O movimento ortodôntico do dente é um processo biológico complexo que envolve forças externas e remodelação de tecidos moles e duros. Para entender esses processos, é fundamental estudar o dente e os tecidos periodontais dentro do contexto 3D. O modelo murine é um bom candidato para tais estudos devido ao seu tamanho, alta taxa metabólica e as vastas informações genéticas que temos.
No entanto, criar movimento dentário ortodôntico em camundongos não é fácil devido ao seu pequeno tamanho. Além disso, os métodos de análise estrutural geralmente envolvem secção, o que interrompe a estrutura 3D e o contexto do tecido. Para um tecido não uniforme, como o PDL, preservar a estrutura e o contexto 3D é de importância crítica.
Para enfrentar esses dois obstáculos, fornecemos um protocolo para gerar movimento dentário ortodôntico mesial do primeiro molar mandibular em camundongos e descrever dois métodos que permitem a visualização 3D do ligamento periodontal sem seccionar o tecido. Para posicionar o mouse anestesiado para inserção do dispositivo ortodôntico, conecte o incisivo superior ao laço do clipe de papel. Imobilize os incisivos inferiores usando a corrente de alimentação e abra ainda mais a boca com o retrátil do rato mini-colibri.
Aplique uma pequena gota de soro fisiológico em cada olho para evitar a desidratação da córnea. Estas são as ferramentas utilizadas na inserção do dispositivo. Corte um pedaço de fio de alumínio para um centímetro de comprimento.
Utilizando suporte de agulha microcirúrgica, deslize o fio do lado bucal lingually na área interproxmal abaixo do ponto de contato entre o primeiro e o segundo molares. Puxe o fio do lado lingual em direção ao lado mesial do molar. Torça as extremidades livres do fio duas a três vezes para proteger.
Corte um pedaço de titânio de níquel ou mola de bobina NiTi em torno de sete a nove fios de comprimento. Insira a bobina entre o molar inferior e o incisivo, passe uma extremidade livre do fio através de dois fios da bobina e, em seguida, gire as duas extremidades do fio firmemente para fixar a bobina no molar. Remova a corrente de alimentação usando um par de pinças.
Enrole de dois a três fios da bobina sobre o incisivo para ancorar a bobina. Deixe exatamente três roscas ativas entre o primeiro molar e o incisivo. Deslize as ameaças até a margem gengival livre incisivo.
Coloque uma camada de resina composta esvoaçante na borda incisal da bobina e cure-a com luz de cura dental. Substitua a corrente de alimentação após a cura da resina. Corte o excesso de fio ao redor do molar para evitar ferimentos.
Usando a mesma luz de cura, aqueça a bobina NiTi por 20 segundos. Isso vai apertar a bobina, a colocação final deve ser assim. Tecido mole na hemi-mandíbula dissecada pode ser removido com uma limpeza sem fiapos.
Com uma amostra entre dois dedos, esfregue o exterior em movimento circular até que a maior parte do tecido mole seja removida. O resto pode ser cortado usando uma tesoura. A mandíbula limpa é mostrada aqui à direita.
Para montar a hemi-mandíbula dissecada na câmara de amostra da micro tomografia computadorizada, modele uma resina dentária embalada do tamanho de um grão de arroz em um tronco. Em seguida, coloque-o no slot amostral do palco. Coloque a hemi-mandible sobre o composto.
Ajuste a posição até que o primeiro molar esteja centrado na ranhura média e a superfície oclusal esteja horizontal. Cure o composto quando estiver satisfeito com o posicionamento. Este é um exemplo da mandíbula em posição adequada.
Pegue uma pequena bola de resina dentária embalada. Seu diâmetro deve ser em torno da largura do molar. Coloque a resina na superfície oclusal do primeiro molar.
Umedeça o lenço sem fiapos com água. Coloque a limpeza umedecida dentro das piscinas de umidade no estágio amostral. Feche a câmara de amostra e afixe-a na micro CT com parafusos.
Agora tire imagens 2D enquanto baixa a bigorna verticalmente até que a ponta da bigorna esteja cercada pelo composto. Desligue com segurança a fonte de raios-X, abra a câmara micro CT e cure o composto através da janela plexiglass clara. Agora a amostra está montada corretamente e pode ser imageda conforme necessário.
Para gerar amostra de hemi-mandíbula limpa opticamente, prepare as seguintes soluções em tubos de centrífugas de 1,5 mil. 4% paraformaldeído, 50% e 70% etanol em água deionizada. Dois tubos de 100% etanol e cinnamate etílico.
Coloque hemi-mandible dissecada em 4%paraformaldeído. Cubra o tubo com papel alumínio e coloque em um roqueiro em um ajuste suave por seis horas em temperatura ambiente. Depois de seis horas, transfira a amostra para 50% de etanol.
Coloque a amostra de volta no roqueiro por 16 horas coberta de luz. Repita a etapa anterior com uma amostra de 70% de etanol durante 16 horas, seguida de 100% de etanol duas vezes por 16 horas cada vez. Por fim, mova a amostra para o cinnamate etílico por um mínimo de 12 horas.
O movimento ortodôntico confiável é gerado pelo dispositivo de bobina NiTi no primeiro molar mandibular murine. Em nove semanas de camundongos machos, o espaço interproxmal médio é de 40 mícrons após sete dias. O microC de melhoria de fase permite a visualização do PDL.
Após três dias de movimento ortodôntico mesial, a densidade de PDL é reduzida. A interface pdl óssea é mais áspera devido ao desenvolvimento de crateras na superfície óssea, que são indicativas de atividade osteoclástica e resorção óssea. Superfície áspera pode ser vista em todos os níveis das raízes.
Isso mostra que o movimento é translacional em oposição a um movimento de tombamento. No sétimo dia, o espaço PDL é mais estreito do que no terceiro dia e a borda do PDL ósseo na superfície da raiz distal é mais suave, que são sinais de oposição óssea como esperado quando ocorre movimento dentário ortodôntico. Devido ao longo tempo de imagem microC e à rotação do estágio, a montagem segura da amostra é essencial.
Amostra instável onde resulta em varreduras embaçadas onde uma silhueta pode ser vista ao redor da coroa e as fibras PDL não são vistas. A limpeza óptica usando o cinnamate etílico fornece outro método para visualizar o PDL sem secção. O substrato pode ser visto através do ramus de uma amostra adequadamente limpa mostrada aqui à direita.
Este método preserva fluorescência endógena e pode ser usado sem fixação química. A microscopia de folha de luz pode ser usada em amostras limpas. Com um rato transgênico, os revestimentos fluorescentes dos vasos sanguíneos podem ser observados.
Se o osso não foi devidamente limpo, os vasos sanguíneos no PDL não são visíveis como mostrado no painel F.Este protocolo descreveu como superar dois grandes desafios na geração e análise do movimento dontário ortodôntico nos dentes molares mandibulares murinas. Uma vez que a técnica de movimento do dente ortodôntico seja dominada, ela pode ser completada em 15 minutos. Este processo é desafiador devido às pequenas dimensões dos dentes do rato e à presença da língua.
No entanto, fornecemos todas as soluções necessárias para superar esses desafios. A imagem microCÁptica requer um recurso de melhoria de fase. Demonstramos nossa técnica usando uma micro tomografia. No entanto, qualquer configuração que possa gerar melhoria de fase fará, por exemplo, um síncrotron.
Os resultados de compensação do ECi dependem do processo de desidratação. Se a amostra não for transparente o suficiente, nossa sugestão é aumentar o tempo das etapas de desidratação. Nosso método de compensação também pode ser usado em amostras não fixadas.
Os tecidos claros podem ser escaneados na micro TC, uma vez que o processo de compensação não afeta o conteúdo mineral do tecido. Portanto, nosso método fornece uma abordagem correlativa para fluorescência e informações estruturais para gerar uma análise 3D completa.
