para verificar a estabilidade d...

Um objetivo fundamental dos estudos de biologia estrutural é desvendar a relação entre a estrutura ea função das máquinas biomoleculares. A primeira impressão visual de biomoléculas ( por exemplo, proteínas e ácidos nucleicos) ocorreu na década de 1950 através do desenvolvimento de cristalografia de raios X 1 , 2 . A cristalografia de raios-X fornece informações estruturais estáticas de alta resolução restritas pela embalagem de cristal. Portanto, a imobilidade inerente dos modelos estruturais de raios X evita a natureza dinâmica das biomoléculas, um fator que afeta a maioria das funções biológicas 3 , 4 , 5 . A ressonância magnética nuclear (RMN) 6 , 7 , 8 proporcionou uma solução alternativa ao problema resolvendo modelos estruturais em soluções aquosas. Uma grande vantagemDe RMN é a sua capacidade de recuperar a natureza dinâmica intrínseca de biomoléculas e conjuntos conformacionais, o que ajuda a esclarecer as relações intrínsecas entre estrutura, dinâmica e função 3 , 4 , 5 . No entanto, a RMN, limitada pelo tamanho da amostra e grandes quantidades de amostra, requer estratégias de rotulagem complexas para sistemas maiores. Portanto, há uma necessidade premente de desenvolver métodos alternativos na biologia estrutural. Historicamente, a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) 9 não assumiu um papel importante na biologia estrutural devido ao equívoco de que o FRET fornece medições de distância de baixa precisão. O objetivo deste protocolo é revisar a capacidade do FRET de determinar distâncias na escala nanométrica, de tal forma que essas distâncias possam ser utilizadas na construção de modelos estruturais de biomoléculas. O primeiro verificador experimentalA dependência da dependência de R - 6 com a eficiência de FRET foi feita por Stryer em 196710, medindo poliprolinas de vários comprimentos como uma &quot;régua espectroscópica&quot;. Um experimento semelhante foi realizado no nível de molécula única em 2005 11 . As moléculas de poliprolina revelaram-se não ideais e, assim, as moléculas de DNA de cadeia dupla foram utilizadas mais tarde 12 . Isto abriu a janela para medidas de distância precisas ea idéia de usar FRET para identificar propriedades estruturais de biomoléculas. FRET é óptima quando a distância interdyte varia de ~ 0,6-1,3 R 0 , onde R 0 é a distância de Förster. Para os fluoróforos típicos utilizados em experiências FRET de molécula única, R0 é ~ 50 Å. Tipicamente, FRET oferece muitas vantagens sobre outros métodos na sua capacidade de resolver e diferenciar as estruturas e dinâmicas emHeterogêneos: (i) Devido à sensibilidade final da fluorescência, as experiências FRET de uma única molécula 13 , 14 , 15 , 16 podem resolver conjuntos heterogêneos contando diretamente e caracterizando simultaneamente as estruturas de seus membros individuais. (Ii) Vias de reação complexas podem ser decifradas diretamente em estudos FRET de molécula única, porque não é necessária sincronização de um conjunto. (Iii) FRET pode acessar uma ampla gama de domínios temporais que abrangem mais de 10 décadas no tempo, cobrindo uma ampla variedade de dinâmicas biologicamente relevantes. (Iv) Experiências de FRET podem ser realizadas em quaisquer condições de solução, in vitro e in vivo . A combinação de FRET com microscopia de fluorescência permite o estudo de estruturas moleculares e interações diretamente em células vivas 15 , 16 , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , mesmo com alta precisão 20 . (V) FRET pode ser aplicado a sistemas de praticamente qualquer tamanho ( por exemplo, oligómeros de poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , transcriptase reversa de HIV 26 e ribossomas 27 ). (Vi) Finalmente, uma rede de distâncias que contém toda a dimensionalidade de biomoléculas poderia ser usada para derivar modelos estruturais de moléculas estáticas ou dinâmicas 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . Portanto, a espectroscopia FRET de molécula única pode ser usada para derivar distâncias que são precisas o suficiente para serem usadas para modelagem estrutural restrita à distância 26 . Isto é possível tirando proveito da detecção de fluorescência multiparâmetro 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , que utiliza oito dimensões de informação de fluorescência ( isto é, espectro de excitação, espectro de fluorescência, anisotropia, tempo de vida de fluorescência, rendimento quântico de fluorescência, O tempo macroscópico, as intensidades de fluorescência e a distância entre fluoróforos) para proporcionar precisão e precisão de restrições de distância. Adicionalmente, a excitação intercalada pulsada (PIE) é combinada com MFD(PIE-MFD) 42 para monitorizar a fluorescência do receptor de excitação directo e para seleccionar eventos de molécula única resultantes de amostras contendo uma estequiometria de um dador para um aceitador de 1: 1. Uma configuração PIE-MFD típica usa laser de excitação intercalado de dois impulsos conectado a um corpo de microscópio confocal, onde a detecção de fótons é dividida em quatro canais diferentes em diferentes janelas espectrales e características de polarização. Mais detalhes podem ser encontrados na Figura 1 . É importante notar que o FRET deve ser combinado com métodos computacionais para obter modelos estruturais de tipo atomístico que sejam consistentes com os resultados do FRET 26 , 30 . Não é o objetivo do presente protocolo examinar a metodologia associada para construir modelos estruturais com distâncias derivadas de FRET. No entanto, estas abordagens foram aplicadas em combinação com outras técnicas ( por exemplo, dispersão de raios-X de ângulo pequenoOu ressonância paramagnética eletrônica), dando origem ao campo da biologia estrutural integrativa 43 , 44 , 45 , 46 . O objetivo atual é abrir caminho para a FRET como ferramenta quantitativa na biologia estrutural. Como exemplo, esta metodologia foi utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando (LBD) do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). O objetivo final é superar as limitações acima mencionadas e trazer FRET entre os métodos integradores utilizados para a determinação estrutural de biomoléculas, proporcionando distâncias medidas com alta precisão.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

Apresenta-se aqui um protocolo sobre como realizar medições de distância de interdise de alta precisão usando a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) no nível de molécula única no modo de detecção de fluorescência multiparâmetro (MFD). O MFD maximiza o uso de todas as &quot;dimensões&quot; da fluorescência para reduzir os artefatos fotofísicos e experimentais e permite a medição da distância interdye com uma precisão de até 1 Å em biomoléculas rígidas. Este mï¿½odo foi utilizado para identificar trï¿½ estados conformacionais do domï¿½io de ligaï¿½o ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) para explicar a activaï¿½o do receptor apï¿½ ligaï¿½o ao ligando. Ao comparar as estruturas cristalográficas conhecidas com medidas experimentais, concordaram em menos de 3 Å para biomoléculas mais dinâmicas. Recolher um conjunto de restrições de distância que cobre toda a dimensionalidade das biomoléculas tornaria possível fornecer um modelo estrutural de biomolécula dinâmicaEs.

Em experiências típicas de smFRET utilizando uma configuração MFD (linhas de laser: 485 nm a 60 μW e 640 nm a 23 μW, secção 5.1), a amostra de fluorescência é diluída para uma concentração de baixo-picomolar (10-12M = 1 pM) e colocada Em um microscópio confocal, onde um pulso de laser de sub-nanossegundo excita moléculas marcadas que se difundem livremente através de um volume de excitação. Um volume confocal típico é &lt;4 femtolitros (fL). Em concentrações tão ba...

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Um protocolo para experiências FRET de alta precisão no nível de molécula única é apresentado aqui. Adicionalmente, esta metodologia pode ser utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar distâncias precisas é o primeiro passo para construir modelos estruturais baseados em experimentos FRET.

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

The overall goal of this protocol is to perform high precision inter-dye distance measurements using multi-parameter fluorescence detection of F

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.6K visualizações.  Clemson University. The overall goal of this protocol is to perform high precision inter-dye distance measurements using multi-parameter fluorescence detection of F