Este é um protocolo que estuda como o intestino delgado lida com materiais de diferentes propriedades físicas e como distribui esses materiais no espaço. É uma ferramenta complementar em nosso estudo da mecanossensibilidade intestinal. As principais vantagens deste protocolo são que ele pode ser usado para estudar materiais ou misturas com diferentes propriedades físicas e que a resolução nos permite resolver trânsitos regionais em segmentos intestinais curtos.
Esta técnica contribui para a nossa compreensão da mecanossensibilidade intestinal. Isso nos ajuda a entender como o intestino delgado toma decisões de trânsito com base nas pistas mecânicas que recebe do conteúdo intraluminal. Para começar, prepare a gavagem anexando um tubo de alimentação de espessura de calibre 18 e comprimento de 50 milímetros a uma seringa de 1 mililitro e desenhando 200 microlitros de solução RITC ou solução de microesfera.
Em seguida, restrinja manualmente o animal em jejum usando a técnica de contenção com uma mão e, em seguida, insira suavemente o tubo de alimentação através da boca e do esôfago do rato até que ele entre no estômago. Uma vez inserido, expulse lentamente o conteúdo da seringa para o estômago e remova cuidadosamente o tubo do rato. Após a gavagem, devolva o rato à gaiola.
Antes de iniciar as dissecções, ligue o instrumento de imagem in vivo para que ele atinja a temperatura desejada. Após a eutanásia, coloque o rato em decúbito dorsal em estágio de dissecção e fixe seus quatro apêndices no palco para acessar o abdômen. Em seguida, molhe a superfície do abdômen com etanol a 70%.
Em seguida, use pinça de micro-dissecção para puxar a pele e fazer uma incisão transversal usando tesoura cirúrgica afiada 1 centímetro acima do ânus. Para expor a cavidade intraperitoneal, continue a incisão verticalmente até o abdômen até a caixa torácica. Manuseie suavemente os intestinos e aprecie sua orientação na cavidade abdominal antes de manipulá-los.
Corte o proximal à junção gastroesofágica, separando assim o estômago do esôfago e desvende suavemente o cólon, o ceco e o intestino delgado, puxando lentamente na direção oposta. Use uma tesoura de microdissecação para separar os anexos do mesentério aos intestinos. Mais tarde, usando a pinça, transfira os intestinos dissecados para a folha de medição.
Coloque o estômago a 0 milímetros e organize os intestinos ao longo da régua até 200 milímetros, em seguida, corte o intestino a 200 milímetros com tesoura de micro-dissecção e repita este procedimento de alinhamento intestinal. Uma vez que o tecido esteja disposto na régua, organize o ceco em paralelo com o tecido, mas não em contato direto com ele. Coloque a folha de medição com o tecido dissecado em uma área escura para que a fluorescência possa ser preservada até a hora da imagem.
Para iniciar a geração de imagens ex vivo, abra o software de imagem. Faça login e inicialize o instrumento de imagem para estar pronto para a aquisição de imagens. Para gavagem RITC, defina Excitação em 535 nanômetros e Emissões, 600 nanômetros.
Enquanto para contas de microesferas verdes, defina Excitação em 465 nanômetros e Emissão em 520 nanômetros. Agora, defina a exposição como Auto e selecione o campo de visão. Depois de garantir que os intestinos não se deslocaram durante o transporte, coloque a folha de medição no instrumento dentro do campo de visão.
Feche com segurança a porta do instrumento e selecione Instantâneo para fotografar o campo de visão. Salve as imagens coletadas em uma unidade flash para análise. Em seguida, salve capturas individuais das imagens fluorescentes e fotográficas.
Uma sobreposição da fotografia e fluorescência indica a localização de materiais fluorescentes no trato gastrointestinal. Abra os arquivos de imagem fluorescentes e de fotografia no software de edição de imagens para análise. Ajuste o tamanho do pixel de ambas as imagens para ter as dimensões exatas e feche o arquivo de fotografia.
Para a imagem fluorescente, use uma ferramenta de borracha para remover o plano de fundo e torná-lo transparente. Crie uma nova camada. Escolha um preenchimento preto para a camada e arraste a camada para ficar abaixo da camada com a imagem fluorescente e faça um fundo totalmente preto.
Salve a nova imagem fluorescente que contém apenas o sinal fluorescente em um fundo preto como um novo arquivo TIF. Abra as novas imagens fluorescentes e fotográficas no ImageJ. Transforme cada imagem em uma imagem de 30 bits escolhendo Imagem, seguida de Tipo e 30 bits.
Crie uma imagem mesclada de ambos escolhendo Imagem, seguida por Cores e Mesclar canais. Na caixa de diálogo que é aberta, selecione o arquivo de fotografia para o canal cinza e o arquivo fluorescente Sob quaisquer canais coloridos. Desative a escala da imagem mesclada selecionando Analisar, seguido de Definir escala e Clique para remover escala.
Selecione a ferramenta Retângulo no ImageJ. Desenhe um retângulo em torno de uma seção do intestino delgado, prestando muita atenção à largura dessa região de interesse, pois ela deve permanecer constante entre todas as regiões de interesse. Duplique a região de interesse selecionando Imagem, seguida de Duplicar e selecione apenas o canal correspondente ao canal colorido.
Novamente, use a ferramenta Retângulo para desenhar uma região de interesse sobre toda a nova imagem e recuperar um perfil de fluorescência selecionando Analisar, seguido por Perfil de plotagem. Abra a lista de valores e copie-os para o software de planilha. Repita as etapas desde o desenho da região de interesse até a recuperação de um perfil de fluorescência para cada seção do intestino delgado, conforme descrito anteriormente em uma linha de régua diferente.
No software de planilha, multiplique cada valor médio de intensidade pela largura constante do retângulo da região de interesse criada na etapa anterior. Isso produzirá o valor real da intensidade ao longo do intestino delgado em cada ponto. Aqui são mostrados os traços médios de fluorescência ao longo do comprimento do intestino delgado.
A distribuição do material fluorescente varia de acordo com as propriedades materiais dos conteúdos intraluminais. Aumentar o número de compartimentos usados para classificar os mesmos conjuntos de dados brutos revela recursos de rastreamento granulares insolúveis com menos compartimentos. Caixas menores diminuem a incerteza da medição, aumentam a resolução espacial e refletem melhor o componente distributivo da motilidade do intestino delgado.
O centro geométrico não consegue caracterizar completamente a distribuição espacial dos conteúdos intraluminais. Essa limitação da medida do centro geométrico é evidente na comparação entre líquidos e contas maiores. O traço fluorescente das contas maiores é mais distribuído, mas a média é de um ponto semelhante ao do líquido, independentemente da granularidade de binning, o que destaca a limitação de se concentrar apenas no centro geométrico.
Para dar conta da natureza distributiva das contrações do intestino delgado, uma análise espectral de potência foi incorporada no presente estudo. Plotar o espectro de potência demonstra que, à medida que os tamanhos dos compartimentos diminuem, podemos observar frequências significativamente dominantes no espectro de contas maiores, mas não no espectro de contas pequenas. Algumas, mas não todas, dessas frequências dominantes adicionais estão presentes no espectro líquido.
Os passos mais delicados deste protocolo são a gavagem e a dissecação. Estes devem ser padronizados pelos experimentadores antes de realizar esta técnica para fins experimentais. Este é um experimento terminal, pois o animal precisa ser sacrificado.
Quando possível, maximize o uso de seu modelo animal realizando outros experimentos não terminais antes deste. Nosso grupo usou recentemente essa técnica para apoiar nossa descoberta de conjuntos de toque intestinal em que o intestino usa mecanorreceptores epiteliais para detectar propriedades físicas mais finas, assim como nossos dedos.
