Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da bioquímica, como a modificação proteolítica das proteínas, bem como a caracterização de inibidores e proteases e peptidases. A principal vantagem dessa técnica é que permite uma rápida triagem da atividade proteolítica de proteases em peptídeos, representando o lado do decote da proteína dada. O uso aqui é estudar proteases que ativam a fusão viral.
O primeiro passo no design de peptídeos é adquirir a sequência da proteína de fusão de interesse de um banco de dados público como o NCBI ou o banco de dados de patógenos de vírus. Escolha o local de reconhecimento protease que procede o peptídeo de fusão e inclua dois a três aminoácidos rio acima e rio abaixo desta sequência. Ao encomendar o peptídeo, modifique-o com a transferência de energia de ressonância fluorescência ou par DE FRET, Mca no final do terminus e Dnp no c terminus.
Durante o ensaio, Mca está animado e emite energia leve que é saciada pelo Dnp enquanto o par estiver próximo um do outro. No entanto, se ocorrer o decote, o Dnp não será capaz de saciar a emissão que pode ser lida pelo leitor de placas de fluorescência. Resuspenque o peptídeo de acordo com as recomendações dos fabricantes, empinando suavemente para cima e para baixo.
Por exemplo, resuspend em 70% de etanol para uma concentração final de um milimiliar. Se o peptídeo não se resuspensar muito bem por pipetação, coloque o tubo contendo o peptídeo e o solvente em um banho de sônica até que esteja totalmente resuspendido. Dispense 100 alíquotas de microliter do peptídeo em tubos leves ou resistentes para proteger o peptídeo do branqueamento.
Armazene as alíquotas a menos 20 graus Celsius. Inicie este procedimento ligando o leitor da placa e esperando até que o autoteste seja concluído. Em seguida, abra o software operacional no computador conectado e certifique-se de que ele está conectado com o leitor de placas.
Abra a configuração de temperatura e ajuste-a à temperatura necessária para um desempenho ideal para a protease, que é de 30 graus Celsius, neste caso. Para configurar o experimento, clique na configuração do instrumento de controle, escolha cinética e selecione fluorescência. Entre em um comprimento de onda de excitação de 330 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 390 nanômetros.
Desmarque o corte automático e selecione sensibilidade média/normal. Escolha um tempo de execução de uma hora para o ensaio e selecione uma medição a cada 60 segundos. Coloque cinco segundos de mistura antes da primeira medição e três segundos antes de cada medição.
Por fim, selecione os poços para ler. Prepare os buffers de ensaio apropriados para os proteases descritos no protocolo de texto e esfrie os buffers no gelo. Coloque uma placa de poliestireno preto sólido não tratada no fundo plano 96-well no gelo com uma fina placa metálica por baixo para suportar o resfriamento e a estabilidade.
É essencial usar uma placa preta como a placa de ensaio, para evitar vazamentos fluorescentes de poços adjacentes. Por peptídeo, prepare três réplicas técnicas por ensaio, e um volume total de 100 microliters por amostra. Pipeta a quantidade apropriada de tampão de ensaio em cada poço da placa de ensaio.
Adicione 0,5 microliters de protease a cada poço. A seis poços, adicione 0,5 microliters de tampão em vez da respectiva protease. Três deles serão controles cegos e os outros três serão controles de peptídeos.
Adicione cinco microliters do peptídeo a uma concentração final de 50 micromolars a cada poço, exceto os controles cegos. Para cada um dos três poços de controle cegos, adicione cinco microliters de tampão em vez de peptídeo. Insira a placa no leitor de placas de farinha e clique em iniciar.
Antes de iniciar a análise de dados, salve o arquivo de experimento. Clique na exportação e exporte o arquivo como um txt. Importe o arquivo txt em uma planilha.
Inicie a análise criando um gráfico, plotando as unidades fluorescentes relativas no eixo y contra o tempo no eixo x para cada replicação técnica por amostra. Selecione o intervalo de dados onde o gráfico está em uma faixa linear, e o mais próximo do início da fluorescência aumenta. Plote os dados selecionados em um segundo gráfico e adicione uma linha de tendência linear.
Nas opções de linha de tendência, selecione a equação de exibição no gráfico. A equação mostrará V max, que corresponde à inclinação da linha de tendência. Calcule a média v máxima para cada amostra a partir das três réplicas técnicas.
Depois de repetir o experimento mais duas vezes, para obter três réplicas biológicas, calcule o desvio padrão com base nos dados das três réplicas biológicas independentes. Um ensaio de decote de furina do coronavírus MERS humano, o site principal da EMC/2012 S2 e a cepa dupla mutante HKU205, juntamente com variantes mutantes únicas da EMC/2012, revelaram que o peptídeo EMC/2012 foi eficientemente cortado, enquanto quase nenhum decote do peptídeo principal S2 de HKU205 ocorreu. O decote do peptídeo prime S2 mutado da EMC/2012 foi fortemente reduzido, e quase não houve decote do EMC/2012 S para i mutado peptídeo S2 prime.
Outro ensaio de decote de furina mostrou apenas o decote mínimo do local principal do Marrocos 213 S2 derivado do camelo, em comparação com o coronavírus MERS humano, emc/2012 S2 local principal. O decote furin foi observado para o peptídeo prototípico S1/S2, FECV I e 4 S1/S2, mas não no peptídeo S1/S2 mutado, FIPV I Black S1/S2. Da mesma forma, furin foi capaz de cortar o peptídeo primo prototípico S2, FECV II 1683 S2 prime, mas não os peptídeos principais S2 mutados, FECV I e 4 S2 prime, FIPV I Black S2 prime, e FIPV II 1146 S2 prime.
Após este procedimento, a análise da mancha ocidental ou ensaios de amino-fluorescência, utilizando a proteína de comprimento total de interesse pode ser realizada para verificar o decote proteico, ou neste caso, se o decote resultar em uma versão fusogênica da proteína de fusão viral.
