Este protocolo descreve os principais passos na geração e otimização de vetores sgRNA eficientes. Nossa pré-celeração de candidato sgRNA visa tempo relativo e inferência. A principal vantagem deste protocolo é que torna possível analisar as impressões de codificação de DNA para cada uma das sgRNAs sem editar genes endógenos.
Este método de pré-seleção também pode ser aplicado a outras medidas de edição de genes através de quebras duplas. Comece diluindo os oligonucleotídeos linofphilizados para uma concentração final de 10 micromolar em água dupla destilada. Misture oligonucleotídeos para a frente e para frente em um tubo PCR de paredes finas em uma proporção de um para um sem adicionar nenhum buffer extra.
Incubar a mistura a 95 graus Celsius por cinco minutos, depois diminuir a temperatura para 72 graus Celsius por 10 minutos. Remova a mistura de oligonucleotídeo da máquina PCR e deixe esfriar à temperatura ambiente. Para digerir o vetor pX330-xCas9, com Bbs1, misture o vetor, a enzima e o tampão de digestão em um volume de 50 microliter e incubar a reação a 37 graus Celsius por duas horas.
Após realizar a transformação celular, escolha de cinco a dez colônias bacterianas da placa LB e use cada uma delas para inocular um mililitro de mídia LB com 60 miligramas de ampicillina em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, incubar os tubos em um agitador rotativo por duas a três horas. Execute PCR para tela para plasmídeos recombinantes, conforme descrito no manuscrito do texto, em seguida, execute os produtos em um gel Agarose de 2% abaixo de 10 volts por centímetro.
Depois de identificar os plasmídeos positivos, use-os, juntamente com um vetor repórter, para co-transfectar uma linha celular apropriada. Para lise as células, remova o meio de crescimento das células cultivadas. Lave suavemente a superfície do vaso de cultura com PBS e dispense 100 microliters de PLB em cada cultura bem para cobrir completamente a camada mono celular.
Deixe a placa incubar à temperatura ambiente por 20 minutos e, em seguida, transfira o lise para um tubo ou frasco para mais manuseio ou armazenamento. Para realizar o ensaio de luciferase dupla, programe os luminômetros para proporcionar um atraso pré-leitura de dois segundos seguido de um período de medição de 10 segundos. Em seguida, distribua 100 microliters de reagente de ensaio de luciferase no número apropriado de tubos luminômetros.
Adicione cuidadosamente 20 microliters de lise celular no tubo luminômetro e misture por pipetação duas ou três vezes. Coloque o tubo no luminômetro e inicie a leitura. Remova o tubo de amostra do luminômetro.
Adicione 100 microliters de reagente stop e vórtice brevemente para misturar. Devolva a amostra ao luminômetro e inicie a leitura. Regisso recorde a atividade Renilla Luciferase, normalizada para a atividade Desalumbrada Luciferase, especificamente a recíproca da razão exibida na tela.
Descarte o tubo de reação quando terminar. Este método foi usado para gerar três vetores sgRNA para ovelhas DKK2 Exon 1. sgRNA e xCas9 expressando vetores foram construídos pré-digerindo a espinha dorsal vetorial seguido por ligando-o em uma série de fragmentos de DNA curtos e de dois fios através de pares de oligo de renas.
Sete colônias bacterianas foram examinadas com par de primer específico guiado PCR e as colônias positivas foram detectadas. As capacidades de segmentação genética de pX330-xCas9 T1, T2 e T3 foram detectadas simultaneamente com o ensaio de luciferase dupla. O último vetor sgRNA exibiu o maior sinal de detecção e foi posteriormente usado para pesquisa de edição de genes de ovelhas.
Seguindo este protocolo, um ensaio T7EI ou um ensaio de Ribonuclease podem ser realizados. Essas medidas adicionais dão impressões mais precisas da edição de genes endógenos.
