Esse mistério pode ajudar a responder algumas perguntas no campo da biologia celular, como a entrada de proteínas em cloroplastos. A principal vantagem dessa tecnologia é que a entrada de proteínas em cloroplastos pode ser estudada em condições en vivo. Demonstrando o procedimento serão Junho Lee e Hyangju Kang, dois post outs do meu laboratório.
Para começar, colhiu tecidos de folhas intactas de plantas de duas semanas de idade de uma a duas placas B5. Use uma faca cirúrgica para colher as folhas e colocá-las em um tubo cônico de 50 mililitros contendo 25 mililitros de solução enzimácica. Coloque o tubo horizontalmente em um agitador rotativo e incubar com agitação suave a 22 graus Celsius no escuro por oito a 12 horas até que apenas petioles e hastes permaneçam na solução.
Após completar a incubação, filtre a solução enzimática contendo protoplastos liberados através de uma malha de tamanho de poros de 140 micrômetros em uma placa de Petri fresca. Em seguida, coloque cuidadosamente a solução em cima de 15 mililitros de solução de 21% de sacarose em um tubo cônico de 50 mililitros. Centrifugar o tubo em um rotor de balde balançando a 98 gs por 10 minutos com as configurações de aceleração e desaceleração mais baixas.
Depois disso, use pipeta patura para remover cuidadosamente os protoplastos da camada superior contendo solução enzimeta e da interface entre a solução de enzimas e a solução de sacarose. Transfira esta solução para um tubo cônico de 50 mililitros contendo 30 mililitros de solução W5 e inverta o tubo para misturar. Centrifugar o tubo a 51 gs por seis minutos.
Use uma pipeta para descartar este supernatante cuidadosamente sem perturbar os protoplastos na pelota. Adicione 25 mililitros de solução W5 e suspenda suavemente os protoplastos. Para estabilização, incubar em uma geladeira de quatro Celsius por um mínimo de uma hora.
Após a incubação de quatro graus Celsius, pelota os protoplastos completamente, centrifugando-os a 46 gs por dois minutos. Remova cuidadosamente o supernante completamente e adicione a solução MANG à pelota de protoplasto para alcançar cinco vezes dez a seis por mililitro. Use uma pipeta para adicionar 10 microgramas do DNA plasmá-lo e 300 microliters de solução de protoplasto a um tubo redondo de fundo redondo de 13 mililitros fresco.
Misture girando suavemente os tubos à mão e, em seguida, adicione imediatamente 300 microliters de solução recém-preparada de 40% PEG. Misture completamente inclinando o tubo quase horizontalmente e girando-o suavemente várias vezes à mão. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, adicione um mililitro da solução W5 e misture completamente girando suavemente o tubo manualmente como anteriormente. Incubar a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente. Repita mais duas vezes com a adição de primeiro 1,5 mililitro e depois dois mililitros de W5 e após a adição final e mistura, incubar por 30 minutos.
Centrifugar o tubo a 46 gs por quatro minutos e, em seguida, descartar o supernatante. Adicione dois mililitros de solução W5 à pelota e misture suavemente, mas completamente, da mesma forma que anteriormente. Incubar a 22 graus Celsius em uma câmara escura por 18 horas.
Para analisar a importação de proteínas utilizando microscopia florescence, use uma pipeta com ponta aparada para colocar 10 microlitros da solução de protoplasto em um escorregador de vidro. Use um deslizamento de tampa para cobrir cuidadosamente a solução para evitar danificar os protoplastos. Coloque o slide no palco de um microscópio de fluorescência com um filtro de admissão de excitação que é definido para observar proteína fluorescente verde e autofluorescência de clorofila.
Use uma câmera de dispositivo de casal de carga resfriada para capturar imagens e processá-las usando um software de edição de imagens para produzir imagens pseudocoloridas. Para extração total de proteínas e imunoblotting, remova um mililitro da solução protoplasta e misture o restante de um mililitro. Transfira esta solução de protoplasto para um tubo de centrífuga e centrífuga a 46 gs por quatro minutos.
Remova o supernatante após completar a centrifugação e adicione 80 microliters de tampão de desnaturação. Vórtice vigorosamente por cinco segundos. Adicione cinco tampão de amostra XDS, misture bem e ferva por 10 minutos para desnaturar.
Proceda com a página STS padrão e imunoblotting com anticorpo anti-GFP. RbcS e TGFT, uma construção de fusão codificando os 79 resíduos finais de aminoácidos terminais de RBCS contendo o peptídeo de trânsito fundido ao GFP, foram usados para estudar a importação de proteínas em cloroplastos por microscopia de floresnce e imunoblotação. Quando examinados pela microscopia florescence, sinais fluorescentes verdes da proteína alvo fundiram-se com os sinais fluorescentes vermelhos da autoflorescência da clorofila indicando importação de proteínas em cloroplastos.
Após isolar a proteína total, duas bandas proteicas são observadas no imunobloto, mostrando que uma proteína foi devidamente importada em cloroplastos. A faixa superior corresponde ao precursor de comprimento completo e à faixa inferior à forma processada após importação em cloroplastos. A quantidade da forma processada da proteína aumentou de forma dependente do tempo, sugerindo que a proteína é importada em cloroplastos.
Nesse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia celular explorarem a proteína cansativa ou a colheita de fios de membrana em Arabidopsis.
