O zebrafish está emergindo como um excelente modelo de vertebrado para estudar os eventos cromossômicos da meiose, incluindo pareamento de cromossomos homólogos, sinápsia e recombinação. Este protocolo de expansão da superfície nuclear nos permitiu visualizar características-chave da arquitetura cromossomo meiotic usando microscopia de super resolução. Os pesquisadores podem esperar centenas de núcleos bem espalhados por deslizamento com menos detritos do que outros protocolos de propagação de zebrafish.
A parte mais desafiadora tecnicamente deste procedimento é a dissecação dos testículos de zebrafish, pois está próximo da pele e também está ligado a outros órgãos. Visualizar o procedimento de dissecção permitirá que os pesquisadores saibam o que esperar quando virem a gônada embutida no tecido do animal. Depois de eutanásia de zebrafish macho, decapitar um peixe de cada vez com uma tesoura pequena e, em seguida, usar micro tesouras para cortar ao longo da linha média ventral para expor a cavidade corporal.
Coloque o peixe em uma placa de Petri revestida de silicone e cubra por uma piscina rasa de 1X PBS. Sob um microscópio a ampliação de 1,65X, disseco os testículos usando fórceps. Remova o máximo de gordura e tecido circundante possível dos testículos.
A gônada aparecerá translúcida sob a luz do escopo de dissecção, enquanto a gordura circundante pode ter uma aparência ligeiramente mais escura. Alguma quantidade de gordura pode ser deixada na gôngasa sem impedir o procedimento. Adicione cada testículo dissecado diretamente em um tubo de cinco mililitros com dois mililitros de DMEM e mantenha no gelo.
Para dissociar as células de testículos, adicione 200 microliters de solução de colagenase ao tubo de cinco mililitros com os testículos. Misture a solução invertendo-a várias vezes. Agite suavemente os testículos em um agitador de incubadora horizontalmente a 100 RPM a 32 graus Celsius.
Inverta rapidamente o tubo a cada 10 minutos para facilitar a dissociação. Depois de uma hora, o DMEM fica nublado e os testículos estão em pequenos pedaços. Enquanto os testículos são incubados em colagenase, pré-aquecedor 100 microlitres de 0,1 solução de sacarose molar a 37 graus Celsius.
Para lavar a colagemnase, adicione DMEM a um volume final de cinco mililitros e inverta o tubo algumas vezes. Pelota os testículos a 200 g por três minutos em temperatura ambiente. Remova três mililitros do supernatante para que apenas dois mililitros permaneçam.
Repita a lavagem do DMEM duas vezes adicionais. Após a última lavagem do DMEM, remova quatro mililitros do supernatante e adicione um mililitro de DMEM, 200 microliters de solução de trippsina e 20 microliters de solução DNase I. Inverta o tubo algumas vezes para misturar a solução.
Agite horizontalmente o tubo a 32 graus Celsius a 100 RPM. Inverta rapidamente o tubo a cada cinco minutos para facilitar a dissociação. Após cinco a 15 minutos, a solução DMEM contém apenas alguns aglomerados.
Adicione 500 microliters da solução inibidora de trippsina e 50 microliters de solução DNase I. Inverta o tubo algumas vezes para misturar e, em seguida, gire brevemente a 200 g por três minutos à temperatura ambiente para remover líquidos ou aglomerados que possam aderir à tampa do tubo ou ao lado do tubo. Coloque o tubo no gelo e resuspenja a suspensão da célula, encanar repetidamente para cima e para baixo com uma pipeta de transferência de plástico por dois minutos para facilitar a dissociação de quaisquer aglomerados restantes.
Certifique-se de que a suspensão da célula não vá para a lâmpada da pipeta de transferência. Em seguida, pré-molhar um coador de células de 100 mícrons com DMEM e colocá-lo em cima de um tubo de 50 mililitros no gelo. Transfira a suspensão da célula através do coador uma gota de cada vez usando uma pipeta de transferência de plástico.
Transfira o filtrado usando uma pipeta de transferência de plástico para um novo tubo de cinco mililitros. Certifique-se de coletar as células agrupadas presas na parte inferior do filtro. Adicione DMEM no tubo a um volume final de cinco mililitros.
Pelota as células a 200 g por cinco minutos em temperatura ambiente. Remova o máximo de supernascer possível sem perturbar a pelota e adicione cinco microliters de solução DNase I diretamente na pelota. Em seguida, misture a pelota com a solução DNase I raspando suavemente o fundo externo do tubo quatro a cinco vezes ao longo de um rack vazio de tubo de microcentrifuuge.
Adicione o DMEM a um volume final de cinco mililitros e misture a solução invertendo o tubo várias vezes. Pelotar a suspensão do celular a 200 g por dois minutos em temperatura ambiente. Repita o tratamento DNase uma a três vezes adicionais até que a pelota resuspended não se desprezou após a adição de DMEM.
Após o último giro, remova o máximo possível de supernasceso possível sem perturbar a pelota. Em seguida, adicione um mililitro de 1X PBS e resuspenque a pelota raspando suavemente a parte inferior externa do tubo ao longo de um rack de tubo vazio. Pelotar a suspensão da célula a 200 g por cinco minutos e, em seguida, remover o máximo de supernante possível sem perturbar a pelota.
Corte três milímetros do final de uma ponta de pipeta de 200 microliter para ampliar a abertura. Com a ponta de pipeta cortada, resuspenque a pelota em 80 microlitres de solução de sacarose molar 0,1 por pipetação para cima e para baixo. Deixe a suspensão do celular ficar em temperatura ambiente por três minutos.
Em seguida, com uma ponta de pipeta, cubra um slide com 100 microliters de 1%formaldeído com 0,15% Triton X-100. Em seguida, adicione 18 microliters da suspensão da célula de sacarose no centro do slide em uma linha reta perpendicular à borda longa. Incline o slide para frente e para trás para facilitar a propagação da suspensão da célula para todos os cantos.
Coloque os slides em uma câmara de umidade aberta ligeiramente rachada para evitar que a solução de formaldeído seque. Coloque a câmara de umidade em uma gaveta escura durante a noite. Pela manhã, retire a tampa da câmara de umidade e deixe os slides secarem completamente.
Coloque os slides em um frasco de coplin e, em seguida, encha o frasco de coplin com água destilada. Incubar por cinco minutos com agitação suave à temperatura ambiente. Despeje a água e encha o frasco com um a 250 agentes de molhar.
Lave duas vezes por cinco minutos cada um com agitação suave à temperatura ambiente. Deixe os slides secarem completamente e armazenem a menos 20 graus Celsius até que estejam manchados. Este protocolo esboçou um método para preparar e visualizar a propagação de espermatotocitos de zebrafish que produz núcleos não sobrepostos bem espalhados.
Os painéis à esquerda mostram três estágios de prophase meiotic, leptoteno, zygotene precoce e pachytene. Telômeros foram manchados magenta para cada etapa. Um exemplo de spreads de baixa qualidade devido à insuficiência de tratamentos DNase I são mostrados aqui.
Cromossomos meiotics manchados para SYCP3 indicam núcleos sobrepostos devido a uma suspensão viscosa de células de sacarose que impede que as células se espalhem adequadamente na lâmina. É muito importante começar com a quantidade correta de material inicial, tratar testículos de zebrafish pela quantidade adequada de tempo no trypsin, e realizar o número necessário de tratamentos DNase I como falha em fazê-lo pode levar a muito poucos núcleos ou núcleos agrupados. Epi adequado deve ser sempre usado ao trabalhar com formaldeído.
Após o procedimento de disseminação, os cromossomos podem ser manchados para visualizar várias estruturas cromossômicas, bem como quebras de dois fios para analisar a dependência de tempo e localização de eventos meioticos. Nossa técnica abriu caminho para mostrar que o zebrafish pode ser um modelo melhor de espermatogênese humana do que o rato baseado nas características do cromossomo e no buquê de telômero.
