Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia evolutiva, come l'evoluzione della comunicazione sociale. I principali vantaggi di questa tecnica sono che fornisce prove dirette della forma e della presenza di muscolatura mimetica. Elimina le congetture nel processo di dissezione e preserva gli strati muscolari.
In combinazione con DiceCT, la dissezione inversa è il nuovo gold standard per l'indagine muscolare mimetica. Per iniziare, seguire il protocollo di testo di accompagnamento per la fissazione e la preparazione del campione. Quindi, trasferire il campione nella cappa dei fumi.
Quindi, sciacquare il campione per diverse ore in acqua corrente. Una volta risciacquato il campione, asciugarlo con tovaglioli di carta e trasferirlo in una stazione di lavoro. Con il cervello e la calvaria sovrasdentale rimossi, fai un'incisione vicino alla regione glabella del cranio e un'altra lungo l'aspetto caudale del cranio, dove l'osso cranica è intatto.
Palpa per la protuberanza occipitale esterna sul bordo caudale del cranio. Questo segna l'area in cui il cranio incontra la colonna vertebrale. Quindi usa un bisturi e fai un'incisione della linea mediana, a partire dalla protuberanza occipitale esterna.
Tagliare l'esemplare rostralmente sulla regione parietale e frontale del cranio. Continua e passa sopra la regione orbitale tra gli occhi, lungo la regione nasale, attraverso l'area nasale esterna tra i nares. Quindi, fai un taglio sulla mandibola tra gli incisivi inferiori e centrali e sposta il bisturi caudally verso la clavicola.
A questo punto, scegli un lato della maschera facciale e rilascialo dal cranio, lasciando l'altro lato in posizione. A partire dalla regione occipitale, utilizzare il bisturi per tagliare la maschera facciale, compresa la muscolatura mimetica, lontano dall'osso occipitale del cranio, tirando la maschera rostralmente e lateralmente. Tagliare il muscolo occipitalis lontano dal cranio, lasciando una piccola quantità di muscolo sul cranio, in modo che il suo attaccamento possa ancora essere visualizzato, una volta rimossa la maschera facciale.
Lasciando una parte del muscolo sul cranio osseo e cartilagineo, gli allegati possono essere conservati e registrati in un secondo momento. Una volta colpito l'orecchio esterno, individuare i muscoli auricolari. Tagliare questi muscoli, in modo che una piccola porzione di ogni muscolo rimanga con il cranio.
Quindi, tagliare la cartilagine elastica attaccando l'orecchio esterno al cranio. Continua a tirare la maschera rostralmente e rilascia ogni muscolo mimetico dal cranio, lasciando una piccola porzione di ogni muscolo sul cranio. Una volta che c'è una maschera facciale intatta da un lato del cranio, consentirgli di sedersi con la muscolatura esposta all'aria, per una o tre ore, a seconda delle dimensioni dell'esemplare.
Ciò assacicherà il tessuto connettivo sulla maschera facciale e aumenterà il contrasto di colore tra muscolo e tessuto connettivo. Con il contrasto tra muscolo e tessuto connettivo ora migliorato, utilizzare il bisturi numero tre, le forcep e le micro forbici per rimuovere il tessuto connettivo sufficiente, al fine di visualizzare la muscolatura. Lo strato superficiale di muscolatura mimetica in questa dissezione inversa, solleva e separa delicatamente lo strato profondo di muscolatura dallo strato superficiale e rimuovi i tessuti connettivi che circondano la muscolatura superficiale.
Al termine, riportare la maschera facciale risultante in formalina. La procedura può essere sospesa qui, prima di passare a un'ulteriore dissezione o prima di continuare a macchiare. Ad ogni fase di intervento, consentire un tempo di asciugatura sufficiente della maschera facciale, in modo che il tessuto connettivo possa essere facilmente discernere dal tessuto muscolare.
Affinché la muscolatura mimetica possa essere visualizzato utilizzando la scansione CT, macchiare le maschere utilizzando una soluzione di iodio posizionando la maschera nella soluzione di colorazione di Lugol, come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Il processo di colorazione richiede generalmente circa due settimane, nella soluzione dell'1,75% Lugol. Tuttavia, questa tempistica varia, a seconda di diversi fattori.
Si consiglia la scansione intermittente con regolazione accompagnata della colorazione. Per la scansione CT, preparare prima la maschera facciale utilizzando stuzzicadenti in legno per montare la maschera facciale su un materiale a bassa densità, come la schiuma floreale. Ciò eliminerà eventuali rughe nella maschera e limiterà il suo movimento mentre si asciuga leggermente durante la scansione.
Quindi, posizionare il campione in un contenitore a bassa densità e fissarlo in posizione. Una volta sicuro, posizionare il campione nello scanner, chiudere la porta e accendere i raggi X. Quindi, impostare i parametri di scansione CT per una tomografia computerizzata a raggi X ad alta risoluzione.
Utilizzo della spaziatura tra porzioni e della distanza inter pixel di circa 0,05 millimetri per queste scansioni, poiché i piccoli fascicoli verranno oscurati a risoluzione inferiore. Se i fascicoli non sono in grado di essere completamente visualizzati, a causa della colorazione troppo, posizionare la maschera facciale in una soluzione di de-macchia come il 10% di formalina o il 5% di tiosolato di sodio per rimuovere parte della macchia. Dopo aver regolato la colorazione, scansionare nuovamente la maschera facciale e continuare a effettuare le regolazioni necessarie, fino a quando tutti i fascicoli non sono in grado di essere completamente visualizzati.
Usando la dissezione inversa per creare una maschera facciale, a volte si può vedere una rappresentazione più completa del muscolo mimetico, rispetto alla tradizionale metodologia di dissezione. Questo metodo funziona su una gamma di dimensioni del corpo, dal piccolo, piccolo corpo del Marmoset, ai primati di grandi dimensioni come lo scimpanzé. Nei primati di piccolo corpo che hanno muscoli facciali gracil, parte della muscolatura facciale può essere indistinguibile dal tessuto connettivo circostante e può essere persa durante la dissezione.
Una macchia di iodio, come quello di Lugol, può migliorare il contrasto e aiutare a risolvere sia i singoli muscoli mimetici, sia i singoli fascicoli muscolari, e, per la prima volta, ottenere interi volumi muscolari di questi muscoli gracil. Come mostrato qui, alcuni dei muscoli molto piccoli, associati all'orecchio esterno, sono chiaramente visibili nelle scansioni DiceCT. Non è raro che questi muscoli siano persi in alcune procedure di dissezione inversa, forse a causa delle loro piccole dimensioni.
Questo rendering tridimensionale del volume consente la soglia del volume di base e la mappatura del colore, per visualizzare la muscolatura più facilmente, piuttosto che con il solo esame incrociato. Qui potete vedere che i singoli fascicoli muscolari sono chiaramente visibili nella sezione trasversale, rendendo possibile la dissezione digitale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente che è necessario muoversi lentamente, con cautela e con deliberazione, poiché questo metodo è di natura distruttiva.
Seguendo questa procedura, altri metodi, come l'elaborazione istologica, possono essere utilizzati per rispondere a domande aggiuntive, come il diametro della fibra o la tipizzazione della fibra di miosina. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia evolutiva, per esplorare l'evoluzione dell'espressione facciale e della comunicazione visiva nei mammiferi non umani e negli esseri umani. Non dimenticare che lavorare con la formalina e un bisturi caricato può essere estremamente pericoloso.
Le precauzioni, come il risciacquo del campione e la conoscenza di dove si trova il bisturi in ogni momento, devono essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
