Agradecemos a Paul O'Brien, Marizel Mina e Isabella Freedman para experiências em animais, Jacquie Gonzalez e Danielle Weiner do NIH/NIAID para ajuda com irradiação gama de tecidos coelho antes do laser captura microdissection e Jansy Sarathy para manuscrito pensamentos e conselhos. Este trabalho foi financiado pelo financiamento do Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1174780) e instrumentação de NIH compartilhado concedem 1S10OD018072. Agradecemos Eliseo A. Eugenin fornecendo acesso para microscópio Leica LMD 6500 e partilha de conhecimentos e conselhos. A compra e suporte contínuo, o LMD 6500 foi financiado por grant o Instituto Nacional de Saúde Mental, MH096625, o Instituto Nacional de Disorders Neurological e curso, NS105584, PHRI financiamento (E.A.E) e GSK contribuições (E.A.E).

Todos os animais foram realizados estudos de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório dos institutos nacionais de saúde, com aprovação do cuidado Animal institucional e Comissão de uso do NIAID (NIH), Bethesda, MD.
1. animais experimentos e coleta de tecido
Esta seção do protocolo descreve procedimentos de animais e coleta de amostra em condições de biossegurança nível 3 (BSL3). Protocolos detalhados da Mycobacterium tuberculosis aerossol infecção procedimento droga administração e protocolos em coelhos tem sido descrito anteriormente11,12.
<ol><li>Infectar coelhos Nova Zelândia branco (masculinos e femininos em 4-5 meses de idade) com M. tuberculosis HN878 usando um sistema aerossol somente nariz, conforme descrito anteriormente11.</li>
	<li>Administrar as drogas escolhidas (etambutol no exemplo apresentado aqui) através da rota preferencial e eutanásia dos animais em 2, 6 e 24 h após a administração. Primeiro, anestesia o coelho por injeção intramuscular de cetamina em 35 mg/kg e xilazina 5 mg/kg. Espere dez minutos e confirme anesthetization adequada beliscar a cauda e tocando suavemente o olho. Se não há nenhuma reação, eutanásia por administração intravenosa de pentobarbital e fenitoína (ver Tabela de materiais) em 1 mL/4,5 kg em soro fisiológico estéril de 2 mL. Nota: Esses momentos são ideais para cobrir o perfil farmacocinético para Ethambutol e podem exigir ajuste/otimização para outras drogas de estudo.</li>
	<li>Usando a pinça, tesoura ou bisturi, remover os pulmões da cavidade torácica, ressecar biópsias pulmonares contendo grandes granulomas necróticos incorporados no tecido de pulmão não envolvido (conforme descrito anteriormente,3). Necróticos granulomas aparecem bege na cor e normalmente projetam-se ligeiramente do pulmão circundante cor vermelho/rosa. Para facilitar a fácil cryosectioning, certifique-se de que as biópsias são não maiores que 2 x 1,5 x 1,5 cm.</li>
	<li>Usando a pinça, coloque a biópsia em uma bandeja de cryomold pre-etiquetados com a superfície de corte desejado em contato direto com a base da bandeja. Após a congelação, isso proporcionará uma superfície plana do qual cryosections será cortado.</li>
	<li>Congele a biópsia em vapor de nitrogênio líquido. Encha um recipiente de isopor a uma profundidade de 2 polegadas com nitrogênio líquido e coloque uma cremalheira de fio do metal do tubo. O rack deve projetar-se acima da superfície do nitrogênio líquido proporcionando uma superfície plana sobre a qual são colocadas as bandejas de tecido. Coloque a tampa de volta no recipiente de isopor e deixar tecidos durante 10 minutos para congelar completamente.</li>
	<li>Remova as bandejas de tecido, rapidamente, embrulhe em película de alumínio e coloque em rotuladas individualmente selo e sacos plásticos resealable. Transfira para o congelador-80 ° C para armazenamento. Nota: Etapas 1.1-1.6 são executadas em condições BSL3 (incluindo todo o trabalho animal e manipulação de tecidos e órgãos infectados). Gama irradiar as biópsias pulmonares em 3 megarad para habilitar o tratamento fora do confinamento do BSL3. Microdissection de captura do laser no tecido esterilizado pode ser realizado dentro do BLS3 facilidade se aprovados os protocolos de segurança estão em vigor. No entanto, o restante do presente protocolo descreve o processamento a jusante em uma facilidade BSL-2.</li>
</ol>2. tecido de seccionamento
<ol><li>Conjunto do criostato para a temperatura de corte desejada. Transferir a biópsia de pulmão gama irradiados de armazenamento-80 ° C para o criostato e deixar por 30 minutos para equilibrar a temperatura do tecido. Nota: -20 a-22 ° C é ideal para biópsias de lesão TB.</li>
	<li>Usando uma pinça, conserte a biópsia para o chuck criostato usando uma pequena quantidade de adesivo de temperatura de corte ideal (OCT) para aderir a base do tecido para o chuck. Posicione o tecido de modo que a superfície plana (que estava em contato com a base do cryomold) é a superfície exposta para o corte. Garantir a OCT não contamina a superfície do tecido, como isso pode interferir com a análise de espectrometria de massa subsequente.</li>
	<li>Três seções de tecido em 25 µm de espessura de corte e montagem no PET membrana slides. Suavemente, toque a membrana para a seção de tecido e remover. Se muita pressão é aplicada, a fina membrana pode rasgar.<ol>
<li>Evite o manuseio excessivo dos slides antes da montagem, pois isso resultará na membrana de PET, tornando-se carregada e pobre adesão das secções de tecido. Certifique-se de que o slide de membrana é mantido à temperatura ambiente para permitir a adesão de degelo-montagem e bem sucedida do tecido à membrana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retirar a lâmina do criostato e deixe para secar por 3 minutos. Se LCM-LC/MS/MS não será executada imediatamente, sele o slide em um pequeno saco selável hermético e transferência para armazenamento-80 ° C até necessária para dissecação.</li>
	<li>Corte uma parte adjacente em 10-12 µm e degelo-mount em um slide de vidro padrão de hematoxilina e eosina (H & E) coloração e referência. Seções adicionais podem ser cortadas neste momento para outras manchas de histoquímica desejado (como o Ziehl-Niellsen para a visualização de Mycobacterium tuberculosis (MTB)).</li>
</ol>3. Microdissection
<ol><li>Retire o saco selado que contém o slide de armazenamento-80 ° C e deixe para atingir a temperatura por 5 minutos. Nota: Se o frio slide imediatamente é exposto à atmosfera de laboratório, o tecido irá tornar-se revestido com condensação, e a integridade espacial da droga pode ser comprometida.</li>
	<li>Ligue o microscópio e laser (laser requer 5-10 minutos de aquecimento antes de corte pode começar). Carregar tubos PCR 0,20 mL liso-cap para o titular.</li>
	<li>Retirar a lâmina do saco e levar uma imagem óptica da seção de tecido no slide PET usando um scanner de mesa.</li>
	<li>Coloque o slide no porta corrediça (lado do tecido voltada para baixo) e atribuir os tubos de coleta seletiva para regiões específicas granuloma de interesse usando o software de microscópio. Normalmente, estes serão 'sem envolvimento pulmonar,' 'granuloma celular', e 'caseum' (centro necrótico), mas pode variar dependendo da patologia específica da biópsia/granuloma.</li>
	<li>Focar o tecido usando o 5 X objetivo de microscópio. Essa ampliação deve fornecer uma boa visão do tecido que contém ambas as áreas de granuloma necrótico e celular. No software selecione o tubo designado 'caseum' para movê-lo para a posição sob o tecido.</li>
	<li>Digite os parâmetros desejados de dissecação. As configurações típicas para uma seção de pulmão grosso 25 µm são poder do laser 30, velocidade 15 e abertura 35 (unidades arbitrárias). No entanto, estas serão diferentes dependendo do microscópio usado e potencial declínio de poder devido à idade do laser.</li>
	<li>Selecione a ferramenta de 'desenho livre' e, usando caneta touchscreen ou um rato, contorne a região desejada para dissecação. A área de superfície da região será exibida no software. Regiões selecionadas sob 500.000 µm2 (0,5 mm2) para facilitar a dissecação mais fácil de manter. Repita a dissecação até 3 milhões µm2 (3 mm2) têm sido recolhidas no total na tampa do tubo.<ol>
<li>Na ocasião, a região dissecada pode permanecer presa à membrana circundante (por exemplo, devido a atração estática) e não cair a tampa de coleção. Remova estas regiões de cumulativa área de superfície total selecionando e removendo manualmente dentro do software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione o boné para 'lesão celular' e coletar 3 milhões µm2 do tecido usando o mesmo processo, conforme descrito na etapa 3.7.</li>
	<li>Selecione o boné para 'sem envolvimento pulmonar' e coletar 3 milhões µm2 do tecido usando o mesmo processo, conforme descrito na etapa 3.7. Observe que o tecido pulmonar sem envolvimento contém muitos espaços alveolares e bronquíolos. Preste muita atenção para excluir estas provenientes das regiões de tecido definidos para dissecação.</li>
	<li>Retire o porta-tampa e cuidadosamente unclip, selar e etiquetar cada tubo. Protege os tecidos dissecados do entorno ar distúrbios (por exemplo, de interrupção de fluxo de ar de uma porta de abertura). Analisar os tecidos dissecados imediatamente, ou armazenar a-80 ° C e descongelar antes do processamento e análise LCMS.</li>
</ol>4. extração e análise LCMS
<ol><li>Prepare a solução de extração de 1:1 acetonitrilo/metanol contendo padrão interno d-10 de Etambutol. Ao selecionar um padrão interno, uso uma forma estável e rotulada da droga do analito (tais como deutério-rotulado EMB utilizado nesta demonstração) com deslocamento de massa suficiente para evitar o isótopo Cruz falar entre o analito drogas e padrão (geralmente um mínimo de 4 daltons) . Nota: Criar padrões em homogeneizado de cada tipo de tecido respectivos é difícil porque não há tecido controle muito limitado com o qual deseja criar normas homogeneizado. Como alternativa à disponibilização de normas de uma amostra de homogenate cravado, um padrão pode ser criado pela adição de tecido em branco e composto de teste junto e extração. Um volume de tecido de controle em um homogenate que coincide com o volume de destino das secções de tecido de amostra de estudo é combinado diretamente com o aumento do teste de compostos que estaria presente em uma dada concentração.</li>
	<li>Calcular o volume do tecido-alvo com base na área de superfície e espessura do tecido e determinar o factor de diluição necessária para o homogenate utilizando o volume de homogeneizado que será adicionado para o padrão e as amostras QC. Cálculos são ilustrados abaixo para uma área-alvo dissecado2 (3 mm2) µm 3 milhões com um 25 µm de espessura e 2 µ l volume de homogeneizado. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq4.jpg">
</li>
	<li>Assumindo uma densidade de tecido de 1 g/mL, prepare o estoque de homogeneizado, 50 mg de tecido de controle de pesagem e adição de tampão PBS para diluir (usando o fator de diluição de 26,67 homogenate calculado na etapa 4.2, o diluente é 1,283 mL). Homogeneizar por grânulo batendo o tecido pulmonar e tampão PBS durante 5 minutos em 1750 rpm em um homogeneizador de grânulo. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq5.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq6.jpg">
</li>
	<li>Dilua a concentração de estoques de drogas 1 mg/mL em acetonitrila/água de 1:1 para criar a curva padrão de cravação soluções. Determine concentrações padrão baseadas sobre o volume de pico e o volume de tecido alvo de cravação. O exemplo ilustrado é para um 100 ng/mL padrão usando um volume de pico 10 µ l. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq7.jpg"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq8.jpg">
</li>
	<li>Retirar os tubos contendo os tecidos microdissected de armazenamento-80 ° C e deixe para atingir a temperatura por 5 minutos.</li>
	<li>Adicione 10 µ l de solução de acetonitrila/água 1:1 e 2 µ l de tampão PBS para os tubos contendo tecido microdissected.</li>
	<li>Para a curva padrão e controle de qualidade de tubos, adicione 10 µ l da solução a 2 µ l de controlo pulmão homogenate de cravação.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de solução de extração para cada tubo.</li>
	<li>Vórtice cada tubo por 5 minutos, proceda à sonicação por 5 minutos e centrifugar a 5000 RPM por 5 minutos para formar um pellet de filme e tecido em cada tubo.</li>
	<li>Transferir 50 µ l do sobrenadante para uma placa de 96 poços profundos poços e diluir com um adicional 50 µ l de água deionizada em cada poço.</li>
	<li>Realizar análise de LC/MS/MS usando parâmetros do instrumento otimizado para Ethambutol e etambutol-d10 padrão interno (conforme descrito em detalhe12).</li>
	<li>Use um fator de diluição para corrigir a quantidade exata de tecido dissecado para cada amostra. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq9.jpg">
</li>
</ol>5. método validação
<ol><li>Crie um homogenate no tecido pulmonar de controle através da combinação de esferas de aço de 3-4, 2 partes de PBS e 1 parte de pulmão. Bata o tecido pulmonar e tampão PBS durante 5 minutos em 1750 rpm usando um homogenizador do grânulo.</li>
	<li>Spike o homogenate adicionando 10 µ l de 1 mg/mL estoque Ethambutol DMSO em 990 homogenate µ l para criar uma concentração final de 10.000 ng/mL (10 mg/mL) e vortex durante 1 minuto.</li>
	<li>Crie um bloco congelado homogeneizado derramando o homogeneizado em um cryomold e congelando rapidamente em gelo seco por 5 minutos.</li>
	<li>Prepare 25 µm espessura seções do bloco homogeneizado como descrito nos passos 2.1-2.5.</li>
	<li>Disse a área de tecido alvo conforme especificado nas etapas 3.2-3.10.</li>
	<li>Adicione 10 µ l 1:1 acetonitrila/água e 2 µ l de tampão PBS para os tubos contendo tecido microdissected.</li>
	<li>Adicione 50 µ l de solução de extração para cada tubo. Siga os passos 4.9-4.12 para criar uma curva padrão e determinar a concentração de fármaco no bloco de homogeneizado de tecido.</li>
	<li>Calcule a eficiência de extração, usando a fórmula abaixo: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57402/57402eq10.jpg">
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+From+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li><li>Roscioli, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desorption+electrospray+ionization+(DESI)+with+atmospheric+pressure+ion+mobility+spectrometry+for+drug+detection.">Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection.</a> Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+of+levofloxacin+distribution+in+TB-infected+pulmonary+lesions+by+MALDI-MSI+and+continuous+liquid+microjunction+surface+sampling.">Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling.</a> Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).</li><li>Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raster-mode+continuous-flow+liquid+microjunction+mass+spectrometry+imaging+of+proteins+in+thin+tissue+sections.">Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections.</a> Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).</li><li>Prideaux, B., Stoeckli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging+for+drug+distribution+studies.">Mass spectrometry imaging for drug distribution studies.</a> J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).</li><li>Dilillo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+imaging,+laser+capture+microdissection,+and+LC-MS/MS+of+the+same+tissue+section.">Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section.</a> J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).</li><li>Xu, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+laser+capture+microdissection+and+proteomics:+methodologies+and+clinical+applications.">Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications.</a> Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).</li><li>Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+dissection+sampling+modes+for+direct+mass+spectral+analysis.">Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+A+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).</li><li>Zimmerman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethambutol+partitioning+in+tuberculous+pulmonary+lesions+explains+its+clinical+efficacy.">Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).</li><li>Kempker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cavitary+penetration+of+levofloxacin+among+patients+with+multidrug-resistant+tuberculosis.">Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+drug+penetration+of+echinocandin+antifungals+at+the+site+of+infection+in+an+intra-abdominal+abscess+model.">Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model.</a> Antimicrob Agents Chemother. , (2017).</li><li>Pascal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+modeling+identifies+drug-uptake+history+as+predictor+of+tumor+drug+resistance+and+nano-carrier-mediated+response.">Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response.</a> ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Espacialmente resolvidos de quantificação de drogas em lesões de TB pulmonares é necessária para determinar se a exposição da droga atinge esterilizantes concentrações de populações bacterianas que residem dentro dos compartimentos diferentes lesão. LCM-LC/MS método descrito aqui permite a quantificação absoluta de fármacos anti-TB dentro de todos os compartimentos de lesão, incluindo o caseum ricos em bactérias, usando apenas 1-3 seções de tecido no total. Homogeneização de tecidos tradicionais e a...

A capacidade de espacialmente resolver e quantificar os níveis de droga é um requisito fundamental para determinar se medicamentos anti-tuberculose alcançar subpopulações bacterianas dentro de lesões pulmonares em concentrações1de esterilização. De particular importância é determinar a penetração de drogas para o núcleo necrótico da lesão (chamado de caseum), que normalmente contém o maior número de bacilos e pode ser mal acessível às drogas devido à ausência de vascularização.
Métodos tradicionais para avaliar a penetração da lesão, que envolvem a homogeneização de lesões pulmonares extirpadas seguido por extração com solventes e análise de espectrometria de massas (LC/MS) cromatografia líquida, são altamente sensíveis e seletiva para as drogas de interesse. No entanto, estes métodos oferecem informação espacial pobre, limitada ao tamanho do original tecido homogeneizado. Espectrometria de massa-baseado imagem abordagens, tais como dessorção laser assistida por matriz (MALDI) de ionização2,3, desorção electrospray ionização (DESI)4 ou extração de superfície líquido-reforçada5, 6 oferecem recursos de imagem altamente espacialmente resolvidos, mas a quantificação directa pode ser extremamente desafiador ou impossível devido a efeitos de supressão de íon heterogêneos e diferentes eficiências de extração do analito da célula de várias ou7tipos de tecido. Além disso, abordagens de imagem mais diretas tecido MS são inerentemente menos sensíveis do que a LC/MS, devido à falta de separação cromatográfica de espécie endógena competindo por ionização e a baixa eficiência de extração com solvente da droga do tecido.
Do laser microdissection de captura (LCM) combinado com análise de LC/MS foi aplicado rotineiramente para isolar e caracterizar regiões distintas de tecido para proteômica estuda8,9 e recentemente utilizada para quantificação de drogas em uma dose tecido animal10. Aqui nós apresentamos um protocolo otimizado aplicando LCM combinado com análise de LC/MS (LCM-LC/MS) para quantificar a fármacos anti-TB dentro de compartimentos distintos granuloma. No processo do laser microdissection captura, um laser UV é focado com o objetivo de microscópio para a seção de tecido, que corta e isola a área de tecido desejado, seguindo um caminho definido pelo usuário. Para gravidade assistida LCM (a técnica utilizada para esta pesquisa), a seção de tecido é montada sobre um slide de membrana fina de polímero (PET ou caneta) e o tecido é capturado em um tampão de tubo coleção situado abaixo do slide. As drogas são extraídas do tecido excisado e quantificados utilizando abordagens padrão de LC/MS. A quantidade de tecido devem ser coletados em última análise, é determinada a concentração desejada do fármaco presente nos tecidos e a sensibilidade do método LC/MS. Para a maioria das análises de drogas dosado em níveis terapêuticos e analisados utilizando um espectrômetro de massa de rotina triplo quadrupolo, 3 milhões µm2 (3 mm2) de tecido, área de superfície é suficiente.
Este protocolo descreve a poderosa combinação de perfis espaciais e quantificação completa oferecido pela LCM-LC/MS, fornecendo a concentração absoluta de drogas dentro de todos os compartimentos de granulomas TB. A técnica também pode ser aplicada para determinar as concentrações de drogas em muitos diferentes tecidos doentes, fornecendo informações de descoberta e desenvolvimento de drogas vitais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">New Zealand White rabbits</td>
			<td style="width:159px;">Covance</td>
			<td style="width:155px;">N/A</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">HN878 Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td style="width:159px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:155px;">NR-13647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td>
			<td style="width:159px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:155px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Virbac</td>
			<td style="width:155px;">710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Acetonitrile (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A955-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Methanol (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A456-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Formic Acid (LC-MS grade)</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">A117-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Water (LC-MS grade)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">W6212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">0.2 mL flat-cap PCR tubes</td>
			<td style="width:159px;">Corning</td>
			<td style="width:155px;">07-200-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Steel frames, PET-membrane</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">11505151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Premium Frosted Microscope Slides</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#160;96 Deep well plate 2.0ML PP RB&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">NC0363259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:273px;">Zorbax SB-C8&#160;column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 &#956;m)</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;">820631-001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">&#34;Zipper&#8221; Seal Sample Bags</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">01-816-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Name</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Equipment</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">CM1850&#160;cryostat</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica CM1860 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Laser Microdissection System 6500</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:155px;">Discontinued</td>
			<td>Leica LMD 6 is the current model</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">Agilent 1260 Infinity II HPLC&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Agilent</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:273px;">API 4000 QTRAP Mass Spectrometer</td>
			<td style="width:159px;">Sciex</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatial quantification of drugs in pulmonary tuberculosis lesions by laser capture microdissection liquid chromatography mass spectrometry (lcm-lc/ms)

Tuberculose ainda é das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Melhorias aos regimes da droga existentes e o desenvolvimento de novas terapêuticas são urgentemente necessárias. A capacidade das drogas de TB dosadas para alcançar e esterilizar as bactérias dentro mal vascularizado necróticas regiões (caseum) de granulomas pulmonares é crucial para a intervenção terapêutica bem sucedida. Regimes terapêuticos eficazes, portanto, devem conter drogas com propriedades de penetração de caseum favorável. Métodos atuais de LC/MS para quantificação dos níveis da droga em tecidos biológicos têm limitado a capacidades de resolução espacial, tornando difícil determinar com precisão a concentrações de drogas absoluto dentro de compartimentos de tecido pequenas tais como aqueles encontrados dentro granulomas necróticos. Aqui nós apresentamos um protocolo combinando laser captura microdissection (LCM) das regiões de tecidos patologicamente distinta com quantificação de LC/MS. Esta técnica fornece quantificação absoluta de drogas dentro de granuloma caseum, envolvendo a lesão celular e tecido sem envolvimento pulmonar e, portanto, com precisão determina se as concentrações bactericidas estão a ser alcançadas. Para além da investigação da tuberculose, a técnica tem muitas aplicações potenciais para espacialmente resolvidos de quantificação de drogas em tecidos doentes.

Uma visão geral da abordagem LCM-LC/MS é mostrada na Figura 1. Após a esterilização o tecido por irradiação gama, todas as etapas subsequentes (a partir de tecido de corte em diante) ocorrem fora do BSL3 condições. A Figura 2 mostra a lesão seções biópsia antes e após o isolamento do tecido por LCM. Áreas necrosadas e celulares de lesões TB podem ser facilmente identificadas e isoladas por inspeção visual de ima...

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Aqui, descrevemos um protocolo usando laser captura microdissection juntamente com análise de LC/MS espacialmente-quantificar as distribuições de drogas dentro de granulomas de tuberculose pulmonar. A abordagem tem ampla aplicabilidade para quantificar as concentrações de droga dentro de tecidos em alto detalhe espacial.

Spatial quantificação de drogas em lesões de tuberculose pulmonar por Laser capturar Microdissection líquido cromatografia de espectrometria de massa (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

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Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Lower Respiratory Tract Infections

SCIENTISTS IN ACTION

9.0K visualizações.  Rutgers, The State University of New Jersey. Aqui, descrevemos um protocolo usando laser captura microdissection juntamente com análise de LC/MS espacialmente-quantificar as distribuições de drogas dentro de granulomas de tuberculose pulmonar. A abordagem tem ampla aplicabilidade para quantificar as concentrações de droga dentro de tecidos em alto detalhe espacial.

Vídeo: Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Magnetic Resonance Imaging Quantification of Pulmonary Perfusion using Calibrated Arterial Spin Labeling

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, fraction (FIO2) = 0.21) hypoxia (FIO2 = 0.125), and hyperoxia 
(FIO2 = 1.00). In addition, the physiological responses of the subject are monitored in the MR scan environment. MR images 
were obtained on a 1.5 T GE MRI scanner during a breath hold from a sagittal slice in the right lung at functional residual capacity. An arterial 
spin labeling sequence (ASL-FAIRER) was used to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow 1,2 and a multi-echo fast 
gradient echo (mGRE) sequence 3 was used to quantify the regional proton (i.e. H2O) density, allowing the quantification 
of density-normalized perfusion for each voxel (milliliters blood per minute per gram lung tissue). 
With a pneumatic switching valve and facemask equipped with a 2-way non-rebreathing valve, different oxygen concentrations 
were introduced to the subject in the MR scanner through the inspired gas tubing. A metabolic cart collected expiratory gas via expiratory tubing. Mixed expiratory O2 and CO2 concentrations, oxygen consumption, carbon dioxide production, respiratory exchange ratio, 
respiratory frequency and tidal volume were measured. Heart rate and oxygen saturation were monitored using pulse-oximetry. 
Data obtained from a normal subject showed that, as expected, heart rate was higher in hypoxia (60 bpm) than during normoxia (51) or hyperoxia (50) and the arterial oxygen saturation (SpO2) was reduced during hypoxia to 86%. Mean ventilation was 8.31 L/min BTPS during hypoxia, 7.04 L/min during normoxia, and 6.64 L/min during hyperoxia. Tidal volume was 0.76 L during hypoxia, 0.69 L during normoxia, and 0.67 L during hyperoxia. 
Representative quantified ASL data showed that the mean density normalized perfusion was 8.86 ml/min/g during hypoxia, 8.26 ml/min/g during normoxia and 8.46 ml/min/g during hyperoxia, respectively. In this subject, the relative dispersion4, an index of global heterogeneity, was increased in hypoxia (1.07 during hypoxia, 0.85 during normoxia, and 0.87 during hyperoxia) while the fractal dimension (Ds), another index of heterogeneity reflecting vascular branching structure, was unchanged (1.24 during hypoxia, 1.26 during normoxia, and 1.26 during hyperoxia). 
Overview. This protocol will demonstrate the acquisition of data to measure the distribution of pulmonary perfusion noninvasively under conditions of normoxia, hypoxia, and hyperoxia using a magnetic resonance imaging technique known as arterial spin labeling (ASL). 
Rationale: Measurement of pulmonary blood flow and lung proton density using MR technique offers high spatial resolution images which can be quantified and the ability to perform repeated measurements under several different physiological conditions. In human studies, PET, SPECT, and CT are commonly used as the alternative techniques. However, these techniques involve exposure to ionizing radiation, and thus are not suitable for repeated measurements in human subjects.

A MR imaging method to study the distribution of pulmonary blood flow under a variety of physiological conditions, in this case exposure to three different inspired oxygen concentrations: hypoxia, normoxia, and hyperoxia, is described. This technique utilizes human pulmonary physiology research techniques in an MR scanning environment.

Quantificação Imagem por Ressonância Magnética de perfusão pulmonar usando Labeling rotação Calibrado Arterial

This demonstrates a MR imaging method to measure the spatial distribution of pulmonary blood flow in healthy subjects 
during normoxia (inspired O2, ...

Medicina

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson&#039;s Disease

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

Espectrometria de Massa MALDI imagem de neuropeptídeos na Doença de Parkinson

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

Protocolo melhorado para microdissecção a laser de ilhotas pancreáticas humanas a partir de espécimes cirúrgicos

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Quantitative Mass Spectrometric Profiling of Cancer-cell Proteomes Derived From Liquid and Solid Tumors

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic biomarkers. However, methods for quantitative proteomic characterization of patient-derived tumors and in particular their cellular subpopulations are largely lacking. Here we describe an experimental set-up that allows quantitative analysis of proteomes of cancer cell subpopulations derived from either liquid or solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry followed by bioinformatic data analysis. To enrich specific cellular subsets, liquid tumors are first immunophenotyped by flow cytometry followed by FACS-sorting; for solid tumors, laser-capture microdissection is used to purify specific cellular subpopulations. In a second step, proteins are extracted from the purified cells and subsequently combined with a tumor-specific, SILAC-labeled spike-in standard that enables protein quantification. The resulting protein mixture is subjected to either gel electrophoresis or Filter Aided Sample Preparation (FASP) followed by tryptic digestion. Finally, tryptic peptides are analyzed using a hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer, and the data obtained are processed with bioinformatic software suites including MaxQuant. By means of the workflow presented here, up to 8,000 proteins can be identified and quantified in patient-derived samples, and the resulting protein expression profiles can be compared among patients to identify diagnostic proteomic signatures or potential drug targets.

In-depth analyses of cancer cell proteomes facilitate identification of novel drug targets and diagnostic biomarkers. We describe an experimental workflow for quantitative analysis of (phospho-)proteomes in cancer cell subpopulations derived from liquid and solid tumors. This is achieved by combining cellular enrichment strategies with quantitative Super-SILAC-based mass spectrometry.

Quantitative Mass Spectrometric Profiling de proteomas de células do cancro da derivadas do líquido e tumores sólidos

In-depth analyses of cancer cell proteomes are needed to elucidate oncogenic pathomechanisms, as well as to identify potential drug targets and diagnostic ...

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

Captura de Laser Microdissection de Próstata Humano Epithelium para Análise de RNA

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types.  Healthy prostate is comprised of ...

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a specific anatomical region. Within the brain, metals have a highly compartmentalized distribution, depending on the primary function they play within the central nervous system. Imaging the spatial distribution of metals has provided unique insight into the biochemical architecture of the brain, allowing direct correlation between neuroanatomical regions and their known function with regard to metal-dependent processes. In addition, several age-related neurological disorders feature disrupted metal homeostasis, which is often confined to small regions of the brain that are otherwise difficult to analyze. Here, we describe a comprehensive method for quantitatively imaging metals in the mouse brain, using laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) and specially designed image processing software. Focusing on iron, copper and zinc, which are three of the most abundant and disease-relevant metals within the brain, we describe the essential steps in sample preparation, analysis, quantitative measurements and image processing to produce maps of metal distribution within the low micrometer resolution range. This technique, applicable to any cut tissue section, is capable of demonstrating the highly variable distribution of metals within an organ or system, and can be used to identify changes in metal homeostasis and absolute levels within fine anatomical structures.

Imaging Metals in Brain Tissue by Laser Ablation - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry LA-ICP-MS

Quantitatively mapping metals in tissue by laser ablation - inductively coupled plasma - mass spectrometry (LA-ICP-MS) is a sensitive analytical technique that can provide new insight into how metals participate in normal function and disease processes. Here, we describe a protocol for quantitatively imaging metals in thin sections of mouse neurological tissue.

Metais de imagem no tecido cerebral por Laser Ablation - plasma indutivamente acoplado - Espectrometria de Massa (LA-ICP-MS)

Metals are found ubiquitously throughout an organism, with their biological role dictated by both their chemical reactivity and abundance within a ...

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity is disturbed in gastrointestinal, cardiovascular and metabolic diseases, which may result in easier access of biologically active compounds, such as gut bacterial metabolites, to the bloodstream. Thus, the permeability of the GBB may be a marker of both intestinal and extraintestinal diseases. Furthermore, the increased penetration of bacterial metabolites may affect the functioning of the entire organism.
Commonly used methods for studying the GBB permeability are performed ex vivo. The accuracy of those methods is limited, because the functioning of the GBB depends on intestinal blood flow. On the other hand, commonly used in vivo methods may be biased by liver and kidney performance, as those methods are based on evaluation of urine or/and peripheral blood concentrations of exogenous markers. Here, we present a direct measurement of GBB permeability in rats using an in vivo method based on portal blood sampling, which preserves intestinal blood flow and is virtually not affected by the liver and kidney function. 
Polyurethane catheters are inserted into the portal vein and inferior vena cava just above the hepatic veins confluence. Blood is sampled at baseline and after administration of a selected marker into a desired part of the gastrointestinal tract. Here, we present several applications of the method including (1) evaluation of the colon permeability to TMA, a gut bacterial metabolite, (2) evaluation of liver clearance of TMA, and (3) evaluation of a gut-portal blood-liver-peripheral blood pathway of gut bacteria-derived short-chain fatty acids. Furthermore, the protocol may also be used for tracking intestinal absorption and liver metabolism of drugs or for measurements of portal blood pressure.

An In Vivo Method for Evaluating the Gut-Blood Barrier and Liver Metabolism of Microbiota Products

The access of nutrients, microbiota metabolites and medicines to the circulation is controlled by the gut-blood barrier (GBB). We describe a direct method for measuring the GBB permeability in vivo, which, in contrast to commonly used indirect methods, is virtually not affected by liver and kidney functions.

Um método In Vivo para avaliar a barreira de sangue do intestino e metabolismo hepático da Microbiota produtos

The gut-blood barrier (GBB) controls the passage of nutrients, bacterial metabolites and drugs from intestinal lumen to the bloodstream. The GBB integrity ...

Immunoglobulin G N-Glycan Analysis by Ultra-Performance Liquid Chromatography

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease susceptibility, drug target discovery, and precision medicine. Alternative IgG N-glycans have been reported in several common chronic diseases and suggested to have great potential in clinical applications (i.e., biomarkers for diagnosis and prediction of diseases). IgG N-glycans are widely characterized using the method of hydrophilic interaction chromatography (HILIC) ultra-performance liquid chromatography (UPLC). UPLC is a stable detection technology with good reproducibility and high relative quantitative accuracy. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated, and glycan composition and relative abundance in plasma are characterized.

Immunoglobulin G (IgG) N-glycan is characterized using hydrophilic interaction chromatography UPLC. In addition, the structure of IgG N-glycan is clearly separated. Presented here is an introduction to this experimental method so that it can be widely used in research settings.

Análise de imunoglobulina G N-Glycan por cromatografia líquida de ultra-desempenho

Glycomics is a new subspecialty in omics system research that offers significant potential in discovering next-generation biomarkers for disease ...

Analysis of Raw and Processed Cyperi Rhizoma Samples Using Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry in Rats with Primary Dysmenorrhea

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is enhanced after processing with vinegar, CR processed with vinegar (CRV) is generally used clinically. However, the mechanism by which the analgesic effect is enhanced by vinegar processing is unclear. In this study, the ultra-high pressure liquid chromatographytandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) technique was used to examine changes in the blood levels of the exogenous constituents and metabolites between CR-treated and CRV-treated rats with dysmenorrhea. The results revealed differing levels of 15 constituents and two metabolites in the blood of these rats. Among them, the levels of (-)-myrtenol and [(1R,2S,3R,4R)-3-hydroxy-1,4,7,7-tetramethylbicyclo[2.2.1]hept-2-yl]acetic acid in the CRV group were considerably higher than in the CR group. CRV reduced the level of 2-series prostanoids and 4-series leukotrienes with proinflammatory, platelet aggregation, and vasoconstriction activities and provided analgesic effects by modulating arachidonic acid and linoleic acid metabolism and the biosynthesis of unsaturated fatty acids. This study revealed that vinegar processing enhances the analgesic effect of CR and contributes to our understanding of the mechanism of action of CRV.

Here, a comparative analysis of raw and processed Cyperi rhizoma (CR) samples is presented using ultra-high performance liquid chromatography-high-resolution tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) in rats with primary dysmenorrhea. The changes in blood levels of the metabolites and the sample constituents were examined between rats treated with CR and CR processed with vinegar (CRV).

Análise de Amostras de Cyperi Rhizoma Cru e Processadas Usando Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massas em Tandem em Ratos com Dismenorreia Primária

Cyperi rhizoma (CR) is widely used in gynecology and is a general medicine for treating women's diseases in China. Since the analgesic effect of CR is ...

Captura de amostras de tecido de fibrose submucosa oral para análise espacial-ômica

Isolation of Cells with Morphological and Spatial Information from Oral Submucous Fibrosis Samples by Laser Capture Microdissection

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina propria and the submucosa are often found on histopathological slides. Epithelial dysplasia, epithelial atrophy, and senescent fibroblasts have been proposed to be associated with the malignant transformation of OSF. However, because of the heterogeneity of potentially malignant oral disorders and oral squamous cell carcinoma, it is difficult to identify the specific molecular mechanisms of malignant transformation in OSF. Here, we present a method to obtain a small number of epithelial or mesenchymal cells carrying morphological data and spatial information by laser capture microdissection on formalin-fixed paraffin-embedded tissue slides. Using a microscope, we can precisely capture microscale (~500 cells) dysplastic or atrophic epithelial tissue and fibrotic subepithelial tissue. The extracted cells can be evaluated by genome or transcriptome sequencing to acquire genomic and transcriptomic data with morphological and spatial information. This approach removes the heterogeneity of bulk OSF tissue sequencing and the interference caused by cells in non-lesioned areas, allowing for precise spatial-omics analysis of OSF tissue.

Autor em destaque: desvendando os mistérios das neoplasias potenciais orais 

Laser capture microdissection of oral submucous fibrosis tissues allows for precise extraction of cells from histological regions of interest for the analysis of multi-omics data with morphological and spatial information.

Isolamento de Células com Informações Morfológicas e Espaciais de Amostras de Fibrose Submucosa Oral por Microdissecção por Captura a Laser

Oral submucous fibrosis (OSF) is a common type of potentially malignant disorder in the oral cavity. The atrophy of epithelium and fibrosis of the lamina ...