VJとHSは、NIH R01 GM094246からVJへのサポートを承認します。 HSは、クレムソン大学創造的調査プログラムとクレムソン大学の光学材料科学技術技術センターからスタートアップ資金を受け取ります。このプロジェクトは、ガルフコーストコンソーシアムの学際的なバイオサイエンストレーニングのためのケックセンター（NIGMS助成金番号1 T32GM089657-05）と一般ヒト疾患の翻訳研究のためのシスラー基金研究奨学金によっても支援されました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

すべての著者は、この記事の内容と競合する金銭的利益がないと宣言しています。

この研究では、PIE-MFD単分子FRET実験を使用して、高精度で粒子間距離を整列させ、較正し、測定するプロトコルが提示されている。すべての機器パラメータを慎重に較正することにより、測定距離の精度を高め、オングストロームの精度に達することができます。これを行うために、様々な多次元ヒストグラムを用いて、さらなる特徴付けのために集団を分析および同定する。測定されたサ?...

構造生物学研究の基本的な目的は、生体分子機械の構造と機能との関係を解明することである。生体分子（ 例えば、タンパク質や核酸）の最初の視覚的印象は、1950年代にX線結晶構造解析1,2によって生じました。 X線結晶解析は、結晶充填によって制約される高分解能、静的構造情報を提供する。したがって、X線構造モデルの固有の不動性は、ほとんどの生物学的機能に影響を及ぼす因子である生体分子の動的性質を排除する3,4,5。核磁気共鳴（NMR） 6,7,8 は、水溶液中の構造モデルを分解することによって、この問題に対する代替の解決法を提供した。大きな利点NMRは、構造、力学、および機能3,4,5の間の内在的な関係を明確にするのに役立つ、生体分子および立体構造アンサンブルの固有の動的性質を回復する能力である。それにもかかわらず、NMRは、試料の大きさおよび試料の大量によって制限され、より大きなシステムのための複雑な標識方法を必要とする。したがって、構造生物学における代替法を開発することが急務である。 歴史的に、フォルスター共鳴エネルギー移動（FRET） 9は、FRETが低精度の距離測定を提供するという誤解のために、構造生物学において重要な役割を果たしていない。このプロトコールの目的は、FRETがナノメートルスケールでの距離を決定する能力を再考することであり、そのような距離は、生体分子の構造モデルを構築するために使用することができる。最初の実験的検証FRET効率に対するR - 6依存の変化は、様々な長さのポリプロリンを「分光学的定規（spectroscopic ruler）」として測定することにより、1967年にStryerによって行われた。同様の実験が2005年の単一分子レベルで達成された11 。ポリプロリン分子は理想的ではないことが判明したので、後で二本鎖DNA分子を使用した。これにより、正確な距離測定のためのウィンドウが開き、FRETを使用して生体分子の構造特性を同定するというアイデアが開かれました。 眼間距離範囲が〜0.6〜1.3 R 0である場合、FRETは最適である。ここで、R 0はフォルスター距離である。単一分子FRET実験に用いられる典型的なフルオロフォアについては、 R 0は約50Åである。典型的には、FRETは、他の方法よりも多くの利点を提供し、その構造および動態を（i）蛍光の究極の感度のために、単分子FRET実験13,14,15,16は、個々のメンバーの構造を直接的に計数し同時に特徴付けることにより、異種アンサンブルを分解することができる。 （ii）複雑な反応経路は、アンサンブルの同期化が必要ないため、単一分子FRET研究で直接解読することができる。 （iii）FRETは、10年以上にわたる幅広い時間的領域にアクセスし、生物学的に関連する様々なダイナミクスをカバーすることができる。 （iv）FRET実験は、 インビトロおよびインビボの任意の溶液条件で行うことができる。 FRETと蛍光顕微鏡との組み合わせは、生きた細胞の分子構造および相互作用の直接的な研究を可能にする15,16 、 </<html>高精度20であっても17 ° 、 18 ° 、 19 °である。 （v）FRETは、ほぼ任意のサイズの系（ 例えば、ポリプロリンオリゴマー21,22,23,24、Hsp90 25 、HIV逆転写酵素26 、およびリボソーム27 ）に適用することができる。 （vi）最後に、生体分子のすべての次元性を含む距離のネットワークを用いて、静的分子または動的分子18,28,29,30,31,32,33,34,36の構造モデルを導出することができる。ref &quot;&gt; 35,36,37。 したがって、単一分子FRET分光法を使用して、距離制限構造モデル26に使用するのに十分正確な距離を導出することができます。これは、8つの次元の蛍光情報（ すなわち、励起スペクトル、蛍光スペクトル、異方性、蛍光寿命、蛍光量子収率など）を利用するマルチパラメータ蛍光検出（MFD）28,38,39,40,41,42を利用することによって可能である。巨視的時間、蛍光強度、および蛍光体間の距離）を正確かつ正確に提供して、距離制限を提供する。さらに、パルスインターリーブド励起（PIE）は、MFD（PIE-MFD） 42を用いて、直接励起アクセプター蛍光をモニターし、1：1ドナー - アクセプター化学量論を含むサンプルから生じる単一分子事象を選択する。典型的なPIE-MFDセットアップは、共焦点顕微鏡本体に接続された2パルスインターリーブ励起レーザーを使用し、光子検出は、異なるスペクトル窓および偏光特性の4つの異なるチャネルに分割される。詳細は図1を参照してください。 FRETは、FRET結果26,30と一致する原子的様構造モデルを達成するために、計算方法とFRETを組み合わせなければならないことに注意することが重要です。現在の議定書の目標は、関連する方法論を踏襲して、FRETに由来する距離を有する構造モデルを構築することではない。しかしながら、これらのアプローチは、他の技術（ 例えば、小角X線散乱または電子常磁性共鳴）、統合的な構造生物学の分野を生み出す43,44,45,46。現在の目標は、構造生物学の定量的ツールとしてFRETの道を開くことです。一例として、この方法を用いて、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメイン（LBD）における3つの構造状態を同定した。最終的な目的は、前述の限界を克服し、測定距離を高精度で提供することによって生体分子の構造決定に使用される統合的方法の中でFRETをもたらすことである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

マルチパラメータ蛍光検出（MFD）モードにおいて、単分子レベルでのフォルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて高精度の眼間距離測定を行う方法に関するプロトコールをここに示す。 MFDは、光物理学的および実験的アーチファクトを減少させるために蛍光のすべての「次元」の使用を最大にし、剛性生体分子において〜1Åまでの精度での粒子間距離の測定を可能にする。この方法を用いて、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインの3つの構造状態を同定し、リガンド結合時の受容体の活性化を説明した。既知の結晶学的構造を実験測定と比較すると、より動的な生体分子については3Å未満で合意した。生体分子の全次元をカバーする一組の距離制限を集めることにより、動的生体分子の構造モデルを提供することが可能になるes。

MFDセットアップ（レーザーライン：60μWで485nm、23μWで640nm、セクション5.1）を用いた典型的なsmFRET実験では、蛍光サンプルを低ピコモル濃度（10 -12 M = 1pM）に希釈し、サブナノ秒のレーザーパルスが励起分子を介して自由に拡散する標識分子を励起する共焦点顕微鏡で行う。典型的な共焦点体積は&lt;4フェムトリットル（fL）である。このような低濃度では、?...

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

単一分子レベルでの高精度FRET実験のプロトコールをここに示します。さらに、この方法論は、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体のリガンド結合ドメインにおける3つの構造状態を同定するために使用することができる。正確な距離を決定することは、FRET実験に基づく構造モデルを構築するための第一歩です。

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

The overall goal of this protocol is to perform high precision inter-dye distance measurements using multi-parameter fluorescence detection of F

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.6K ビュー.  Clemson University. The overall goal of this protocol is to perform high precision inter-dye distance measurements using multi-parameter fluorescence detection of F