A técnica permite o diagnóstico confirmatório de doenças priônicas pela técnica de scrapie PrP em tecidos, analisando os tipos e distribuição do scrapie PrP para avaliar desvios punitivos ao perfil conhecido de deposição de scrapie PrP. A técnica é padronizada e utiliza anticorpos específicos contra o scrapie PrP, possibilitando a visualização da deposição do scrapie PrP nos tecidos. A técnica também fornece informações sobre a área neuroanatômica e o tipo de células.
Comece colocando as lâminas com as seções de tecido em um cesto de coloração de aço inoxidável. Saia a cesta em um banho de xileno. Após três minutos, retire e mergulhe o cesto novamente.
Para remover o xileno e reidratar as seções, mergulhe o cesto em um banho absoluto de etanol. Após três minutos, retire e mergulhe o cesto novamente. Seque ao ar as seções antes de colocá-las em banho de etanol 90% por um minuto.
Em seguida, transfira a seção para um banho de etanol 70% por mais um minuto. Para cada tratamento em banho de etanol, agite suavemente o cesto deslizante duas vezes e escorra o cesto antes da próxima transferência. Transfira a cesta para um banho de etanol a 50% por um minuto.
Imergir cuidadosamente os cortes de tecido em ácido fórmico a 98% à temperatura ambiente durante 30 minutos. Enxaguar as seções em água corrente por cinco minutos, seguido de enxaguar duas vezes em água destilada. Use um recipiente de coloração de aço inoxidável na câmara de pressão preenchida com 500 mililitros de água destilada para pré-tratar o tampão citrato de 10 milimolares a 98 graus Celsius por 20 minutos.
Para fins de controle de qualidade, coloque uma seção de fita indicadora de autoclave adesiva no cesto para monitorar a temperatura e a pressão. Assim que o alarme indicar que o equipamento atingiu o tempo e a temperatura do programa, mergulhe o cesto com corrediças. Em seguida, inicie o programa na câmara de pressão para o Set Point 2 e registre a pressão inicial e final deste programa.
Para a inativação da peroxidase endógena, imergir o cesto de lâminas contendo as seções da amostra em um banho de peróxido de hidrogênio a 3% em metanol por 30 minutos. Ponte as seções em água corrente por cinco minutos Após a drenagem, mergulhe as seções em soro fisiológico tamponada com Tris por mais cinco minutos. Para imunodetecção, coloque cada lâmina em um suporte de placa de cobertura comercialmente disponível pré-umedecido com soro fisiológico tamponada com Tris, com o lado do tecido voltado para o suporte e as bordas da lâmina coincidindo com os dois pontos inferiores do suporte.
Certifique-se de evitar bolhas de ar. Segure o conjunto do suporte deslizante entre o polegar e o indicador. Mantenha um dedo na parte superior da lâmina de amostra e o outro na parte inferior do suporte e, em seguida, coloque o conjunto na galeria do sistema.
Para garantir que o conjunto esteja bem montado, preencha o poço entre a lâmina de amostra e o suporte com soro fisiológico tamponada com Tris sem transbordá-lo. A partir deste ponto, certifique-se de que aproximadamente 80 microlitros de solução salina tamponada com Tris devem ser retidos entre o suporte e a lâmina. Não deixe as seções secarem.
Diminua a coloração de fundo antes do tratamento com o anticorpo primário pré-incubando as amostras de lâmina por 30 minutos com soro 20% normal da mesma espécie que o hospedeiro do anticorpo secundário em solução salina tamponada com Tris. Sem lavar as seções, aplique 200 microlitros da solução de anticorpos primários diretamente em cada poço do conjunto de suporte deslizante e incube por 60 minutos à temperatura ambiente. Para lavar as seções, encha os poços com soro fisiológico tamponada com Tris e aguarde cinco minutos.
Repita a lavagem duas vezes. Em seguida, diluir o anticorpo secundário biotinilado na concentração de 1 a 200 em solução salina tamponada com Tris com 10% de soro de cavalo. Repare o volume necessário dependendo do número de seções a serem tratadas.
Aplicar 200 microlitros de solução de anticorpos secundários em cada poço do conjunto de suporte deslizante. Após 30 minutos de incubação à temperatura ambiente, repetir a lavagem com solução salina tamponada com Tris. Para incubação com peroxidase do complexo avidina-biotina, preparar o reagente 30 minutos antes do uso e aplicar 200 microlitros da solução em cada poço do suporte da placa deslizante.
Uma vez feito, incubar o porta-placas por 30 minutos à temperatura ambiente. O nível de imunomarcação inespecífica em animais controle negativos para encefalopatias espongiformes transmissíveis conhecidas foi determinado para interpretar adequadamente a imunomarcação de proteínas priônicas anormais específicas. Observou-se que a marcação não-alvo por anticorpos anti-PrP ocorre como discreta coloração intraneuronal de partículas finas, fios lineares finos irregulares de coloração no neurópilo, marcação difusa não particulada em algumas áreas da substância cinzenta e branca e marcação citoplasmática difusa de neurônios.
A tabela resume a descrição dos tipos de proteínas priônicas anormais imunomarcadas observadas na encefalopatia espongiforme bovina, no tremor epizoótico clássico e atípico e na doença crônica emaciante dos cervídeos para um diagnóstico positivo e estabelece critérios para resultados negativos, inconclusivos e inadequados. Todos os passos são muito importantes. O pH das soluções e a temperatura ambiente são características importantes para o sucesso desta técnica.
O desenvolvimento de imunohistoquímica para detectar tanto o tremor epizoótico PrP quanto o tipo de células pode fornecer informações sobre cada célula envolvida na patogênese primária.
