Esse método pode ajudar a responder a questões-chave na biologia evolutiva, como a evolução da comunicação social. As principais vantagens dessa técnica são que ela fornece evidência direta para forma e presença de musculatura mimética. Elimina adivinhação no processo de dissecção, e preserva camadas musculares.
Combinado com o DiceCT, a dissecção reversa é o novo padrão-ouro para a investigação muscular mimética. Para começar, siga o protocolo de texto que acompanha a fixação e preparação dos espécimes. Em seguida, transfira o espécime para o capô da fumaça.
Em seguida, enxágue o espécime por várias horas em água corrente. Uma vez que o espécime tenha sido enxaguado, bata-o seco com toalhas de papel, e transfira-o para uma estação de trabalho. Com o cérebro e a calvária excessivamente removidos, faça uma incisão perto da região glabella do crânio, e outra ao longo do aspecto caudal do crânio, onde o osso craniano está intacto.
Palpato para a protuberância occipital externa na borda caudal do crânio. Isso marca a área onde o crânio encontra a coluna vertebral. Em seguida, use um bisturi e faça uma incisão midline, começando pela protuberância occipital externa.
Corte o espécime rostrally sobre a região parietal e frontal do crânio. Continue e passe sobre a região orbital entre os olhos, descendo a região nasal, por todo o caminho através da área nasal externa entre os nares. Em seguida, faça um corte na mandíbula entre os incisivos inferior e central, e mova o bisturi caudalmente em direção à clavícula.
Neste ponto, escolha um lado da máscara facial, e solte-a do crânio, deixando o outro lado no lugar. Começando na região occipital, use o bisturi para cortar a máscara facial, incluindo musculatura mimética, longe do osso occipital do crânio, puxando a máscara rostrally e lateralmente. Corte o músculo occipitalis longe do crânio, deixando uma pequena quantidade do músculo para trás no crânio, para que seu acessório ainda possa ser visualizado, uma vez que a máscara facial tenha sido removida.
Deixando parte do músculo para trás no crânio ósseo e cartilaginoso, os acessórios podem ser preservados e registrados posteriormente. Uma vez que a orelha externa é atingida, localize os músculos auriculares. Corte esses músculos, de modo que uma pequena porção de cada músculo permanece com o crânio.
Em seguida, corte a cartilagem elástica que prende a orelha externa ao crânio. Continue puxando a máscara rostrally, e libere cada músculo mimético do crânio, deixando uma pequena porção de cada músculo para trás no crânio. Uma vez que haja uma máscara facial intacta de um lado do crânio, permita que ela fique de fora com a musculatura exposta ao ar, por uma a três horas, dependendo do tamanho do espécime.
Isso vai dessecar o tecido conjuntivo na máscara facial, e aumentar o contraste de cor entre o músculo e o tecido conjuntivo. Com o contraste entre músculo e tecido conjuntivo agora aumentado, use o bisturi número três, fórceps e micro tesouras para remover tecido conjuntivo suficiente, a fim de visualizar a musculatura. A camada superficial de mículatura mimética nesta dissecção reversa, levanta suavemente e separa a camada profunda de musculatura da camada superficial, e remove os tecidos conjuntivos ao redor da musculatura superficial.
Quando terminar, devolva a máscara facial resultante de volta à formalina. O procedimento pode ser pausado aqui, antes de passar para uma dissecção adicional, ou antes de continuar a coloração. Em cada etapa interveniente, permita tempo suficiente de secagem da máscara facial, para que o tecido conjuntivo possa ser facilmente discernido a partir do tecido muscular.
Para que a musculatura mimética seja visualizada usando tomografia computadorizada, colorifique as máscaras usando uma solução de iodo colocando a máscara na solução de coloração de Lugol, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. O processo de coloração geralmente leva cerca de duas semanas, em solução de 1,75% Lugol. No entanto, esse tempo varia, dependendo de vários fatores.
Recomenda-se a varredura intermitente com ajuste de coloração acompanhada. Para a tomografia computadorizada, primeiro prepare a máscara facial usando palitos de madeira para montar a máscara facial em um material de baixa densidade, como espuma floral. Isso eliminará quaisquer rugas na máscara e limitará seu movimento à medida que seca ligeiramente durante o exame.
Em seguida, coloque o espécime em um recipiente de baixa densidade, e fixe-o no lugar. Uma vez seguro, coloque a amostra no scanner, feche a porta e ligue os raios-X. Em seguida, configure os parâmetros da tomografia computadorizada para uma tomografia computadorizada de raios-X de alta resolução.
Usando espaçamento entre fatias e distância entre pixels de cerca de 0,05 milímetros para essas varreduras, como os pequenos fascicles serão obscurecidos em menor resolução. Se os fascicles não forem totalmente visualizados, devido à sobretenção, coloque a máscara facial em uma solução de despetração, como 10% de formalina, ou 5% de tiossulfito de sódio para remover parte da mancha. Depois de ajustar a coloração, escaneie novamente a máscara facial e continue fazendo os ajustes necessários, até que todos os fascicles possam ser totalmente visualizados.
Usando dissecção reversa para criar uma máscara facial, uma representação mais completa do músculo mimético às vezes pode ser vista, do que na metodologia de dissecção tradicional. Este método funciona em uma variedade de tamanhos corporais, desde o pequeno corpo do Sagui, até primatas de grande porte, como o chimpanzé. Em primatas de pequeno corpo que têm músculos faciais gracil, parte da musculatura facial pode ser indistinguível do tecido conjuntivo circundante, podendo ser perdida durante a dissecção.
Uma mancha de iodo, como a de Lugol, pode melhorar o contraste e ajudar a resolver tanto os músculos miméticos individuais, quanto os fascicles musculares individuais, e pela primeira vez, obter volumes musculares inteiros desses músculos gracil. Como mostrado aqui, alguns dos músculos muito pequenos, associados ao ouvido externo, são claramente visíveis nos exames DiceCT. Não é incomum que esses músculos sejam perdidos em alguns procedimentos de dissecção reversa, talvez devido ao seu pequeno tamanho.
Esta renderização de volume tridimensional permite o limiar de volume básico e mapeamento de cores, para visualizar a musculatura com mais facilidade, do que apenas com o interrogatório. Aqui você pode ver que os fascicles musculares individuais são claramente visíveis na seção transversal, tornando a dissecção digital viável. Ao tentar este procedimento, é importante ter em mente que você deve se mover lentamente, com cautela e com deliberação, já que este método é destrutivo por natureza.
Após esse procedimento, outros métodos, como o processamento histológico, podem ser usados para responder a perguntas adicionais, como diâmetro de fibra, ou digitação de fibra de miosina. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia evolutiva, explorarem a evolução da expressão facial e da comunicação visual em mamíferos não humanos e em humanos. Não se esqueça, que trabalhar com formalina, e um bisturi carregado pode ser extremamente perigoso.
Precauções, como enxaguar sua amostra e saber onde seu bisturi está o tempo todo, devem ser tomadas durante a realização deste procedimento.
