O protocolo reduz significativamente o número de cópia de DNA mitocondrial no oócito. Isso pode ser benéfico para a clonagem de espécies intraespécies. Este método reduz em mais de 90% os números de cópias de DNA mitocondrial em oócitos bovinos, o que poderia reduzir a incidência de heteroplasmia mitocondrial em embriões clonados.
Laura Adams, uma estudante de doutorado do meu laboratório, vai demonstrar o procedimento. Para começar, usando uma pipeta, colete os oócitos maduros selecionados da gota HSOF e coloque-os no tubo de 1,5 mililitro contendo 50 microliters da solução HSOF CB. Centrifugar os oócitos a 15.000 vezes G por 12 minutos.
Enquanto os oócitos estão sendo centrifugados, prepare a placa de biseção. Para isso, comece fazendo um padrão na tampa de uma placa de Petri de 60 milímetros usando 20 microliters por gota, e cubra totalmente as gotas com óleo mineral. Usando um marcador fino, marque as linhas por baixo do prato.
Cubra o prato com uma tampa opaca até que a centrifugação esteja completa para evitar alterações de osmolaridade de microdrops. Assim que a centrifugação estiver completa, use uma pipeta de 200 microliter para coletar os oócitos dentro da solução, e mova-os para uma porção vazia de uma nova placa de pesquisa com quatro, 400 gotas de HSOF microliter, antes de lavar os oócitos através de gotas de HSOF. Ligue o estágio de aquecimento para 38,5 graus Celsius.
Use uma pipeta bucal para mover os oócitos centrifugados da gota HSOF para a gota T2 superior esquerda da placa de biseção. Em seguida, lave os oócitos através das próximas três gotas na linha superior. Deposite os oócitos em uma das gotas de pronase, assegurando que há pouco ou nenhum contato entre eles.
Observe os oócitos até que haja deformação clara da zonae pellucidae. Uma vez que uma única zona oocyte pellucida se tornou deformada, mova esse oócito para a queda T2 vizinha. Repita à medida que os oócitos adicionais se deformam, até que todos os oócitos tenham sido removidos do pronase e colocados na queda do T2.
Observe os oócitos até que apenas uma fina camada da zona pellucida permaneça. Lave os oócitos através das próximas três gotas dentro da linha e, em seguida, deposite-os em linhas verticais dentro das gotas CBT20. Comece com menos oócitos nas linhas verticais, e aumente o número de oócitos por gota à medida que as habilidades de biseção progredirem.
Concentre-se na primeira gota cbt20 mais esquerda que contém oócitos, e use uma pipeta bucal para girar os oócitos de modo que a porção mitocondria-densa de cada oócito esteja voltada para ou para longe do braço do microscópio. Descanse a ponta do microplade à esquerda do oócito mais alto, em linha com o espaço diretamente acima da porção mitocôndria-densa. Mantendo a ponta da lâmina no mesmo lugar, abaixe cuidadosamente a lâmina para cortar todo o caminho através do oócito.
Certifique-se de que o ooplasto denso-denso mitocôndria e mitocôndrias reduzidas são do mesmo tamanho, e a lâmina está bissectando no segmento mais claro do oócito centrifuso. Ao levantar a lâmina, certifique-se de que a mesma linha está mantida, e que a ponta da lâmina permaneça no mesmo lugar, em seguida, levante suavemente a ponta da placa. Repita os passos de biseção para todos os oócitos dentro da primeira queda de biseção.
Se os oócitos estiverem presentes em gotas adicionais, oriente e bissecto os oócitos restantes. Usando uma pipeta bucal, colete ooplastos reduzidos por mitocôndrias da primeira queda de biseção. Coloque-os na gota T20 da mão esquerda localizada na linha inferior da placa.
Repita todas as gotas de biseção restantes. Usando uma pipeta bucal, colete mitocôndrias densas ooplastas da primeira gota de biseção. Coloque-os na gota T20 da mão direita localizada na linha inferior da placa.
Repita todas as gotas de biseção restantes. Recupere o prato T10 de quatro poços da incubadora. Usando uma pipeta bucal, mova todos os ooplastos reduzidos de mitocôndrias para o mr bem rotulado, e mova os ooplastos mitocondria-densos para o bem rotulado M.Coloque a placa de quatro poços de volta na incubadora controlada por dióxido de carbono.
Deixe os ooplastos descansarem por pelo menos 30 minutos antes da quantificação do mtDNA. Para uma biseção bem sucedida, as amostras de oócitos inteiros e ooplastos mitocôndrias-densas têm valores de tomografia semelhantes. As amostras de ooplastas reduzidas por mitocôndrias têm valores de tomografia mais elevados quando comparadas com as amostras dos outros dois grupos.
Para uma biseção mal sucedida, a biseção não reduz efetivamente o teor de mtDNA nos ooplastos reduzidos por mitocôndrias. Após a produção de uma curva padrão e o uso das fórmulas de número de cópia de mtDNA fornecidas, foi alcançada uma redução média de oócito mtDNA de 93,88% utilizando este protocolo. Orientar corretamente cada oócito na queda da biseção, bissectar precisamente cada oócito e classificar com precisão os ooplastos, são passos críticos a serem tomados para obter resultados bem-sucedidos.
Dois ooplastos podem ser fundidos com uma célula somática. Os trigêmeos fundidos podem então ser quimicamente ativados e cultivados como embriões reconstruídos.
