Oi, eu sou o Dr.Syed Shadab Raza, o principal pesquisador do Laboratório de Células-Tronco e Neurologia Restaurativa, localizado no Departamento de Biotecnologia do Campus da Era University, Lucknow, Índia. No meu laboratório, nos esforçamos para entender o mecanismo fisiopatológico subjacente aos transtornos de isperfusão da isquemia e as intervenções que podem reverter esses processos. Nesse contexto, frequentemente empregamos o modelo in vitro e in vivo de derrame isquêmico.
Recentemente, criamos um modelo de lesão isquêmica-reperfusão em um embrião de três dias em desenvolvimento de filhotes. Então agora meus alunos vão mostrar como replicar a lesão isquemia-reperfusão em um embrião de três dias desenvolvendo filhotes. Agora vamos mostrar como criar isquemia-reperfusão em um embrião de três dias.
Nosso modelo é econômico, eficaz e altamente reprodutível. Então vamos começar. Dia 1º.
Requisitos para o primeiro dia. Procedimento. Limpe o ovo zero dia com 70% de etanol usando lenços de papel de tecido. Em seguida, escreva o dia atual, data, em ovos com marcador OHP e, em seguida, coloque os ovos em uma incubadora de ovos com uma temperatura de 36 a 37 graus centígrados e 60 a 65% de umidade.
Incubar os ovos pelas próximas 24 horas. Dia 2. Requisitos para o segundo dia. Procedimento.
Limpe a tesoura cirúrgica com 70% de etanol ou seguida por uma autoclave. Após 24 horas de incubação, retire o ovo da incubadora para camadas. Em seguida, conecte um pequeno pedaço de Sellotape de aproximadamente uma polegada de comprimento e largura à borda do ovo e, em seguida, faça um pequeno orifício na borda da casca de ovo usando a tesoura de borda afiada seguida pela inserção de uma seringa de cinco mL em ângulo de aproximadamente 75 graus.
Depois de inserir a agulha no saco de gema, retire lentamente de cinco a seis mL de albumina. Depois de remover a albumina, resseque o buraco com Sellotape e coloque de volta o ovo na incubadora de ovos centígrados de 37 graus pelas próximas 48 horas. Dia 4.
Requisitos para o quarto dia. Procedimento. Prepare a solução do Ringer, soro fisiológico 0,9% normal e um soro fisco x tampão de fosfato de acordo com as tabelas fornecidas neste manuscrito. Em seguida, autoclave as três soluções.
Após a autoclave, as respectivas soluções podem ser colocadas à temperatura ambiente. Em seguida, retire o ovo da incubadora de ovos de 37 graus. Agora, antes de cortar a concha, cubra a área de janelas com Sellotape.
E agora faça um pequeno buraco na casca de ovo e comece a cortar uma abertura circular. Esse processo é conhecido como janela. Certifique-se de que o corte circular é grande o suficiente para que o embrião possa ser facilmente acessível de qualquer direção, pois o posicionamento do ovo pode ter que ser ajustado de acordo com a posição do embrião.
Agora, usando um microscópio cirúrgico de zoom estéreo, localize a artéria vitallina direita ou RVA. Aqui, a seta indica o estágio de desenvolvimento do embrião de três dias. Uma vez que o RVA esteja localizado, com o uso de uma agulha de 26 G faça dois pequenos orifícios nos lados esquerdo e direito da RVA.
Em seguida, ajuste a sonda de imagem de fluxo sanguíneo Doppler no RVA. A sonda de imagem de fluxo sanguíneo Doppler deve ser colocada cinco mais menos um milímetro do local da isquemia e dois terços da extremidade distal da RVA. Faça a leitura do fluxo por 30 segundos a dois minutos, conforme desejado.
Isso fará a leitura da fase da normoxia. Agora molde manualmente a borda da agulha espinhal para dar à borda uma forma de gancho com a ajuda de um plier de nariz seguido de fórceps de dentes. Agora, usando um micro manipulador, insira a agulha espinhal logo abaixo da artéria vitalina direita.
Você está pronto para levantar a agulha espinhal. Agora, com a ajuda do micro manipulador, levante lentamente a artéria até que o fluxo sanguíneo Doppler mostre uma diminuição mínima de 80% no fluxo arterial. Uma vez que uma queda de 80% ou mais no fluxo Doppler seja alcançada, deixe a agulha espinhal levantada para cima, puxando a artéria por cinco minutos.
Este será o período de isquemia. Após este tempo isquêmico de cinco minutos, solte lentamente a artéria com a ajuda de micro manipulador para restaurar os níveis normais de fluxo sanguíneo. Agora, o medidor de fluxo sanguíneo Doppler deve mostrar leituras semelhantes às observadas durante a normoxia.
Este será o período de reperfusão na RVA. Após o processo de I/R, aplique duas, três gotas de 1X PBS no embrião. Por fim, recure a janela com Sellotape e, em seguida, coloque o ovo de volta na incubadora de ovos por cinco horas e 55 minutos.
Depois de cinco horas e 55 minutos, retire o ovo da incubadora de ovos e coloque na bandeja de ovos e reabra a janela. Requisitos de tratamento. Procedimento. Para o tratamento das artérias com os medicamentos, ativadores ou inibidores, o RVA deve ser extirpado após uma hora de processo de I/R.
Remova o embrião da casca, retirando-o da casca em uma placa de Petri estéril de 100 mm. Uma vez que o embrião é liberado na placa de Petri, extirlie o RVA usando íris ocular na orientação do microscópio cirúrgico de zoom estéreo. A dimensão de excisão de RVA deve ser de até 15 mais menos um milímetro distal do tronco e dois mais menos um milímetro em direção ao tronco.
Depois de excisar o RVA, lave-o com 1X PBS em uma nova placa de Petri estéril. Para os tratamentos desejados, coloque a artéria em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro esterilizado cheio com 500 microliters da solução de Ringer. E depois de colocar a artéria no tubo de centrífuga, coloque na incubadora de laboratório centígraa de 37 graus por cinco horas.
Após cinco horas de incubação, retire o RVA da incubadora de laboratório centígrados de 37 graus e prossiga para os tratamentos desejados. E agora, para apresentar os resultados. Para verificar a utilidade do nosso modelo na pesquisa isquêmica-reperfusão em artérias isquêmicas, primeiro analisamos as atividades das proteínas reguladoras de oxigênio 150 ou ORP150, superóxido citoplasmático dismutase um ou SOD1 e catalase.
Os RVAs tratados com I/R apresentaram aumento da atividade de ORP150, CITOplasmismo SOD1 e catalase quando comparados ao grupo controle, no entanto, suplementando com N-acetil-L-cisteína, ou NAC, um quencher ROS, redução do estresse oxidativo no grupo I/R, como pode ser evidente na figura atual. Para estabelecer a utilidade deste modelo para investigações inflamatórias, analisamos a expressão de I/R-1 beta e TNF-alfa em RVAs tratadas com I/R versus RVAs de controle. Ambas as interleucinas foram encontradas como super-expressas no grupo Hook-I/R em comparação com o grupo de controle.
A suplementação de Naringenin, uma droga anti-inflamatória, reduziu significativamente os níveis de IL1-beta, bem como TNF-alfa. Em seguida, examinamos a expressão de NLRP3 e NF-kappa beta através de manchas ocidentais. Esta análise descobriu evidências de ativação do NLRP3 inflamasome, bem como NF-kappa beta em resposta à I/R produzida na RVA.
Semelhante aos resultados anteriores, Naringenin reduziu a expressão de NLRP3 e NF-kappa beta. Esses resultados demonstraram que nosso modelo poderia ser usado para investigar alterações inflamatórias. Em seguida, examinamos o efeito da I/R nas vias de apoptose e autofagia.
Primeiro, na figura A, acessamos a expressão de caspase-3. Observou-se uma expressão aprimorada de caspase-3 no grupo I/R em comparação com o grupo controle, enquanto o grupo I/R que recebe ZVADFMK mostrou uma diminuição na expressão de caspase-3. Da mesma forma para a autofagia, o grupo I/R apresentou altos níveis de proteína de LC3, marcador autofagosário Beclin-1, um regulador chave da autofagia em células mamíferas, e ATG-7, uma proteína necessária para a autofagia basal, do que o grupo controle, enquanto os grupos que receberam 3-ma, um inibidor de autofagia, mostraram uma diminuição na expressão das três proteínas autofagia acima, como evidente das figuras B a D.A figura E demonstra o efeito de I/R mediado por gancho nos níveis ambra-1 e ATG-7 mRNA.
Esses resultados estiveram em consonância com os resultados anteriores, ou seja, observou-se expressão mRNA aprimorada para ambra-1 e ATG-7 em RVAs tratadas com I/R em comparação com seus respectivos controles. No entanto, os resultados foram revertidos quando 3-ma foi adicionado ao grupo I/R. A figura atual representa a eficácia do nosso modelo para estudar as alterações no DNA.
Observamos uma intensa mancha de DNA no grupo tratado de I/R em comparação com o grupo controle. No entanto, a suplementação do NAC para o grupo I/R RVA reverteu o resultado. Para examinar o quão eficaz nosso modelo é em contraste com outros modelos, comparamos os dados gerados pelo nosso modelo Hook-I/R e o modelo MCAO no presente experimento.
Resumindo, a expressão da proteína apoptótica, caspase-3, as proteínas autofagia, Beclin-1 e ATG-7, e as interleucinas inflamatórias, TNF e IFN, foi obrigada a ser maior em RVAs tratadas com I/R do que em RVAs de controle. Curiosamente, o modelo Hook-I/R apresentou resultados muito semelhantes aos obtidos pelo modelo MCAO, seja a análise de estresse inflamatório ou vias de morte celular. Nosso modelo pode ser usado para experimentos de reperfusão de isquemia de rotina, sozinhos ou paralelos aos modelos existentes.
No entanto, durante a imitação da isquemia-reperfusão, deve-se tomar uma precaução mais elevada durante a realização de furos, lado direito e esquerdo da RVA, e também durante o oclusão ou liberação do RVA para que não danifique nenhuma artéria ou veia. Na biologia molecular de rotina, como a mancha ocidental, o analisador QRT-PCR, ácidos químicos e técnicas de imagem poderiam ser improvisados para associar a fisiopatologia associada à isquemia-reperfusão em três dias desenvolvendo embrião de filhotes. Este modelo poderia ser usado eficientemente para estudar mecânica molecular nos níveis de DNA, RNA e proteína.
Como mostramos, a modelagem de I/R em um embrião de pintinho em desenvolvimento de três dias, acreditamos que nosso modelo abrirá novos caminhos no campo da pesquisa de I/R. Com este trabalho, desejo-lhe tudo de bom para suas experiências. Obrigado.
