Este protocolo descreve um método rápido e simples para gerar culturas primárias de melanócitos e fibroblastos a partir de camundongos. Como essa técnica não exige que a epiderme e a derme sejam separadas, ela pode ser realizada de forma rápida e consistente com treinamento mínimo. Este método pode ser usado para estudar a melanócito cutâneo e a biologia do fibroblasto.
Experimentos nessas culturas podem fornecer insights relevantes para os defeitos de câncer, cicatrização de feridas e pigmentação. Antes de começar, certifique-se de preparar todos os reagentes necessários e verificar a temperatura do banho de água. Se você planeja processar várias amostras, consulte o guia de dimensionamento do reagente na Tabela Um.
Demonstrando este procedimento será Brandon Murphy, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Em um gabinete de fluxo laminar, role brevemente o tronco de cada rato eutanizado em uma placa de Petri estéril contendo 70% de etanol. Retire o rato do etanol e coloque-o em uma placa de Petri vazia estéril.
Em seguida, esterilizar a tesoura cirúrgica em 70% de etanol. Use estas tesouras para fazer uma incisão na pele no lado ventral do tronco, começando pelo pescoço e continuando até a cauda. Usando fórceps estéreis, retire a pele do tronco do camundongo e remova o excesso de tecido adiposo do lado dérmico da pele.
Coloque a pele, derme lado para baixo, em um prato de seis poços contendo três mililitros de solução antimíctica antibiótico 1X. Incubar em temperatura ambiente por dois a três minutos. Em seguida, ligue o helicóptero de tecido e ajuste as configurações para as mostradas aqui.
Certifique-se de ter cuidado ao instalar a lâmina do helicóptero de tecido e ao operar a máquina. Transfira a pele, dermis lado para baixo, para um prato de helicóptero de tecido estéril e passe a pele completamente através do helicóptero de tecido três vezes. Depois disso, transfira a pele homogeneizada para um tubo cônico estéril de 15 mililitros contendo três mililitros de tampão de digestão da pele.
Usando uma micro-pipeta P1000, misture a suspensão resultante por pipetar para cima e para baixo vigorosamente 10 a 15 vezes. Cape o tubo cônico e incubar a amostra em um banho de água a 37 graus Celsius por 15 minutos, certificando-se de inverter o tubo a cada três ou cinco minutos. Em seguida, centrifugar o tubo em um rotor de balde balançando a 750 vezes G à temperatura ambiente por cinco minutos para pelotar as células na pele homogeneizar.
Use uma micro-pipeta P1000 para remover lentamente e completamente o tampão de digestão da pele, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Certifique-se de aspirar todo o tampão de digestão da pele. Se você estiver tendo problemas, lave a pelota celular com dois a três mil de mídia melanócito e repita a centrifugação e remova o excesso de tampão de digestão da pele.
Em seguida, resuspense completamente a pelota celular em um mililitro de mídia melanócito, pipetando para cima e para baixo 15 a 20 vezes com uma pipeta P1000. Transfira a solução celular resultante cair sábio para um poço não revestido em um prato de seis poços que contém um mililitro de mídia melanócito. Incubar a pele banhada homogeneizar em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% por 40 minutos.
Depois disso, transfira a cultura supernante do prato não revestido para um poço de um colágeno pré-lavado revestido seis bem prato. Adicione G-418 à mídia, de tal forma que a concentração final seja de 100 nanogramas por mililitro. Adicione dois mililitros de mídia fibroblasto a um poço do prato não revestido agora contendo fibroblastos adeptos.
Incubar ambas as culturas durante a noite em uma incubadora de cultura tecidual a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Após 16 a 24 horas de incubação, aspirar separadamente a mídia e quaisquer detritos de cada cultura. Lave cada prato duas vezes usando um mililitro de PBS para cada lavagem.
Em seguida, adicione dois mililitros de mídia de melanócito fresco à cultura melanócito e adicione dois mililitros de mídia de fibroblasto fresco à cultura do fibroblasto. Neste estudo, culturas de fibroblasto e melanócito são geradas simultaneamente a partir da mesma amostra de pele. Quando a pele homogeneizada é banhada pela primeira vez, a mídia parece turva.
No entanto, após a incubação de grandes conglomerados celulares e fibroblastos de células aderentes tornam-se visíveis no prato. As células não aderentes da cultura são transferidas para um prato revestido de colágeno e tratadas com G-418. Fibroblastos mortos pelo G-418 são vistos flutuando no meio de cultura melanócito pelos próximos cinco dias.
Depois de quatro a cinco dias na cultura, os melanócitos banhados começam a assumir um fenótipo dendrático com grânulos melanócitos. Este fenótipo persiste na passagem, enquanto grupos de queratinócitos contaminantes são perdidos. A pureza das culturas de melanócitos e fibroblastos resultantes é confirmada usando citometria de fluxo.
A expressão do marcador de melanócitos GP100 é específica para as culturas de melanócitos, enquanto o marcador de fibroblasto, FSP1, é encontrado apenas nos fibroblastos primários. Controle As células queratinócitos C59 são as únicas culturas que mancham positivo para o marcador de queratinócito, K14. Análises adicionais são realizadas para determinar quanto tempo leva para estabelecer culturas enriquecidas de melanócitos.
As células positivas GP100 começam a aparecer no quarto dia e atingem o pico após 10 dias na cultura. Este procedimento pode ser usado para gerar rapidamente culturas de melanócitos e fibroblastos para uma variedade de ensaios omicos in vitro e de alto rendimento.
