VJ e HS riconoscono il supporto da NIH R01 GM094246 a VJ. HS riconosce fondi di start-up dal Clemson University Creative Inquiry Program e dal Centro per le Tecnologie di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ottici presso l&#39;Università Clemson. Questo progetto è stato inoltre sostenuto da una borsa di studio del Centro Keck per l&#39;addestramento di bioscienza interdisciplinare dei Consorzi della Costa del Golfo (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) e dello Schissler Foundation Fellowship for Translational Studies di comuni malattie umane a DD. Il contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Salute.

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti con i contenuti di questo articolo.

In questo lavoro viene presentato il protocollo per allineare, calibrare e misurare le distanze interdite con alta precisione usando esperimenti FRET di una molecola PIE-MFD. Calibrando attentamente tutti i parametri strumentali, è possibile aumentare l&#39;accuratezza delle distanze misurate e raggiungere l&#39;accuratezza di Angstrom. A tal fine vengono utilizzati diversi istogrammi multidimensionali per analizzare e identificare le popolazioni per ulteriori caratterizzazioni. Utilizzando il tempo medio di macro per ...

Un obiettivo fondamentale degli studi di biologia strutturale è quello di svelare il rapporto tra la struttura e la funzione delle macchine biomolecolari. La prima impressione visiva delle biomolecole ( es. Proteine ​​e acidi nucleici) si è verificata negli anni &#39;50 attraverso la cristallografia a raggi X a sviluppo. La cristallografia a raggi X fornisce informazioni strutturali statiche ad alta risoluzione, vincolate dall&#39;imballaggio in cristallo. Pertanto, l&#39;immobilità intrinseca dei modelli strutturali a raggi X evita la natura dinamica delle biomolecole, un fattore che influenza la maggior parte delle funzioni biologiche 3 , 4 , 5 . La risonanza magnetica nucleare (NMR) 6 , 7 , 8 ha fornito una soluzione alternativa al problema risolvendo i modelli strutturali in soluzioni acquose. Un grande vantaggioDi NMR è la sua capacità di recuperare la natura dinamica intrinseca delle biomolecole e degli ensemble conformazionali, che aiuta a chiarire le relazioni intrinseche tra struttura, dinamica e funzione 3 , 4 , 5 . Tuttavia, NMR, limitato per dimensione del campione e grandi quantità di campioni, richiede strategie complesse di etichettatura per i sistemi più grandi. Pertanto, c&#39;è una necessità urgente di sviluppare metodi alternativi nella biologia strutturale. Storicamente, il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) 9 non ha assunto un ruolo importante nella biologia strutturale a causa del malinteso che FRET fornisce misure di distanza a bassa precisione. Lo scopo di questo protocollo è quello di rivedere la capacità di FRET di determinare le distanze sulla scala nanometrica, in modo tale che queste distanze possano essere utilizzate per la costruzione di modelli strutturali di biomolecole. La prima verifica sperimentaleLa dipendenza della R - 6 dall&#39;efficienza FRET è stata fatta da Stryer nel 1967 10 misurando poliproline di varie lunghezze come &quot;righello spettroscopico&quot;. Un esperimento simile è stato raggiunto a livello monomolecolare nel 2005 11 . Le molecole di poliproline risultarono non ideali e quindi le molecole a DNA a doppio filamento sono state successivamente utilizzate 12 . Questo ha aperto la finestra per la misurazione precisa delle distanze e l&#39;idea di utilizzare FRET per identificare le proprietà strutturali delle biomolecole. FRET è ottimale quando la distanza di interdye è da ~ 0.6-1.3 R 0 , dove R 0 è la distanza di Förster. Per i fluorofori tipici utilizzati nei singoli esperimenti di FRET, R 0 è ~ 50 Å. Tipicamente, FRET offre molti vantaggi rispetto ad altri metodi nella sua capacità di risolvere e differenziare le strutture e le dinamicheI sistemi eterogenei: (i) A causa della massima sensibilità della fluorescenza, gli esperimenti FRET a singola molecola 13 , 14 , 15 , 16 possono risolvere complessi eterogene contando direttamente e caratterizzando simultaneamente le strutture dei singoli membri. (Ii) I percorsi complessi di reazione possono essere decifrati direttamente negli studi di FRET mono-molecolari perché non è necessaria alcuna sincronizzazione di un ensemble. (Iii) FRET può accedere a un&#39;ampia gamma di domini temporali che durano più di 10 decenni nel tempo, coprendo un&#39;ampia gamma di dinamica biologicamente rilevanti. Iv) Gli esperimenti FRET possono essere eseguiti in tutte le condizioni di soluzione, sia in vitro sia in vivo . La combinazione di FRET con microscopia a fluorescenza consente lo studio delle strutture molecolari e delle interazioni direttamente nelle cellule viventi 15 , 16 , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , anche con alta precisione 20 . (V) FRET può essere applicato a sistemi di quasi tutte le dimensioni ( ad es. Oligomeri poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , reversi transcriptasi HIV 26 e ribosomi 27 ). Vi) Infine, una rete di distanze che contenga tutta la dimensionalità delle biomolecole potrebbe essere utilizzata per derivare modelli strutturali di molecole statiche o dinamiche 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . Pertanto, la spettroscopia FRET a singola molecola può essere utilizzata per ottenere distanze sufficientemente precise da utilizzare per la modellazione strutturale a distanza 26 . Ciò è possibile sfruttando il rilevamento di fluorescenza multiparametri (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , che utilizza otto dimensioni di informazioni di fluorescenza ( es. Spettro di eccitazione, spettro di fluorescenza, anisotropia, durata della fluorescenza, Tempo macroscopico, intensità della fluorescenza e distanza tra i fluorofori) per fornire precisi e precisi ritratti di distanza. Inoltre, l&#39;eccitazione interpolata pulsata (PIE) è combinata con MFD(PIE-MFD) 42 per monitorare la fluorescenza dell&#39;accettore di eccitazione diretta e per selezionare eventi a singola molecola derivanti da campioni contenenti uno stoichiometria donatore da accettazione a 1: 1. Una tipica configurazione PIE-MFD utilizza laser a eccitazione interpolati a due pulsanti collegati ad un corpo microscopio confocale, dove il rilevamento fotonico è suddiviso in quattro canali diversi in diverse finestre spettrali e nelle caratteristiche di polarizzazione. Ulteriori dettagli possono essere trovati nella Figura 1 . È importante notare che la FRET deve essere combinata con metodi computazionali per ottenere modelli strutturali simili a quelli atomici che sono coerenti con i risultati FRET 26 , 30 . Non è l&#39;obiettivo del presente protocollo di superare la metodologia associata per costruire modelli strutturali con distanze derivate da FRET. Tuttavia, questi approcci sono stati applicati in combinazione con altre tecniche ( ad esempio, dispersione a raggi X a piccole angolazioni)O risonanza paramagnetica dell&#39;elettrone), dando vita al campo della biologia strutturale integrativa 43 , 44 , 45 , 46 . L&#39;obiettivo attuale è quello di aprire la strada a FRET come strumento quantitativo nella biologia strutturale. Ad esempio, questa metodologia è stata usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante-legame (LBD) del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA). Il fine ultimo è quello di superare le limitazioni di cui sopra e di portare FRET tra i metodi integrativi utilizzati per la determinazione strutturale delle biomolecole fornendo distanze misurate con alta precisione.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

Qui viene illustrato un protocollo su come effettuare misure di distanza interdette ad alta precisione utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) a livello di singola molecola nel modo di rilevamento a fluorescenza multiparametrica (MFD). MFD massimizza l&#39;utilizzo di tutte le &quot;dimensioni&quot; della fluorescenza per ridurre gli artefatti fotofisicali e sperimentali e permette di misurare la distanza interdetta con una precisione fino a ~ 1 Å in biomolecole rigide. Questo metodo è stato utilizzato per identificare tre stati conformazionali del dominio ligando-legame del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA) per spiegare l&#39;attivazione del recettore dopo legame legame. Quando si confrontano le strutture cristallografiche note con misure sperimentali, si sono accordati entro meno di 3 Å per biomolecole più dinamiche. Raccogliere un insieme di limitazioni di distanza che copre l&#39;intera dimensionalità delle biomolecole permetterebbe di fornire un modello strutturale di biomoleculo dinamicoes.

Negli esperimenti tipici smFRET che utilizzano una configurazione MFD (linee laser: 485 nm a 60 μW e 640 nm a 23 μW, sezione 5.1), il campione di fluorescenza viene diluito a una concentrazione picomolare bassa ( 10-12 M = 1 pM) In un microscopio confocale, dove un impulso laser sub-nanosecondo eccita molecole etichette che diffondono liberamente attraverso un volume di eccitazione. Un volume confocale tipico è &lt;4 femtolitri (fL). A tali basse concentrazioni, solo una si...

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

The overall goal of this protocol is to perform high precision inter-dye distance measurements using multi-parameter fluorescence detection of F

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.6K Views.  Clemson University. The overall goal of this protocol is to perform high precision inter-dye distance measurements using multi-parameter fluorescence detection of F