Este protocolo ajuda a verificar a existência de Wolbachia nas células, que é a base da compreensão da interação entre Wolbachia e seu hospedeiro. Neste protocolo, quatro métodos foram utilizados para detectar com sucesso a infecção por Wolbachia intracelular, o que corroborou e melhorou a precisão de detecção da infecção por Wolbachia das células. Demonstrando o procedimento estará Qiuqiu Xiao, pós-graduado do Laboratório Chave de Biologia e Características de Patógenos Modernos.
Comece observando células Aa23 e Aa23-T não manchadas a 100x de ampliação usando microscopia leve. Cultura as células por cinco a sete dias para atingir 70 a 80% de confluência por frasco. Usando uma pipeta, transfira 1 mL do meio de cultura para um tubo de microcentrífuga.
Centrífuga a 100 RCF por cinco minutos para colher as células. Remova o sobrenante e armazene a pelota celular resultante a menos 20 graus Celsius. Cultura as células por cinco a sete dias para atingir 90 a 100% de confluência por frasco.
Resuspenja as pelotas em 0,40 mL de PBS e transfira 50 microliters desta solução para um tubo de microcentrífuga. Adicione cinco microliters de 20 mg/mL proteinase K e incubar a 55 graus Celsius por uma hora. Em seguida, incubar os tubos a 99 graus Celsius por 15 minutos para obter o DNA bruto e armazená-lo a menos 20 graus Celsius.
Para realizar o PCR, prepare uma mistura de reação total de 20 microliters e defina as condições de PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Detecte o DNA em um gel de 1%agarose usando um imager de gel. Realize a amplificação quantitativa do PCR usando TB Green em um sistema PCR em tempo real e regise os resultados de cada reação.
Analise o DNA em um volume total de reação de 20 microliters e defina as condições quantitativas de PCR conforme descrito no manuscrito do texto. Calcule os números de cópia genética WSP e RPS6 nas células de acordo com a curva padrão estabelecida. Em seguida, calcule a densidade relativa de Wolbachia pelo número de cópia do wsp/RPS6.
Analise os dados usando um teste de amostras independentes. Adicione 200 microliters de tampão de lise à pelota celular e incubar no gelo por 30 minutos. Centrifugar os lysates a 12.000 RCF por 10 minutos a quatro graus Celsius e aspirar o supernante.
Analise a concentração de wsp do supernante utilizando um kit de ensaio de proteína BCA, seguindo as instruções do fabricante. Carregar quantidades iguais de proteína em um gel de 15% SDS-PAGE. Transfira a proteína para membranas nitrocelulose e bloqueie as membranas com leite 5% desnatado por duas horas à temperatura ambiente.
Em seguida, lave as membranas três vezes com TBST. Incubar as membranas durante a noite a 4 graus Celsius com 100 microlitres de anticorpo policlonal anti-wsp preparado pela diluição do anticorpo primário com leite 5% desnatado. Lave o anticorpo primário três vezes com TBST.
Adicione 100 microliters de anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rabanete às membranas e incuba-o em um agitador por uma hora à temperatura ambiente. Lave as membranas três vezes com TBST e misture 20 microliters de solução A e 20 microliters de solução B no kit de detecção de quemiluminescência em uma proporção de um para um. Mergulhe toda a membrana na solução de luminescência simultaneamente e observe os sinais usando um sistema de imagem multifuncional.
Em uma placa de Petri confocal laser, incubar células Aa23 e Aa23-T por três a quatro dias a 28 graus Celsius sob 5% de dióxido de carbono atmosférico. Quando a célula atingir 60 a 70% de confluência, lave as células três vezes com PBS. Fixar as células em um mL de 4% de paraformaldeído por 20 minutos a quatro graus Celsius.
Lave as células fixas usando PBST por cinco minutos e reclave as células duas vezes com PBS. Incubar a placa de Petri em um mL de 3% de albumina de soro bovino por uma hora a 37 graus Celsius. Adicione 100 microliters de anticorpo policlonal anti-wsp do rato e soro do rato aos slides e incuba-o durante a noite em uma caixa molhada a quatro graus Celsius.
Retire a placa de Petri da caixa molhada e devolva-as à temperatura ambiente. Lave-os três vezes com PBS e remova o PBS. Proteja os seguintes procedimentos da luz.
Incubar a placa de Petri com 100 microliters de um anticorpo anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 conjugado a 37 graus Celsius por 30 minutos. Incubar a placa de Petri com 50 microliters de DAPI diluídos em PBS a 10 microgramas/mL a 37 graus Celsius por cinco minutos e depois lavá-los três vezes com PBS. Observe a imunostaining sob um microscópio confocal.
Antes de detectar as células Wolbachia, Aa23 e Aa23-T foram observadas sob um microscópio leve para determinar diferenças morfológicas entre as duas linhas celulares. As células Aa23 e AA23-T tinham pelo menos duas morfologias celulares, mas não foram observadas diferenças morfológicas aparentes entre os dois tipos de células. Utilizando os primers diagnósticos 81F/691R, a amplificação positiva do gene Wolbachia wsp foi detectada em células Aa23, mas não em células Aa23-T.
A análise da densidade de Wolbachia nas linhas celulares mostrou uma razão wsp/rps6 de 2,4 em células Aa23, mas nenhuma Wolbachia em células Aa23-T. A análise ocidental de extratos de proteína mostrou um forte sinal wsp para Aa23, mas nenhum sinal foi detectado para Aa23-T. O ensaio indireto de imunofluorescência detectou a proteína wsp em células Aa23, enquanto apenas o DNA manchado de DAPI foi detectado em células Aa23-T.
Certifique-se de que os frascos de cultura sejam incubados a 28 graus Celsius sob dióxido de carbono atmosférico de 5% por cinco a sete dias. Este procedimento pode ser seguido por microscopia eletrônica onde é preciso prestar especial atenção à preparação e seção da amostra. Os quatro métodos experimentais utilizados neste estudo confirmaram a precisão de detecção da infecção por Wolbachia nas células, o que também é aplicável a outros tipos de células e tecidos.
