Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho PCR de gotícula multiplex flexível que permite a contagem precisa de leucócitos diferenciais com base em marcadores de metilação epigenética. Essa flexibilidade pode facilitar a tradução do mdPCR para uso clínico. Este método fornece resultados que consultam de perto aqueles obtidos usando métodos de coloração imunofluorescentes.
Ao contrário da coloração imunofluorescente, no entanto, este método não requer amostras de sangue fresco ou anticorpos caros. Nos diagnósticos hematológicos, o leucócito diferencial pode servir como indicadores para um espectro de doenças, incluindo infecção, inflamação, anemia e leucemia, e está sendo considerado como um biomarcador de câncer prognóstico precoce. Demonstrando o procedimento com Abdelrahman Elmanzalawy será Christina Nassif, uma oficial técnica da nossa equipe no Centro de Pesquisa de Dispositivos Médicos da NRC.
Comece misturando completamente 20 microliters de proteína quinase K e 400 microliters de tampão de ligação de lise contendo contas magnéticas com células mononucleares de sangue periféricos humanos recém-descongeladas em 100 microlitrais de PBS. Após uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, coloque o tubo em um rack magnético por um a dois minutos antes de remover o sobrenante. Com o tubo removido do ímã, suspenda o complexo de contas de DNA em 600 microliters de tampão de lavagem um para remover quaisquer contas não especificamente ligadas.
Coloque o tubo de volta no ímã para permitir a remoção do supernascer, antes de lavar as células em 600 microliters de tampão de lavagem dois como apenas demonstrado. Depois de remover o supernascer, deixe o tubo secar no ímã por um minuto antes de adicionar 100 microliters de tampão de eluição ao tubo com uma mistura completa. Em seguida, coloque o tubo no rack magnético por um a dois minutos para separar as contas magnéticas do DNA aludido, e transferir a solução de DNA purificada para um novo tubo.
Para a conversão de bisulfato do DNA purificado, transfira 20 microliters da amostra de DNA aludido para um tubo PCR, e adicione 130 microliters de reagente de conversão ao tubo. Após uma mistura minuciosa, gire brevemente o conteúdo do tubo e amplie o DNA em um cicloviário térmico. No final do ciclo, adicione 600 microliters de tampão de ligação a uma coluna de cromatografia de íons colocada em um tubo de coleta, e adicione o DNA à coluna.
Inverta o tubo várias vezes para misturar, e centrífuga por 30 segundos a toda velocidade. Descarte o fluxo coletado e adicione 100 microliters de tampão de lavagem à coluna. Centrifugar a coluna e descartar o fluxo novamente como demonstrado.
Adicione 200 microliters de Tampão de Dessulfonação à coluna para uma incubação de 15 a 20 minutos à temperatura ambiente, antes de centrifugar a amostra e descartar o fluxo-through como demonstrado. Em seguida, lave a coluna duas vezes com 200 microliters de tampão de lavagem por lavagem. Após a segunda lavagem, transfira a coluna para um novo tubo de coleta de 1,5 mililitros e adicione 100 microliters de água de grau PCR à membrana da coluna.
Então, elute o DNA por centrifugação da coluna por um minuto a toda velocidade. Para a geração de gotículas, misture um microliter de DNA convertido por bisulfato com uma mistura mestre de sonda recém-preparada em um tubo PCR, e colete a amostra com uma breve centrifugação. Use encaixes de pico para conectar tubos fluidos descartáveis a duas seringas de vidro de precisão de volume de 250 microliter.
E pré-encha uma seringa de vidro de precisão com 250 microliters de óleo transportador contendo 5% de farinhao surfactante, e uma seringa de vidro de precisão com 50 microliters de óleo transportador. Quando ambas as seringas tiverem sido carregadas, carregue 100 microlitros do PCR na seringa do óleo transportador e coloque um dispositivo microfluido gotícula no palco de um microscópio de luz vertical equipado com uma câmera de alta velocidade. Para a observação e registro da formação de gotículas em tempo real, coloque as seringas pré-enchidas em uma bomba de seringa programável e use a união de pico com encaixes para conectar a tubulação das seringas à tubulação dos respectivos canais de entrada do dispositivo microfluídico gotícula.
Coloque a tubulação da saída do gerador de gotículas para o interior de um tubo PCR de 0,5 mililitro e ajuste a taxa de fluxo da bomba de seringa para dois microliters por minuto, para permitir que o tamanho da gotícula se estabilize antes de coletar a emulsão resultante. Coletar lentamente e cuidadosamente a emulsão do topo do tubo, e transferir 75 microliters da solução para um tubo PCR de 200 microliteres para ciclismo térmico. Em seguida, confirme que o teor de óleo no tubo PCR corresponde de perto ao volume da fase dispersa, para evitar a coalescência das gotículas durante o ciclismo térmico e coloque o tubo de 200 microliter no cicloviário térmico.
Para imagens de fluorescência da amostra emulsificada, transfira a emulsão pcr em um tubo capilar de borossilicato de 50 micrômetros profundos com um perfil retangular, para permitir o arranjo das gotículas em uma monocamada fechada para imagem. Depois de fixar e selar os capilares em um slide de microscópio, carregue o slide no estágio do microscópio invertido. E no software de imagem de microscópio, selecione adquirir e viver rápido, para iniciar a aquisição de câmeras em tempo real.
Em seguida, observe a amostra sob campo brilhante e microscopia de fluorescência. Após a geração de gotículas e o ciclismo térmico, as gotículas podem ser introduzidas em um capilar de vidro com uma largura de um milímetro e uma altura de 50 micrômetros. Para obter uma distribuição monocamada das gotículas ideais para aquisição de imagens de fluorescência, as imagens podem então ser gravadas para cada comprimento de onda.
Após a análise da imagem, a intensidade da fluorescência de todas as gotículas em seus respectivos fluoroforos pode ser traçada para estabelecer o limiar das gotículas positivas e negativas. Após a identificação e contagem, as cópias por gotícula podem ser calculadas, e a porcentagem de células CD3+T, e células T cd4+25+regulamentares podem ser determinadas com base nas cópias metiladas CD3Z e FOXP3, respectivamente, com relação às cópias por gotícula do gene total ou c-less. Os valores por cento podem então ser comparados aos obtidos através de imagens de imunofluorescência usando os anticorpos apropriados.
Penso que a estabilidade da emulsão desde a geração de gotículas até as etapas de ciclismo térmico e de imagem final de gotículas é crucial para obter resultados precisos, confiáveis e reprodutíveis de quantificação. A personalização do MD PCR através da formulação de mixagem pcr sob medida pode ser usada para uma série de aplicações, incluindo pesquisa sobre câncer, diagnóstico de doenças infecciosas e análises no nível único celular.
