Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
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Gostaríamos de agradecer à Dra. Esses materiais contribuíram para projetos apoiados em parte pela Fundação de Pesquisa em Alimentos e Agricultura, sob a concessão de 549025.

Os autores não têm nada a revelar.

Aqui delineamos métodos detalhando cada etapa do processo de amplificação do vírus e preparação do estoque inóculo, incluindo coleta de larvas e propagação de vírus, extração e concentração, bem como tratamento viral na forma de experimentos de alimentação de gaiolas. Esses métodos permitem a produção de partículas de vírus semi-puros (Figura 4), da qual a eficácia pode ser quantificada consistentemente por testes de mortalidade por dose-resposta para vírus letais para...

As abelhas de mel (Apis mellifera) desempenham um papel crítico na paisagem agrícola global moderna, mas atualmente sofrem de uma combinação de estressores bióticos e abióticos, incluindo exposição a pesticidas, forragem ruim, parasitas e patógenos 1,2. Um dos patógenos mais importantes de preocupação são os vírus, muitos dos quais são vetoriados por outro dos maiores estressores de abelhas, o ácaro varroa parasita (destruidor varroa). Esses vírus podem causar uma série de efeitos negativos nas abelhas, incluindo a redução da sobrevida da ninhada, defeitos de desenvolvimento e paralisia que podem levar ao colapso total da colmeia antes e depois do overwinteringperíodos 3,4,5. Embora tenha havido avanços promissores no desenvolvimento de tecnologias usadas para combater a infecção pelo vírus 6,7,8,9, a dinâmica pela qual muitos vírus se propagam, se espalham e interagem dentro de uma abelha ou colônia ainda são mal compreendidas 5,10 . Compreender a biologia básica das interações entre abelhas e vírus e suas relações com outros fatores ambientais é fundamental para o desenvolvimento de técnicas eficazes de manejo de vírus.
No entanto, estudar as interações mel-vírus representa desafios com inúmeros fatores conhecidos e desconhecidos que complicam o processo. Estes incluem interações com a dieta11,12, exposição a pesticidas13 e fundo genético de abelhas14,15. Mesmo focando apenas na infecção por vírus, complicações são comuns porque as populações de abelhas de mel, tanto controladas quanto selvagens, sempre têm algum grau de infecção por vírus de fundo, embora muitas vezes sem manifestar sintomas agudos16,17, e os efeitos da coinfecção do vírus não são bem compreendidos18. Isso tornou difícil o estudo dos efeitos do vírus das abelhas.
Muitos estudos sobre o vírus das abelhas têm usado infecções circunstanciais do vírus para procurar interações com outros estressores, observando como as infecções de fundo mudam com outros tratamentos 12,19,20,21. Embora essa abordagem tenha sido bem sucedida na identificação de efeitos importantes, especialmente descobrindo como os tratamentos pesticidas ou dietéticos afetam os níveis e a replicação do vírus, a inoculação com um tratamento de vírus de conteúdo e concentração conhecidos é fundamental para testes experimentais da dinâmica da infecção por vírus. Mesmo assim, separar o tratamento experimental da infecção em segundo plano também pode representar desafios. Em estudos de campo, pesquisadores têm cepas diferenciadas de vírus de asa deformada (DWV) para fornecer evidências para a transmissão de vírus de abelhas de mel para abelhas22, mas usar essa abordagem seria difícil apenas dentro das abelhas. Clones infecciosos de vírus são uma ferramenta poderosa, não apenas para rastrear infecções 23,24,25, mas para estudos de genética reversa de vírus de abelhas de mel e para pesquisas de interação entre vírus e hospedeiros 26,27,28. No entanto, na maioria dos casos, clones infecciosos ainda são necessários para cumprir o ciclo de infecção dentro das células para produzir partículas. Tais partículas são preferidas como inocula para tratamentos experimentais porque sua infectividade é maior do que o RNA viral nu e a inoculação com genomas encapsidados imita uma infecção natural.
A produção de inocula de vírus de abelhas de mel puro e não contaminado (cepas de vírus do tipo selvagem ou aquelas derivadas de clones infecciosos) também representam desafios. Estes se devem principalmente às dificuldades em obter uma linha de células de abelhas de mel confiável, continuamente replicante e livre de vírus para produzir vírus de cepa pura29,30. Embora algumas linhas celulares tenham sido produzidas, esses sistemas permanecem imperfeitos; ainda assim, há esperança de que uma linha celular viável possa ser produzida29, o que permitiria um controle mais fino da produção e investigação do vírus. Até que essa linha se torne amplamente disponível, a maioria dos protocolos de produção de vírus continuará a depender do uso do vírus in vivo e da purificação 18,31,32,33,34. Essas abordagens envolvem identificar e purificar partículas de vírus de interesse (ou produzir um clone infeccioso) e usá-las para infectar abelhas, geralmente como pupas. As pupas são injetadas com o vírus alvo e depois sacrificadas, e outras partículas são extraídas e purificadas. No entanto, como nenhuma abelha é livre de vírus para começar, há sempre algum grau de contaminação por vestígios de outros vírus em qualquer concentrado, e, portanto, deve-se tomar muito cuidado na escolha de abelhas com baixa probabilidade de infecções de fundo. Além disso, os métodos de remoção da pupae das células pente-pente para uso nesses protocolos33 são muito trabalhosos e podem induzir o estresse nas abelhas, limitando a produção por esses meios 18,32. Aqui, relatamos um método alternativo que permite a remoção em larga escala de larvas com pouco trabalho de parto e menos estresse mecânico nas abelhas.
Uma vez que as pupas são obtidas e injetadas com o vírus inicial inóculo, elas devem ser incubadas para fornecer tempo para o vírus se replicar. Posteriormente, partículas de vírus produzidas podem ser processadas em uma forma utilizável para infectar abelhas experimentais. Existem vários métodos simples para conseguir isso, incluindo o uso de um homogenemente bruta 35,36 ou hemoglifo gerado a partir de abelhas viralmente infectadas como fonte de infecção37. Esses métodos são eficazes, mas têm maior chance de introduzir variáveis desconhecidas do substrato de fundo (por exemplo, outros fatores nos homogeneizadores de abelhas mortas). Além disso, é desejável concentrar as partículas se um experimento requer dar uma grande dose conhecida de um vírus em um curto período de tempo. Portanto, para um melhor controle, é preferível usar métodos que permitam algum nível de purificação e concentração das partículas do vírus. Geralmente, uma série de etapas de precipitação e centrifugação resultarão na remoção de quase todos os possíveis materiaisnão-alvos do vírus 33.
Após produzir esse inóculo concentrado, é benéfico quantificar os títulos virais (qPCR) e caracterizá-lo com bioensações in vivo para testar sua viabilidade e capacidade de causar mortalidade, bem como corroborar que o aumento dos do vírus são obtidos após a infecção. Isso pode ser alcançado através de experimentos de injeção (seja em pupas ou adultos) ou experimentos de alimentação (em larvas ou adultos). Embora todas essas abordagens sejam possíveis, alimentar-se de grupos de abelhas adultas em uma gaiola é muitas vezes o mais rápido e simples. O método de ensaio da gaiola também é amplamente utilizado para testar vários outros tratamentos sobre abelhas, incluindo toxicidade de pesticidas38, desenvolvimento de ovário39 e influência nutricional no comportamento40,41 e, portanto, pode formar uma boa base para experimentos que ligam a infecção pelo vírus a outros fatores42.
Aqui descrevemos um método confiável para produzir grandes quantidades de partículas de vírus semi-puras e altamente enriquecidas sem o uso de uma ultracentrifuagem cara, incluindo um método para remover pupas que reduz o trabalho e o estresse mecânico nas abelhas e um bioensato altamente repetitivo e de alto rendimento para testar infecções e efeitos virais. Controlando firmemente a pureza do inocula viral, os pesquisadores são capazes de reduzir a variação da resposta viral das abelhas em relação a outros métodos de inoculação viral. Além disso, o bioensativo pode testar efeitos virais em um nível de pequenos grupos usando unidades experimentais altamente repetíveis antes de escalar para configurações realistas de campo, o que é muito mais trabalhoso para gerenciar. Em combinação, esses dois métodos fornecem as ferramentas necessárias para estudos que podem ajudar a melhorar nossa compreensão geral das interações fisiológicas do vírus das abelhas.

<table><tbody><tr><td>10% bleach solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td><td>SigmaAldrich</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cages for bioassay</td><td></td><td></td><td>Dependent on experimental setup</td></tr><tr><td>Combitips Advanced 0.1 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30089405</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>Containers for larval self-removal</td><td></td><td></td><td>Should measure roughly 19&quot; x 9-1/8&quot; (Langstroth deep frame dimensions)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td></td><td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td></tr><tr><td>Fume hood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td>Capable of maintaining 34 &amp;ordm;C and 50% relative humidity</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>Any absorbent wipe will work</td></tr><tr><td>Medium-sized weight boats</td><td></td><td></td><td>Serve as inoculum trays</td></tr><tr><td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td><td>MilliporeSigma</td><td>MPE100025</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrile gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>SigmaAldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td><td>SigmaAldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated benchtop centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 15,000 x g</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td></td><td></td><td>Capable of 21,000 x g</td></tr><tr><td>Repeater M4 Multipipette</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>Optional (if no injector appartus is available)</td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>ThermoFisher</td><td>7000TS1</td><td></td></tr><tr><td>RNAse-free water</td><td>SigmaAldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TES</td><td>SigmaAldrich</td><td>T1375</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

As abelhas são de grande importância ecológica e agrícola em todo o mundo, mas também estão sujeitas a uma variedade de pressões que afetam negativamente a saúde das abelhas, incluindo a exposição a patógenos virais. Esses vírus podem causar uma grande variedade de efeitos devastadores e muitas vezes podem ser desafiadores para estudar devido a múltiplos fatores que dificultam a separação dos efeitos dos tratamentos experimentais da infecção de fundo pré-existente. Aqui apresentamos um método para produzir em massa grandes quantidades de partículas de vírus, juntamente com um bioensaio de alto rendimento para testar infecções e efeitos virais. Necessitadas pela atual falta de uma linha celular de abelhas de mel contínua e livre de vírus, as partículas virais são amplificadas in vivo usando pupas de abelha mel, que são extraídas da colmeia em grandes volumes usando metodologia minimamente estressante. Essas partículas de vírus podem então ser usadas em bioensações de gaiolas de abelhas para testar a viabilidade do inocula, bem como várias outras dinâmicas de infecção por vírus, incluindo interações com nutrição, pesticidas e outros patógenos. Uma grande vantagem do uso dessas partículas é que ela reduz consideravelmente as chances de introduzir variáveis desconhecidas na experimentação subsequente quando comparadas às alternativas atuais, como infecção por hemoglifo de abelha infectada ou homogeneização, embora ainda deva ser tomado cuidado ao fornecer as abelhas, para minimizar a contaminação do vírus de fundo. Os ensaios da gaiola não substituem experimentos realistas em larga escala que testam efeitos de infecção por vírus em nível de colônia, mas funcionam como um método para estabelecer respostas virais de linha de base que, em combinação com as partículas de vírus semi-puros, podem servir como ferramentas importantes para examinar várias dimensões das interações fisiológicas do vírus das abelhas.

Seguindo com sucesso os protocolos (Figuras 1) para injeção de pupal e extração viral devem produzir grandes quantidades de partículas de vírus. No entanto, a amostragem e a injeção de pupas provenientes de uma variedade de colônias em vários pontos de tempo maximiza as chances de adquirir vírus alvo com baixa contaminação. A dinâmica pela qual os vírus se replicam e interagem entre si dentro de uma abelha não é bem compreendida; juntamente com a probabilidade de infecção pré-existent...

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Aqui descrevemos dois protocolos: primeiro para propagar, extrair, purificar e quantificar grandes quantidades de partículas de vírus não envoltas em abelhas, incluindo um método para remover pupas de abelha mel e segundo para testar os efeitos da infecção viral usando um bioensaão de gaiola altamente repetigível e de alto rendimento.

Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

2.8K visualizações.  University of Illinois. Aqui descrevemos dois protocolos: primeiro para propagar, extrair, purificar e quantificar grandes quantidades de partículas de vírus não envoltas em abelhas, incluindo um método para remover pupas de abelha mel e segundo para testar os efeitos da infecção viral usando um bioensaão de gaiola altamente repetigível e de alto rendimento.

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Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees (Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the survival of a honeybee colony depends on the exploitation of food sources, forager bees learn and memorize variable flower sites as well as their profitability. Forager bees can be easily trained in natural settings where they forage at a feeding site and learn the related signals such as odor or color. Appetitive associative learning can also be studied under controlled conditions in the laboratory by conditioning the proboscis extension response (PER) of individually harnessed honeybees3,4. This learning paradigm enables the study of the neuronal and molecular mechanisms that underlie learning and memory formation in a simple and highly reliable way5-12. A behavioral pharmacology approach is used to study molecular mechanisms. Drugs are injected systemically to interfere with the function of specific molecules during or after learning and memory formation13-16.
Here we demonstrate how to train harnessed honeybees in PER conditioning and how to apply drugs systemically by injection into the bee flight muscle.

Behavioural Pharmacology in Classical Conditioning of the Proboscis Extension Response in Honeybees Apis mellifera

We demonstrate how to implement a behavioral pharmacology method in an appetitive olfactory conditioning paradigm in honeybees (Apis mellifera) by systemic application of drugs. This method allows investigation of the mechanisms underlying learning and memory formation in a simple and reliable way.

Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

Honeybees (Apis mellifera) are well known for their communication and orientation skills and for their impressive learning capability1,2. Because the ...

Neurociência

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered &#34;bee-safe,&#34; there is mounting evidence that fungicide residues in pollen are associated with bee declines (for both honey and bumble bee species). While the mechanisms remain relatively unknown, researchers have speculated that bee-microbe symbioses are involved. Microbes play a pivotal role in the preservation and/or processing of pollen, which serves as nutrition for larval bees. By altering the microbial community, it is likely that fungicides disrupt these microbe-mediated services, and thereby compromise bee health. This manuscript describes the protocols used to investigate the indirect mechanism(s) by which fungicides may be causing colony decline. Cage experiments exposing bees to fungicide-treated flowers have already provided the first evidence that fungicides cause profound colony losses in a native bumble bee (Bombus impatiens). Using field-relevant doses of fungicides, a series of experiments have been developed to provide a finer description of microbial community dynamics of fungicide-exposed pollen. Shifts in the structural composition of fungal and bacterial assemblages within the pollen microbiome are investigated by next-generation sequencing and metagenomic analysis. Experiments developed herein have been designed to provide a mechanistic understanding of how fungicides affect the microbiome of pollen-provisions. Ultimately, these findings should shed light on the indirect pathway through which fungicides may be causing colony declines.

Microbial consortia within bumble bee hives enrich and preserve pollen for bee larvae. Using next generation sequencing, along with laboratory and field-based experiments, this manuscript describes protocols used to test the hypothesis that fungicide residues alter the pollen microbiome, and colony demographics, ultimately leading to colony loss.

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

Ambiente

Evaluating the Effect of Environmental Chemicals on Honey Bee Development from the Individual to Colony Level

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be brought back to the beehive after the bees have foraged on flowers that have been sprayed with pesticides. Pesticide contaminated food can be exchanged between workers which then feed larvae and therefore can potentially affect the development of honey bees. Thus, residual pesticides in the environment can become a chronic damaging factor to honey bee populations and gradually lead to colony collapse. In the presented protocol, honey bee feeding methods are described and applied to either an individual honey bee or to a colony. Here, the insect growth regulator (IGR) pyriproxyfen (PPN), which is widely used to control pest insects and is harmful to the development of honey bee larvae and pupae, is used as the pesticide. The presenting procedure can be applied to other potentially harmful chemicals or honeybee pathogens for further studies.

Herein we present a method to feed pesticide contaminated food to both an individual honey bee and a beehive colony. The procedure evaluates the pesticide effect on individual honey bees by in vivo feeding of basic larval diet and also on the natural condition of beehive colony.

Avaliando o efeito de substâncias químicas ambientais em Honey Bee Desenvolvimento do indivíduo para Colony Nível

The presence of pesticides in the beekeeping environment is one of the most serious problems that impacts the life of a honey bee. Pesticides can be ...

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees (Apis mellifera L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker bees spend the first half of their life inside the dark hive, where they are nursing the larvae or building the regular hexagonal combs for food (e.g. pollen or nectar) and brood3. The antennae are extraordinary multisensory feelers and play a pivotal role in various tactile mediated tasks4, including hive building5 and pattern recognition6. Later in life, each single bee leaves the hive to forage for food. Then a bee has to learn to discriminate profitable food sources, memorize their location, and communicate it to its nest mates7. Bees use different floral signals like colors or odors7, 8, but also tactile cues from the petal surface9 to form multisensory memories of the food source. Under laboratory conditions, bees can be trained in an appetitive learning paradigm to discriminate tactile object features, such as edges or grooves with their antennae10, 11, 12, 13. This learning paradigm is closely related to the classical olfactory conditioning of the proboscis extension response (PER) in harnessed bees14. The advantage of the tactile learning paradigm in the laboratory is the possibility of combining behavioral experiments on learning with various physiological measurements, including the analysis of the antennal movement pattern.

Tactile Conditioning And Movement Analysis Of Antennal Sampling Strategies In Honey Bees Apis mellifera L.

In this protocol we show how to condition harnessed honey bees to tactile stimuli and introduce a 2D motion capture technique for analyzing the kinematics of fine-scale antennal sampling pattern.

Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (<em&gt; Apis mellifera</em&gt; L.)

Honey bees (Apis mellifera L.) are eusocial insects and well known for their complex division of labor and associative learning capability1, 2. The worker ...

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees (Apis mellifera)

This video demonstrates novel techniques of RNA interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees using double-stranded RNA (dsRNA) injections. It also presents a protocol of proboscis extension response (PER) assay for measuring gustatory perception.	
	RNAi-mediated gene knockdown is an effective technique downregulating target gene expression. This technique is usually used for single gene manipulation, but it has limitations to detect interactions and joint effects between genes. In the first part of this video, we present two strategies to simultaneously knock down two genes (called double gene knockdown). We show both strategies are able to effectively suppress two genes, vitellogenin (vg) and ultraspiracle (usp), which are in a regulatory feedback loop. This double gene knockdown approach can be used to dissect interrelationships between genes and can be readily applied in different insect species.	
	The second part of this video is a demonstration of proboscis extension response (PER) assay in honey bees after the treatment of double gene knockdown. The PER assay is a standard test for measuring gustatory perception in honey bees, which is a key predictor for how fast a honey bee's behavioral maturation is. Greater gustatory perception of nest bees indicates increased behavioral development which is often associated with an earlier age at onset of foraging and foraging specialization in pollen. In addition, PER assay can be applied to identify metabolic states of satiation or hunger in honey bees. Finally, PER assay combined with pairing different odor stimuli for conditioning the bees is also widely used for learning and memory studies in honey bees.

RNAi-mediated Double Gene Knockdown and Gustatory Perception Measurement in Honey Bees Apis mellifera

In this protocol, we describe two strategies that simultaneously suppress two genes (double gene knockdown) in honey bees. Then we present how to use the proboscis extension response (PER) assay to study the effect of double gene knockdown on honey bee gustatory perception.

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

This video demonstrates novel techniques of RNA  interference (RNAi) which downregulate two genes simultaneously in honey bees  using double-stranded RNA ...

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These insects are the predominant vectors of Xylella fastidiosa (X. fastidiosa), a xylem-limited bacterium that is the causal agent of Pierce&#39;s disease (PD) of grapevine. Pierce&#8217;s disease is economically damaging; thus, H. vitripennis have become a target for pathogen management strategies. A dicistrovirus identified as Homalodisca coagulata virus-01 (HoCV-01) has been associated with an increased mortality in H. vitripennis populations. Because a host cell is required for HoCV-01 replication, cell culture provides a uniform environment for targeted replication that is logistically and economically valuable for biopesticide production. In this study, a system for large-scale propagation of H. vitripennis cells via tissue culture was developed, providing a viral replication mechanism. HoCV-01 was extracted from whole body insects and used to inoculate cultured H. vitripennis cells at varying levels. The culture medium was removed every 24 hr for 168 hr, RNA extracted and analyzed with qRT-PCR. Cells were stained with trypan blue and counted to quantify cell survivability using light microscopy. Whole virus particles were extracted up to 96 hr after infection, which was the time point determined to be before total cell culture collapse occurred. Cells were also subjected to fluorescent staining and viewed using confocal microscopy to investigate viral activity on F-actin attachment and nuclei integrity. The conclusion of this study is that H. vitripennis cells are capable of being cultured and used for mass production of HoCV-01 at a suitable level to allow production of a biopesticide.

Propagation of Homalodisca coagulata virus-01 via Homalodisca vitripennis Cell Culture

Here we present a protocol to propagate Homalodisca vitripennis cells and HoCV-1 in vitro. Medium was removed from HoCV-1 positive cultures and RNA extracted every 24 hr for 168 hr. Cell survivability was quantified by trypan blue staining. Whole virus particles were extracted post-infection. Extracted RNA was quantified by qRT-PCR.

Propagação de<em&gt; 01-vírus Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultura de Células

The glassy-winged sharpshooter (Homalodisca vitripennis) is a highly vagile and polyphagous insect found throughout the southwestern United States. These ...

Imunologia e Infecção

Preparation of Single-cohort Colonies and Hormone Treatment of Worker Honeybees to Analyze Physiology Associated with Role and/or Endocrine System

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related division of labor). Young workers are engaged in nursing the brood (nurse bees), while older workers are engaged in foraging for nectar and pollen (foragers). The physiology of the workers changes in association with this role shift. For example, the main function of the hypopharyngeal glands (HPGs) changes from the secretion of major royal jelly proteins (MRJPs) to the secretion of carbohydrate-metabolizing enzymes. Because worker tasks change as the workers age in typical colonies, it is difficult to discriminate the physiological changes that occur with aging from those that occur with the role shift. To study the physiological changes in worker tissues, including the HPGs, in association with the role shift, it would be useful to manipulate the honeybee colony population by preparing single-cohort colonies in which workers of almost the same age perform different tasks. Here we describe a detailed protocol for preparing single-cohort colonies for this analysis. Six to eight days after single-cohort colony preparation, precocious foragers that perform foraging tasks earlier than usual appear in the colony. Representative results indicated role-associated changes in HPG gene expression, suggesting role-associated HPG function. In addition to manipulating the colony population, analysis of the endocrine system is important for investigating role-associated physiology. Here, we also describe a detailed protocol for treating workers with 20-hydroxyecdysone (20E), an active form of ecdysone, and methoprene, a juvenile hormone analogue. The survival rate of treated bees was sufficient to examine gene expression in the HPGs. Gene expression changes were observed in response to 20E- and/or methoprene-treatment, suggesting that hormone treatments induce physiological changes of the HPGs. The protocol for hormone treatment described here is appropriate for examining hormonal effects on worker physiology.

Here we describe our detailed protocol for the preparation of single-cohort honeybee colonies&#160;&#8211; a useful tool for analyzing the role-associated worker physiology. We also describe detailed protocols for treating workers with juvenile hormone and ecdysone to evaluate the involvement of these hormones in the regulation of worker behavior and/or physiology.

Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino

Honeybee workers are engaged in various tasks related to maintaining colony activity. The tasks of the workers change according to their age (age-related ...

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize and to study. Therefore, bees have long been a favored model amongst neurobiologists and neuroethologists for studying the neural basis of social and natural behavior. It is important, however, that the experimental techniques used to study bees do not interfere with the behaviors being studied. Because of this, it has been necessary to develop a range of techniques for pharmacological manipulation of honey bees. In this paper we demonstrate methods for treating restrained or free-flying honey bees with a wide range of pharmacological agents. These include both noninvasive methods such as oral and topical treatments, as well as more invasive methods that allow for precise drug delivery in either systemic or localized fashion. Finally, we discuss the advantages and disadvantages of each method and&#160;describe common hurdles and how to best overcome them. We conclude with a discussion on the importance of adapting the experimental method to the biological questions rather than the other way around.

Neuropharmacological Manipulation of Restrained and Free-flying Honey Bees, Apis mellifera

This manuscript describes several protocols for administering pharmacological agents to honey bees, including simple noninvasive methods for free-flying bees, as well as more invasive variants that allow precise localized treatment of restrained bees.

Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,<em&gt; Apis mellifera</em

Honey bees demonstrate astonishing learning abilities and advanced social behavior and communication. In addition, their brain is small, easy to visualize ...

Anti-RDL and Anti-mGlutR1 Receptors Antibody Testing in Honeybee Brain Sections using CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of gene function. We use this method in this study to check for the specificity of antibodies developed against the insect GABAA receptor subunit Resistance to Dieldrin (RDL) and a metabotropic glutamate receptor mGlutR1 (mGluRA). The antibodies were generated in rabbits against the conjugated peptides specific to fruit flies (Drosophila melanogaster) as well to honeybees (Apis mellifera). We used these antibodies in honeybee brain sections to study the distribution of the receptors in honeybee brains. The antibodies were affinity purified against the peptide and tested with immunoblotting and the classical method of preadsorption with peptide conjugates to show that the antibodies are specific to the corresponding peptide conjugates against which they were raised. Here we developed the CRISPR-Cas9 technique to test for the reduction of protein targets in the brain 48 h after CRISPR-Cas9 injection with guide RNAs designed for the corresponding receptor. The CRISPR-Cas9 method can also be used in behavioral analyses in the adult bees when one or multiple genes need to be modified.

Presented here is a protocol to use the CRISPR-Cas9 system for reducing the production of a protein in the adult honeybee brain to test antibody specificity.

Testes anticorpos anti-RDL e Anti-mglutr1 em seções cerebrais de abelhas usando CRISPR-Cas9

Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) is a gene editing technique widely used in studies of ...

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public health. Once ingested, the viruses must overcome the mosquito midgut barrier to reach the hemolymph, from where they might potentially spread to the salivary glands. When a mosquito bites, these viruses are spread to new vertebrate hosts. Similarly, the mosquito may pick up different viruses. In general, only a tiny portion of viruses may enter the salivary glands via the gut. The transmission efficiency of these viruses to the glands is be affected by the two physical barriers found in different mosquito species: midgut barriers and salivary glands barriers. This protocol presents a method for virus detection in salivary glands of Aedes aegypti&#39;s&#160;following oral feeding and intrathoracic injection infection. Furthermore, determining whether the guts and/or salivary glands hinder viral spread can aid in the risk assessments of MBVs transmitted by Aedes aegypti.

This methodology, which included oral feeding and intrathoracic injection infection, could effectively assess the influence of midgut and/or salivary gland barriers on arbovirus infection.

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Farmacologia Comportamental no condicionamento clássico da Resposta Extensão Proboscis em Abelhas ( Apis mellifera)

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Avaliando o efeito de substâncias químicas ambientais em Honey Bee Desenvolvimento do indivíduo para Colony Nível

Condicionado tátil e Análise do Movimento de estratégias de amostragem antenais de abelhas (

RNAi mediado por Gene Knockdown duplo e Mensuração Percepção gustativa em abelhas do mel (

Propagação de

Preparação de Colônias-coorte único e tratamento hormonal do trabalhador de abelhas para analisar Fisiologia Associated com a função e / ou sistema endócrino

Manipulação neurofarmacologia de contido e vôo livre abelhas do mel,

Testes anticorpos anti-RDL e Anti-mglutr1 em seções cerebrais de abelhas usando CRISPR-Cas9

Infecção viral experimental em mosquitos adultos por alimentação oral e microinjeção