Glaukom ist die Hauptursache für irreversible Erblindung, gekennzeichnet durch retinalen Ganglienzelltod und die Opto-Neurodegeneration. Die Erhöhung des Augeninnendrucks, auch augenokulärer Bluthochdruck genannt, ist der am meisten anerkannte Risikofaktor für Glaukom. Ein einfaches, aber effektives okuläres Hypertoniemodell bei Versuchstieren wie Mäusen ist wichtig für die Untersuchung von Glaukometern bei der Neurodegeneration und die Erprobung der Behandlung auf Neuroprotektion.
So entwickeln wir mit den Ergebnissen ein mausokuläres Hypertoniemodell, das das bei menschlichen Patienten beobachtete sekundäre Glaukom genau imitiert. Dieses Modell replizieren originalgetreu das Sekundärglaukom, das durch Silikonöl verursacht wird, das für die Pupillenblockierung induziert wird. Das Verfahren ist einfach, die IOP-Erhöhung ist stabil, und wenn die Neurodegeneration im Zusammenhang mit okulärer Hypertonie bei Augenaugen schwer ist, ist die okuläre Hypertonie reversibel, da das Silikonöl leicht von den Mausaugen entfernt werden kann.
Demonstriert wird das Verfahren von Dr.Fang Fang, einem Post-Op-Stipendiaten aus meinem Labor. Zu Beginn eine Glasmikropipette für die intracameral Silikonöl-Injektion machen, indem Sie eine Glaskapillare mit einem Pipettenzieher ziehen. Schneiden Sie eine Öffnung an der Spitze der Mikropipette und schärfen Sie die Spitze mit einer Mikroschleifer-Abschrägungsmaschine, um eine 35- bis 40-Grad-Abschrägung herzustellen.
Polieren Sie die Ränder der Abschrägung und waschen Sie sie mit Wasser, um alle Trümmer zu entfernen. Autoclavieren Sie die Mikropipette vor der Verwendung. Um die Parazentesenadel für den Hornhauteintrag vorzubereiten, befestigen Sie eine 32-Meter-Nadel an einer Fünf-Milliliter-Spritze auf einem Köderschloss und sichern Sie sie weiter mit Klebeband.
Biegen Sie die Nadel-Abschrägungsspitze, nach oben, bei 30 Grad. Zur Vorbereitung des Silikonölinjektors eine stumpfe 18-Meter-Nadel an einer 10-Milliliter-Spritze befestigen und befestigen. Dann befestigen Sie ein Kunststoffrohr mit der 18-Spur-Nadel an einem Ende und füllen Sie mit Silikonöl nach Bedarf durch das andere Ende.
Nach der Anästhesisierung einer neun bis zehn Wochen alten C57 schwarze 6J Maus, überprüfen Sie auf die fehlende Reaktion auf die Zehenprise mit der fehlenden Bewegung der Schnurrhaare oder des Schwanzes. Platzieren Sie die Maus in einer seitlichen Position auf einer Operationsplattform. Tragen Sie vor der Injektion einen Tropfen 5%proparacaines Hydrochlorid auf die Hornhaut auf, um seine Empfindlichkeit während des Eingriffs zu reduzieren.
Verwenden Sie die 32 Gauge Paracentesis Nadel, um einen Eintrag Schnitt am super zeitlichen Quadranten etwa 5 Millimeter vom Limbus zu machen. Tunnel durch die Schichten der Hornhaut für etwa 3 Millimeter, bevor piercing in die vordere Kammer, achten Darauf, nicht die Linse oder Iris berühren. Ziehen Sie die Nadel langsam zurück, um etwa ein bis zwei Mikroliter wässrigen Humors aus der vorderen Kammer durch den Tunnel freizusetzen und warten Sie etwa acht Minuten, um den Augeninnendruck weiter zu verringern.
Messen Sie das kontralaterale Kontrollauge, um den Druck zu bestimmen. Legen Sie die mit Silikonöl vorbelastete Glasmikropipette durch den Hornhauttunnel in die Vorderkammer mit der Abschrägung nach unten in die Irisoberfläche ein. Drücken Sie den Spritzenkolben langsam, um Silikonöl in die vordere Kammer zu injizieren, bis das Öltröpfchen den größten Teil der Irisoberfläche bedeckt, etwa 2,3 bis 2,4 Millimeter im Durchmesser.
Lassen Sie die Mikropipette für weitere 10 Sekunden in der vorderen Kammer, bevor Sie sie langsam zurückziehen. Drücken Sie vorsichtig das obere Augenlid, um den Hornhautschnitt zu schließen, um Silikonöllecks zu minimieren. Und dann Antibiotikasalbe auf die Augenoberfläche auftragen.
Halten Sie die Maus auf dem Heizkissen, bis vollständig von der Anästhesie erholt. Um Silikonöl aus der vorderen Kammer zu entfernen, befeuchten Sie die Maus und überprüfen Sie dann auf die fehlende Reaktion auf die Zehenklemme, um die Anästhesiefestigkeit und die Bewegungsschwäche der Schnurrhaare oder des Schwanzes zu bestimmen. Legen Sie die Maus auf eine Operationsplattform und befestigen Sie sie in der seitlichen Position mit Klebeband.
Tragen Sie einen Tropfen 5%proparacaines Hydrochlorid auf die Hornhaut auf, um ihre Empfindlichkeit zu reduzieren. Mit der vorgefertigten 32-Meter-Parazentesenadel zwischen etwa zwei und fünf Uhr am Rand des Silikonöltröpfchens zwei Schnitte im zeitlichen Quadranten der Hornhaut machen. Setzen Sie eine 33-Grad-Bewässerungsnadel ein, die mit der Bewässerungslösung verbunden ist, durch einen Hornhautschnitt bei maximaler Geschwindigkeit.
Setzen Sie eine weitere 33-Spur-Drainagenadel an der Spritze ohne Kolben durch den anderen Hornhautschnitt, damit das Silikonöltröpfchen die vordere Kammer verlassen kann, während es mit Bewässerungslösung bewässert wird. Ziehen Sie die Drainagenadel dann die Bewässerungsnadel ab. Verwenden Sie eine Glas-Mikropipette, die mit einer Hamilton-Spritze verbunden ist, um eine Luftblase in die vordere Kammer zu injizieren, um ihre normale Tiefe zu erhalten, und drücken Sie, um den Hornhautschnitt zu schließen.
Tragen Sie Antibiotikasalbe auf beide Augen auf und halten Sie die Maus auf dem Heizrückgewinnungspad, bis sie vollständig aus der Anästhesie erholt ist. Legen Sie die Maus in eine Induktionskammer. Anästhetisieren Sie es wie im Manuskript beschrieben und halten Sie seine Hornhaut feucht, indem Sie künstliche Tränen während des gesamten Verfahrens anwenden.
Warten Sie etwa 15 Minuten, damit sich der Schüler vollständig vermehren kann. Messen Sie den IOP beider Augen mit einem Tonometer gemäß produktanweisungen. Bringen Sie das Tonometer in die Nähe des Mausauges und halten Sie den Abstand von der Spitze der Sonde zur Maushornhaut bei etwa drei bis vier Millimetern.
Drücken Sie die Messtaste sechsmal, um einen Messwert zu generieren, und erhalten Sie von jedem Auge drei maschinengenerierte Messwerte, um den mittleren IOP zu erhalten. Führen Sie die Immunhistochemie der retinalen Ganglien-Zelle mit einer Gesamtmontage durchführen und die halbdünnen Abschnitte des Sehnervs zählen und die Quantifizierung überlebender Axone an den Tieren, die acht Wochen nach der Silikonölinjektion geopfert wurden. Der Augeninnendruck von Mausaugen mit Silikonöltröpfchen größer als 1,6 Millimeter wurde einmal pro Woche für acht Wochen gemessen, nach einer einzigen Silikonölinjektion.
Der Druck des Auges, das das Öl erhält, blieb hoch, meist doppelt so hoch wie der Druck des kontralateralen Kontrollauges, was auf eine effektive Pupillenblockierung hindeutet. In einer anderen Gruppe von Mäusen wurde Silikonöl zwei Wochen nach der Injektion aus der vorderen Kammer gespült. Nachdem Sie eine Woche gewartet hatten, damit sich die Hornhaut erholen kann, normalisierte sich der Augeninnendruck wieder, so wie das Kontrollauge.
Um die Auswirkungen der Silikonöl-induzierten okulären Hypotonie auf retinale Ganglienzellen zu bestimmen, wurde die überlebende Somata in den peripheren Regionen der retinalen ganzen Halterungen durch RBPMS-Färbung quantifiziert, die einen dramatischen Tod von Retinalen Ganglienzellen nach Silikonölinjektion zeigte. Die überlebenden Axone im Sehnerv-Halbquerschnitt wurden acht Wochen nach der Injektion durch PBD-Färbung quantifiziert. Es gab eine große Axondegeneration bei Silikonöl-induzierter okulärer Hypertonie.
Die Tiere können mit SLOOCT abgebildet werden, um die Veränderung der Netzhaut zu bestimmen. Die sehische Funktion der Tiere kann auch durch Muster ERG und OKR überprüft werden. Dieses okuläre Hypertoniemodell wird die Untersuchung der hohen IOP-induzierten Glaukometer-Neurodegeneration erleichtern.
Es kann auch verwendet werden, um vielversprechende neuroprotektive Therapien präklinisch zu testen.
