VJ et HS reconnaissent le soutien du NIH R01 GM094246 à VJ. HS reconnaît les fonds de démarrage du programme d&#39;enquête créative de l&#39;Université de Clemson et du Centre de technologie des sciences et d&#39;ingénierie des matériaux optiques à l&#39;Université Clemson. Ce projet a également été soutenu par une bourse de formation du Keck Center for Interdisciplinary Bioscience Training du Gulf Coast Consortia (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) et la Fondation Schissler pour les études translationnelles des maladies humaines communes à DD. Le contenu relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.

Tous les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont pas d&#39;intérêts financiers concurrents avec le contenu de cet article.

Dans ce travail, le protocole d&#39;alignement, d&#39;étalonnage et de mesure des distances interdyeuses avec une grande précision en utilisant des expériences FRET à une seule molécule PIE-MFD est présenté. En calibrant soigneusement tous les paramètres instrumentaux, on peut augmenter la précision des distances mesurées et atteindre la précision d&#39;Angstrom. Pour ce faire, divers histogrammes multidimensionnels sont utilisés pour analyser et identifier les populations pour une caractérisation plus pous...

Un objectif fondamental des études de biologie structurale est de démêler la relation entre la structure et la fonction des machines biomoléculaires. La première impression visuelle de biomolécules ( p. Ex., Protéines et acides nucléiques) s&#39;est produite dans les années 1950 à travers le développement de la cristallographie aux rayons X 1 , 2 . La cristallographie aux rayons X fournit des informations structurales statiques à haute résolution contraintes par l&#39;emballage en cristal. Par conséquent, l&#39;immobilité inhérente des modèles structurels aux rayons X évite la nature dynamique des biomolécules, un facteur qui affecte la plupart des fonctions biologiques 3 , 4 , 5 . La résonance magnétique nucléaire (RMN) 6 , 7 , 8 a fourni une solution alternative au problème en résolvant des modèles structurels dans des solutions aqueuses. Un grand avantageDe la RMN est sa capacité à retrouver la nature dynamique intrinsèque des biomolécules et des ensembles conformationnels, ce qui aide à clarifier les relations intrinsèques entre structure, dynamique et fonction 3 , 4 , 5 . Néanmoins, la RMN, limitée par la taille de l&#39;échantillon et de grandes quantités d&#39;échantillons, nécessite des stratégies complexes d&#39;étiquetage pour les grands systèmes. Par conséquent, il est urgent de développer des méthodes alternatives dans la biologie structurale. Historiquement, le transfert d&#39;énergie de résonance de Förster (FRET) 9 n&#39;a pas joué un rôle important dans la biologie structurale en raison de l&#39;idée fausse selon laquelle FRET fournit des mesures de distance à faible précision. C&#39;est le but de ce protocole de revoir la capacité de FRET à déterminer les distances à l&#39;échelle nanométrique, de sorte que ces distances peuvent être utilisées pour la construction de modèles structurels de biomolécules. La première vérification expérimentaleLa dépendance à la R - 6 de l &#39; efficacité de FRET a été effectuée par Stryer en 1967 10 en mesurant des polyprolines de différentes longueurs comme une «règle spectroscopique». Une expérience similaire a été réalisée au niveau de la seule molécule en 2005 11 . Les molécules de polyproline se sont avérées non idéales et, par conséquent, les molécules d&#39;ADN double brin ont été utilisées plus tard 12 . Cela a ouvert la fenêtre pour des mesures de distance précises et l&#39;idée d&#39;utiliser FRET pour identifier les propriétés structurelles des biomolécules. FRET est optimal lorsque la distance de distance interdye est de ~ 0.6-1.3 R 0 , où R 0 est la distance de Förster. Pour les fluorophores typiques utilisés dans des expériences FRET à une seule molécule, R 0 est de ~ 50 Å. Généralement, FRET offre de nombreux avantages par rapport à d&#39;autres méthodes dans sa capacité à résoudre et à différencier les structures et la dynamique dansSystèmes hétérogènes: (i) En raison de la sensibilité ultime de la fluorescence, les expériences 1 , 14 , 15 , 16 de FRET à une molécule 13 , 14 , peuvent résoudre des ensembles hétérogènes en comptant directement et en caractérisant simultanément les structures de leurs membres individuels. (Ii) Les voies de réaction complexes peuvent être directement déchiffrées dans les études FRET à une seule molécule car aucune synchronisation d&#39;un ensemble n&#39;est nécessaire. (Iii) FRET peut accéder à une large gamme de domaines temporels qui s&#39;étend sur 10 décennies dans le temps, couvrant une grande variété de la dynamique biologiquement pertinente. (Iv) Les expériences de FRET peuvent être effectuées dans toutes les conditions de solution, in vitro aussi bien qu&#39;in vivo . La combinaison de FRET avec microscopie à fluorescence permet d&#39;étudier les structures moléculaires et les interactions directement dans les cellules vivantes 15 , 16 , </<html> Sup&gt; 17 , 18 , 19 , même avec une haute précision 20 . (V) FRET peut être appliqué à des systèmes de presque n&#39;importe quelle taille ( par exemple, les oligomères de polyproline 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , la transcriptase inverse du VIH 26 et les ribosomes 27 ). (Vi) Enfin, un réseau de distances qui contient toute la dimension des biomolécules pourrait être utilisé pour dériver des modèles structurels de molécules statiques ou dynamiques 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref &quot;&gt; 35 , 36 , 37 . Par conséquent, la spectroscopie FRET à une seule molécule peut être utilisée pour dériver des distances suffisamment précises pour être utilisées pour la modélisation structurelle à distance 26 . Ceci est possible en profitant de la détection de fluorescence multiparamètre (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , qui utilise huit dimensions de l&#39;information de fluorescence ( c&#39;est-à-dire le spectre d&#39;excitation, le spectre de fluorescence, l&#39;anisotropie, la durée de vie de la fluorescence, le rendement quantique de fluorescence, Le temps macroscopique, les intensités de fluorescence et la distance entre les fluorophores) pour réparer de manière précise et précise les contraintes de distance. En outre, l&#39;excitation entrelacée pulsée (PIE) est combinée avec MFD(PIE-MFD) 42 pour surveiller la fluorescence de l&#39;accepteur d&#39;excitation directe et pour sélectionner les événements d&#39;une seule molécule découlant d&#39;échantillons contenant une stoechiométrie donateur-accepteur 1: 1. Une configuration typique de PIE-MFD utilise des lasers d&#39;excitation entrelacés à deux impulsions connectés à un corps de microscope confocal, où la détection de photons est divisée en quatre canaux différents dans différentes fenêtres spectrales et caractéristiques de polarisation. Vous trouverez plus de détails dans la Figure 1 . Il est important de noter que FRET doit être combiné avec des méthodes de calcul pour obtenir des modèles structurels atomiques compatibles avec les résultats FRET 26 , 30 . Ce n&#39;est pas l&#39;objectif du protocole actuel de passer en revue la méthodologie associée pour construire des modèles structurels avec des distances dérivées de FRET. Cependant, ces approches ont été appliquées en combinaison avec d&#39;autres techniques ( p. Ex., La dispersion des rayons X à angle petitOu la résonance paramagnétique électronique), donnant naissance au domaine de la biologie structurale intégrative 43 , 44 , 45 , 46 . L&#39;objectif actuel est d&#39;ouvrir la voie à FRET en tant qu&#39;outil quantitatif en biologie structurale. À titre d&#39;exemple, cette méthodologie a été utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand (LBD) du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). Le but ultime est de surmonter les limitations précitées et d&#39;introduire FRET parmi les méthodes d&#39;intégration utilisées pour la détermination structurale des biomolécules en fournissant des distances mesurées avec une haute précision.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="672">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">charcoal</td>
			<td style="width:183px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:119px;">K42964486 320</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">syringe filter</td>
			<td style="width:183px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">09-719C</td>
			<td>size: 0.20um</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">chambered coverglass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">155409</td>
			<td>1.5 borosilicate glass, 8 wells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">microscope cover glass</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">063014-9</td>
			<td>size: 24X60-1.5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">148859</td>
			<td>nuclease free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">tween-20</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">28320</td>
			<td>10% solution of Polysorbate 20</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (High FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">178124895</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">acceptor DNA strand (Low FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177956424</td>
			<td>5&#180;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">donor DNA strand</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;">177951437</td>
			<td>5&#180; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">DNA strand (No FRET)</td>
			<td style="width:183px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>5&#180; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">thermal cycler</td>
			<td style="width:183px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">E6331000025</td>
			<td>nexus gradient</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 488 C5&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A10254</td>
			<td>termed cyan-green fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Alexa Fluor 647 C2&#160;Maleimide</td>
			<td style="width:183px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A20347</td>
			<td>termed far-red fluorophore in the manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 110</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83695-250MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Rhodamine 101</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">83694-500MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">LB Broth, Miller</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1426</td>
			<td>For culture of E. coli</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A0166</td>
			<td>Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Tetracyline&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:119px;">58346</td>
			<td>Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP906-5</td>
			<td>Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Origami B(DE3) Competent Cells</td>
			<td style="width:183px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">70837-3</td>
			<td>Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td>For induction of E. coli protein expression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">HiTrap Chelating HP</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0409-01</td>
			<td>For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Imidazole</td>
			<td style="width:183px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">56749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Ni-NTA Agarose&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PD-10 Desalting Column</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0851-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">AktaPurifier</td>
			<td style="width:183px;">GE Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">28406264</td>
			<td>FPLC Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Dialysis tubing</td>
			<td style="width:183px;">Spectrum labs</td>
			<td style="width:119px;">132562</td>
			<td>15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Dichroics</td>
			<td style="width:183px;">Semrock</td>
			<td style="width:119px;">FF500/646-Di01-25x36</td>
			<td>500/646 BrightLight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">50/50 Beam splitter polarizer</td>
			<td style="width:183px;">Qioptiq Linos&#160;</td>
			<td style="width:119px;">G33 5743 000</td>
			<td>10x10 film polarizer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Green pass filer</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td style="width:119px;">ET525/50m</td>
			<td style="width:167px;">ET525/50m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Red pass filter</td>
			<td style="width:183px;">Chroma</td>
			<td>ET720/150m</td>
			<td>ET720/150m 25 mm diameter mount</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Power Meter</td>
			<td style="width:183px;">ThorLabd</td>
			<td style="width:119px;">PM200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:183px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;">Cary300Bio</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorolog 3 fluorometer</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">FL3-22-R3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Fluorohub TCSPC controller</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">Fluorohub-B</td>
			<td>TCSPC electronics for ensemble measurements</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 485L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">485L</td>
			<td>Blue diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">NanoLed 635L</td>
			<td style="width:183px;">Horiba</td>
			<td style="width:119px;">635L</td>
			<td>Red diode laser</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">Olympus IX73 Microscope</td>
			<td style="width:183px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX73P2F</td>
			<td>Microscope frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 40 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932200, PMA 40</td>
			<td>Optimized for green detection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">PMA 50 Hybrid Detector</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">932201, PMA 50</td>
			<td>Optimized for ed shifter sensitivity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">485nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">640nm laser</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant GmbH</td>
			<td style="width:119px;">LDH-D-C-640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">Hydraharp 400 and TTTR acqusition software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">930021</td>
			<td>Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">SEPIA II SLM 828 and SEPIA software</td>
			<td style="width:183px;">PicoQuant</td>
			<td align="right" style="width:119px;">910028</td>
			<td>Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">computer</td>
			<td style="width:183px;">Dell</td>
			<td style="width:119px;">optiplex 7010</td>
			<td>cpu: i7-3770 ram:16GB</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:204px;">FRET Positioning and Screening (FPS) software</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:204px;">MFD suite</td>
			<td style="width:183px;">Heinrich Heine Unviersity</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination

Un protocole sur la façon d&#39;effectuer des mesures de distances interdyeuses de haute précision en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de Förster (FRET) au niveau de la seule molécule dans le mode de détection de fluorescence multiparamètre (MFD) est présenté ici. MFD maximise l&#39;utilisation de toutes les &quot;dimensions&quot; de la fluorescence pour réduire les artefacts photophysiques et expérimentaux et permet de mesurer la distance interdyeuse avec une précision allant jusqu&#39;à ~ 1 Å dans les biomolécules rigides. Ce procédé a été utilisé pour identifier trois états conformationnels du domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA) pour expliquer l&#39;activation du récepteur lors de la liaison du ligand. En comparant les structures cristallographiques connues avec les mesures expérimentales, elles ont accepté moins de 3 Â pour des biomolécules plus dynamiques. La collecte d&#39;un ensemble de restrictions à distance qui couvre toute la dimension des biomolécules permettrait de fournir un modèle structurel de biomoléculaire dynamiqueEs.

Dans les expériences typiques smFRET utilisant une configuration MFD (lignes laser: 485 nm à 60 μW et 640 nm à 23 μW, section 5.1), l&#39;échantillon de fluorescence est dilué à une faible concentration picomolaire (10 -12 M = 1 pM) et placé Dans un microscope confocal, où une impulsion laser sous-nanoseconde excite des molécules marquées diffusant librement à travers un volume d&#39;excitation. Un volume confocal typique est &lt;4 femtoliters (fL). À de faibles ...

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High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Un protocole pour les expériences FRET de haute précision au niveau de la molécule unique est présenté ici. En outre, cette méthodologie peut être utilisée pour identifier trois états conformationnels dans le domaine de liaison au ligand du récepteur N-méthyl-D-aspartate (NMDA). La détermination de distances précises est la première étape vers la construction de modèles structurels basés sur des expériences FRET.

FRET de haute précision au niveau d&#39;une molécule pour la détermination de la structure biomoléculaire

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

The overall goal of this protocol is to perform high precision inter-dye distance measurements using multi-parameter fluorescence detection of F

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.6K vues.  Clemson University. The overall goal of this protocol is to perform high precision inter-dye distance measurements using multi-parameter fluorescence detection of F