Name: techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus
Uploaded: 2024-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 10 s
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Este trabalho foi apoiado pelo R24OD031956 de concessão OD do NIH. Agradecemos a Samantha Jalbert, Jill Ralston e Cora Anderson por sua assistência e apoio, bem como ao nosso editor e revisores anônimos por seus comentários úteis

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas e regulamentos do IACUC (Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais) da Harvard Medical School (IS 00001365_3). Os resultados representativos são mostrados para um macho albino maduro perfundido e não perfundido Xenopus laevis.
1. Preparação experimental 
NOTA: Se o protocolo de perfusão8 estiver sendo seguido antes da amostragem, pule para a etapa 2.2.
<ol><li>Certifique-se de que a instituição de pesquisa aprovou a técnica de eutanásia descrita neste protocolo.</li>
	<li>Preparar uma solução de 5 g/L de MS-222 (metanossulfonato de tricaína) e 5 g/L de bicarbonato de sódio (ver Tabela de Materiais). O volume deve ser superior ao volume necessário para cobrir completamente os animais sujeitos à eutanásia. Verifique o pH para garantir que esteja ≥7.</li>
	<li>Realizar a eutanásia primária colocando o Xenopus na solução de eutanásia; O animal permanecerá submerso por um total de 1 h.</li>
	<li>Configure a estação de dissecação para que, imediatamente após a amostragem, todos os tecidos possam ser enxaguados em PBS resfriado ou PBS9 0,7x (dependendo das necessidades experimentais), verificados e aparados sob uma luz de ampliação de 5x (ou mais). Esta estação também deve permitir que o usuário substitua todas as pinças e tesouras ou limpe-as entre os usos.</li>
	<li>Uma vez que a rã esteja na solução por 1 h, a eutanásia primária foi concluída. Remova o sapo e verifique a perda de resposta à dor realizando uma pitada no pé.</li>
	<li>Registre os detalhes apropriados para o animal, como espécie, cepa, sexo, idade e estado de saúde, bem como se ele foi perfundido. Pese o Xenopus e faça medições adicionais, como o comprimento do focinho-respiradouro.</li>
	<li>Coloque o sapo de costas e prenda os membros proximais ao corpo (Figura 1).</li>
	<li>Usando uma tesoura de dissecção, corte a pele, suba pela linha média e depois lateralmente, fazendo dois retalhos.</li>
	<li>Consultando a Figura 2, identifique a linha alba e use uma pinça para agarrá-la e puxá-la para longe da cavidade celômica. Corte a musculatura cuidadosamente usando uma tesoura. Faça duas abas fora da parede da cavidade. Corte ou prenda todas as abas fora do caminho.</li>
	<li>Identifique o coração que ainda estará batendo. Use uma tesoura de dissecação para reduzir os ossos coracóides (Figura 2) para obter melhor acesso ao coração. NOTA: Se o coração parou de bater antes da amostragem, deve-se observar que o frescor da amostra foi comprometido.</li>
</ol>2. Amostragem
NOTA: Se o animal foi perfundido, pule para a etapa 2.2.
<ol><li>Identifique o pericárdio fino e puxe-o com uma pinça de tecido (Figura 3).</li>
	<li>Usando a ponta da tesoura de iridectomia, perfure suavemente o pericárdio, tomando cuidado para não cortar os tecidos subjacentes. Descasque o pericárdio para longe das 3 câmaras do coração.</li>
	<li>Use uma pinça para agarrar o ventrículo pelo ápice, identificar onde ele se liga às aurículas e ao tronco arterial (Figura 4) e cortá-lo abaixo dessas inserções (Figura 5). Se necessário, apare o ventrículo para que nenhum tecido das aurículas ou do tronco arterial fique visível, e o tecido da válvula de cor clara ainda seja visível dentro do ventrículo. NOTA: Em animais não perfundidos, a remoção do ventrículo pode ser qualificada como eutanásia secundária.</li>
	<li>Os 3 lobos do fígado serão visíveis (Figura 6 e Figura 7). Segure a borda do lobo esquerdo (à direita do espectador) e levante-a suavemente para que os ductos hepáticos e císticos fiquem visíveis (Figura 8). Faça uma amostra do 1/3 inferior do lóbulo abaixo desses acessórios (Figura 9).</li>
	<li>Para obter melhor acesso aos tecidos de uma rã, é útil remover o ovário. Identifique o ovário que está envolto em uma camada de peritônio visceral chamada epitélio germinativo. Desloque suavemente os lóbulos até que estejam em seus respectivos lados para tornar a área de fixação visível (Figura 10). Esses anexos são diretamente ventrais ao rim emparelhado.</li>
	<li>Usando uma tesoura, remova os ovários o mais próximo possível dos rins sem danificá-los (Figura 11).</li>
	<li>Inspecione o lobo medial (também chamado de lobo anterior) do fígado e observe como ele se conecta ao estômago e ao duodeno através do mesentério e do ducto hepatopancreático (também chamado de ducto colédoco comum) (Figura 6, Figura 7 e Figura 8).</li>
	<li>Corte o mesentério, o ligamento hepatoduodenal usando uma tesoura de iridectomia, bem como o ducto hepatopancreático onde ele encontra o duodeno. Corte a conexão do pâncreas e do ducto hepatopancreático ao lobo medial do fígado para que nenhum tecido hepático escuro fique preso (Figura 12).</li>
	<li>Segure o estômago com uma pinça dentada e a extremidade superior do pâncreas com uma pinça de tecido. Sob ampliação de 5x, retire suavemente o pâncreas do estômago (Figura 13). NOTA: Se não sair limpo, o tecido pancreático restante ficará visível e poderá ser retirado em fragmentos. Alternativamente, o pâncreas pode ser metodicamente descolamento usando tesouras de iridectomia e pinças de tecido.</li>
	<li>Consultando a Figura 14A, identifique a bexiga urinária e remova-a, cortando o mais próximo possível da cloaca. Descarte este lenço.</li>
	<li>Consultando a Figura 14B, identifique o intestino grosso e puxe-o para cortar o intestino grosso o mais próximo possível da cloaca. Remova e descarte todo o canal alimentar, cortando o peritônio onde ele se liga ao baço. Os corpos gordos agora estarão totalmente acessíveis.</li>
	<li>Separe os corpos gordurosos para que fiquem de lado. A área sobre o rim, onde o corpo gorduroso se conecta ao peritônio, será visível. Segure a base do corpo gorduroso esquerdo (à direita do espectador) e use uma tesoura para cortá-lo do peritônio, deixando uma pequena margem para que o rim não seja danificado (Figura 15).</li>
	<li>Remova e descarte o corpo gordo restante. Os rins emparelhados agora estarão totalmente visíveis.</li>
	<li>Em rãs fêmeas ou machos com ovidutos vestigiais distintos, segure um oviduto e puxe-o para longe do rim e da cloaca (Figura 16). Corte o oviduto onde ele encontra a cloaca e continue a puxá-lo para longe do rim, cortando quaisquer anexos peritoneais claros à medida que se tornam aparentes. Descarte este lenço.</li>
	<li>Repita este processo com o oviduto restante.</li>
	<li>Os rins ainda estão cobertos por peritônio claro (retroperitoneal)10. Use uma pinça para agarrar os rins e cortar o peritônio em sua extremidade inferior.</li>
	<li>Levante os rins para fora da cavidade celômica, usando uma tesoura para cortar o peritônio o mais próximo possível dos rins sem danificá-los (Figura 17).</li>
	<li>Sob ampliação de 5x, corte o excesso de peritônio e qualquer outro tecido remanescente (corpos de gordura, baço). Se o sapo for fêmea, certifique-se de que qualquer tecido ovariano restante seja removido (Figura 18). Se o sapo for macho, remova cuidadosamente o testículo e verifique se há um oviduto vestigial, que pode não ser visível sem ampliação (Figura 19).</li>
	<li>Remova os pinos do animal, vire-o em seu ventrum e prenda novamente os membros do animal.</li>
	<li>Selecione o membro posterior para amostrar e fixe o pé desse membro.</li>
	<li>Remova uma aba de pele em forma de amêndoa sobre o gastrocnêmio / tibiofíbula (Figura 20).</li>
</ol>

Protocolo Padronizado de Dissecção e Amostragem para Órgãos Xenopus Adultos

<ol>
	<li>Porro, L. B., Richards, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+dissection+of+the+model+organism+Xenopus+laevis+using+contrast-enhanced+computed+tomography.">Digital dissection of the model organism Xenopus laevis using contrast-enhanced computed tomography.</a> J Anat. 231 (2), 169-191 (2017).</li><li>Ruehl-Fehlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--part+1.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1.</a> Exp Toxicol Pathol. 55 (23), 91-106 (2003).</li><li>Kittel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice--Part+2.+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--Part 2. A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 413-431 (2004).</li><li>Morawietz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+guides+for+organ+sampling+and+trimming+in+rats+and+mice+-+Part+3+-+A+joint+publication+of+the+RITA+and+NACAD+groups.">Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice - Part 3 - A joint publication of the RITA and NACAD groups.</a> Exp Toxicol Pathol. 55, 433-449 (2004).</li><li>Patmann, M. D., Shewade, L. H., Schneider, K. A., Buchholz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+tadpole+tissue+harvest.">Xenopus tadpole tissue harvest.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017 (11), 097675 (2017).</li><li>L&#337;w, P., Moln&#225;r, K., Kriska, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+Frog+(Rana+sp.).">Dissection of a Frog (Rana sp.).</a> Atlas of Animal Anatomy and Histology. , 213-263 (2016).</li><li>O'Rourke, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+used+in+research+and+teaching.">Amphibians used in research and teaching.</a> ILAR J. 48 (3), 183-187 (2007).</li><li>Jonas-Closs, R. A., Peshkin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+rapid+blood+perfusion+in+Xenopus.">Effective rapid blood perfusion in Xenopus.</a> JoVE. (issue), e65287 (2023).</li><li>Balls, M., Worley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibian+cells+in+vitro.+II.+Effects+of+variations+in+medium+osmolarity+on+a+permanent+cells+line+isolated+from+Xenopus.">Amphibian cells in vitro. II. Effects of variations in medium osmolarity on a permanent cells line isolated from Xenopus.</a> Exp Cell Res. 76 (2), 333-336 (1973).</li><li>Holz, P. H., Raidal, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+renal+anatomy+of+exotic+species.">Comparative renal anatomy of exotic species.</a> Vet North Am Exot Anim Pract. 9 (1), 1-11 (2006).</li><li>Trott, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Mycobacterium+ulcerans-like+infection+in+a+colony+of+African+tropical+clawed+frogs+(Xenopus+tropicalis).">Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis).</a> Comp Med. 54 (3), 309-317 (2004).</li><li>Fremont-Rahl, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+liflandii+outbreak+in+a+research+colony+of+Xenopus+(Silurana)+tropicalis+frogs.">Mycobacterium liflandii outbreak in a research colony of Xenopus (Silurana) tropicalis frogs.</a> Vet Pathol. 48 (4), 856-867 (2011).</li><li>Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+hyperstimulation+syndrome+in+gonadotropin-treated+laboratory+South+African+clawed+frogs+(Xenopus+laevis).">Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis).</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 46 (3), 64-67 (2007).</li><li>Vitt, L. J., Caldwell, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+amphibians+and+reptiles.+Herpetol.">Anatomy of amphibians and reptiles. Herpetol.</a> Herpetol. , 35-81 (2009).</li></ol>

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Como este protocolo visa maximizar o frescor, algumas amostras podem incluir tecidos indesejados. Por exemplo, o ducto hepatopancreático e algum mesentério são amostrados com o pâncreas, e algum tecido peritoneal, glândulas supra-renais e ureteres sempre serão amostrados com os rins pareados.  Se o frescor não for uma preocupação, uma amostragem mais precisa pode ser obtida usando técnicas modificadas.
A aparência e a localização dos órgãos são comparáveis entre os sexos e as...

Embora a "dissecação digital" de Xenopus adulto esteja disponível1, a amostragem replicável de órgãos e tecidos de Xenopus adulto permanece um desafio sem as instruções detalhadas disponíveis para outros modelos adultos (por exemplo, camundongos 2,3,4). Este artigo tem como objetivo fornecer orientações claras para amostragem precisa e replicável de órgãos de Xenopus adultos, semelhante ao que está atualmente disponível para suas larvas5. A ênfase é colocada na facilidade de conclusão para manter o máximo de frescor e tornar o protocolo acessível a todos os usuários.
Embora exista um guia de dissecação completo para Rana sp.6, bem como vários guias de dissecação em sala de aula para outros anuros7, nenhum guia de dissecação e amostragem de Xenopus está disponível atualmente. Para aqueles que não estão familiarizados com as práticas de amostragem ou anatomia dos anfíbios, as pequenas diferenças entre Xenopus e outros anuros tornam esses recursos abaixo do ideal para amostragem de tecido replicável.
Muitos tecidos valiosos não estão incluídos e são até descartados no presente guia; Isso é para garantir o frescor do tecido. Seis amostras são limitadas o suficiente para garantir que esses tecidos possam ser coletados em menos de uma hora após o coração começar a bater, independentemente da experiência ou nível de habilidade do usuário. Guias mais avançados e detalhados para coletar muitos outros tecidos estão sendo preparados como artigos complementares separados.
Para usuários menos experientes, é sempre recomendável que este protocolo seja tentado primeiro em animais que estão sendo sacrificados por outros motivos que não a experimentação antes de amostrar quaisquer animais que sejam difíceis de substituir (ou seja, transgênicos, animais de idade avançada, etc.). Idealmente, todos os animais amostrados serão saudáveis e, se fêmeas, não terão ovulado nas últimas duas semanas.

<table><tbody><tr><td>5x Magnifying Glass with LED Light and Stand</td><td>amazon.com</td><td>B08QJ6J8P1</td><td>light must not produce heat</td></tr><tr><td>Disposable Transfer Pipets</td><td>VWR</td><td>414004-036</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Fine-Pointed Forceps</td><td>Fisher Scinetific</td><td>08-875</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissors sharp piont, straight 6.5&quot;</td><td>VWR</td><td>76457-374</td><td></td></tr><tr><td>Dissection Tray</td><td>Fisher Scinetific</td><td>14-370-284</td><td>styrofoam sheets are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>Euthanasia container</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;2860</td><td>alternative opaque containers acceptable</td></tr><tr><td>Euthanasia container lid</td><td>US Plastic&amp;nbsp;</td><td>Item&amp;nbsp;3047</td><td></td></tr><tr><td>Iridectomy Scissors 6&quot;</td><td>vwr</td><td>470018-938</td><td>iris scissors are an acceptable alternative</td></tr><tr><td>MS-222: Syncaine (formerly tricaine)</td><td>Pentair AES</td><td>TRS1</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate, Powder, USP</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-606-333</td><td></td></tr><tr><td>Specimen Forceps, Serrated</td><td>VWR</td><td>82027-442</td><td></td></tr><tr><td>T-Pins for Dissecting</td><td>Fisher Scinetific</td><td>S99385</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for rapidly sampling six crucial organs in adult xenopus

Xenopus tem sido um poderoso organismo modelo para entender o desenvolvimento e a doença dos vertebrados por mais de cem anos. Embora as técnicas de análise experimental e dissecação do embrião tenham sido bem documentadas, as descrições das estruturas e órgãos adultos de Xenopus , juntamente com as técnicas para trabalhar com adultos, não foram atualizadas para levar em consideração os requisitos de abordagens modernas como proteômica quantitativa e transcriptômica de célula única. As perspectivas centradas no tipo celular e no gene requerem observações contrastantes em estágios embrionários com as dos tecidos adultos. Os órgãos da larva sofrem mudanças significativas em sua estrutura geral, morfologia e localização anatômica ao longo da transição larval para adulta, principalmente durante a remodelação maciça da metamorfose. O estabelecimento de padrões robustos para identificação e dissecção de órgãos é crucial para garantir que os conjuntos de dados resultantes de estudos realizados em diferentes laboratórios possam ser consistentes. O presente protocolo identifica seis dos órgãos do Xenopus adulto, demonstrando métodos para dissecção e amostragem do ventrículo cardíaco, fígado, corpo adiposo, pâncreas, rim pareado e pele do Xenopus adulto. Dependendo dos métodos de preservação, os órgãos dissecados podem ser usados para proteômica quantitativa, transcriptômica de célula única/núcleo, hibridização in situ , imuno-histoquímica, histologia, etc. Este protocolo visa padronizar a amostragem de tecidos e facilitar as investigações multilaboratoriais dos sistemas de órgãos adultos.

Utilizando a Figura 1 à Figura 20 e seguindo todas as etapas deste protocolo, o ventrículo cardíaco, o lobo esquerdo do fígado, o pâncreas, os corpos adiposos esquerdos, rins pareados e um retalho de pele foram excisados de forma limpa dentro de uma hora após a eutanásia. Dentro desse tempo, as amostras são enxaguadas e aparadas para que apareçam, conforme mostrado na Figura 21.
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Autor em destaque: Padronizando a amostragem de tecidos em pesquisa proteômica e imunoquímica

Este artigo apresenta um guia para amostragem de seis órgãos significativos e diversos em Xenopus adultos que podem ser acessados de forma rápida e fácil: o ventrículo cardíaco, o lobo do fígado, o pâncreas, os corpos adiposos, os rins pareados e a pele.

Técnicas para amostragem rápida de seis órgãos cruciais em Xenopus adultos

Xenopus has been a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease for over a hundred years. While experimental analysis and ...

Antes deste trabalho, desenvolvi um protocolo para perfusão rápida de anfíbios. Este protocolo deve ser utilizado antes da amostragem para pesquisas como proteômica e imunoquímica, onde a presença de quantidades excessivas de sangue nos tecidos é indesejável. Embora existam muitos diagramas e outros auxílios disponíveis, atualmente não há guias abrangentes sobre como dissecar tecidos de xenopus adulto de forma rápida e confiável.Esperamos que as técnicas de amostragem padronizadas permitam que os laboratórios compartilhem tecidos facilmente. Isso é especialmente vantajoso em situações em que a importação e exportação de animais não é possível devido a preocupações de biossegurança ou restrições de transporte.

techniques-for-rapidly-sampling-six-crucial-organs-in-adult-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Rapidly Sampling Six Crucial Organs in Adult Xenopus

849 visualizações.  Harvard Medical School. Antes deste trabalho, desenvolvi um protocolo para perfusão rápida de anfíbios. Este protocolo deve ser utilizado antes da amostragem para pesquisas como proteômica e imunoquímica, onde a presença de quantidades excessivas de sangue nos tecidos é indesejável. Embora existam muitos diagramas e outros auxílios disponíveis, atualmente não há guias abrangentes sobre como dissecar tecidos de xenopus adulto de forma rápida e confiável.Esperamos que as técnicas de amostragem pa...

Vídeo: Autor em destaque: Padronizando a amostragem de tecidos em pesquisa proteômica e imunoquímica

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionárias explantes Estudar características Neural desenvolvimento precoce<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Biologia do Desenvolvimento

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica ao Target microinjeção para o desenvolvimento<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic development. To enable single-cell investigations directly in live embryos, new analytical approaches are needed, particularly those that are sensitive, selective, quantitative, robust, and scalable to different cell sizes. Here, we present a protocol that enables the in situ analysis of metabolism in single cells in freely developing embryos of the South African clawed frog (Xenopus laevis), a powerful model in cell and developmental biology. This approach uses a capillary microprobe to aspirate a defined portion from single identified cells in the embryo, leaving neighboring cells intact for subsequent analysis. The collected cell content is analyzed by a microscale capillary electrophoresis electrospray ionization (CE-ESI) interface coupled to a high-resolution tandem mass spectrometer. This approach is scalable to various cell sizes and compatible with the complex three-dimensional structure of the developing embryo. As an example, we demonstrate that microprobe single-cell CE-ESI-MS enables the elucidation of metabolic cell heterogeneity that unfolds as a progenitor cell gives rise to descendants during development of the embryo. Besides cell and developmental biology, the single-cell analysis protocols described here are amenable to other cell sizes, cell types, or animal models.

Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog Xenopus laevis Embryos

We describe steps that enable fast in situ sampling of a small portion of an individual cell with high precision and minimal invasion using capillary-based micro-sampling, to facilitate chemical characterization of a snapshot of metabolic activity in live embryos using a custom-built single cell capillary electrophoresis and mass spectrometry platform.

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

The quantification of small molecules in single cells raises new potentials for better understanding the basic processes that underlie embryonic ...

Química

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

Much information about the coupling of presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained from invertebrate preparations, most notably the squid giant synapse1. However, except for the preparation described here, few vertebrate preparations exist in which it is possible to make simultaneous measurements of neurotransmitter release and presynaptic ionic currents. Embryonic Xenopus motoneurons and muscle cells can be grown together in simple culture medium at room temperature; they will form functional synapses within twelve to twenty-four hours, and can be used to study nerve and muscle cell development and synaptic interactions for several days (until overgrowth occurs). Some advantages of these co-cultures over other vertebrate preparations include the simplicity of preparation, the ability to maintain the cultures and work at room temperature, and the ready accessibility of the synapses formed2-4. The preparation has been used widely to study the biophysical properties of presynaptic ion channels and the regulation of transmitter release5-8. In addition, the preparation has lent itself to other uses including the study of neurite outgrowth and synaptogenesis9-12, molecular mechanisms of neurotransmitter release13-15, the role of diffusible messengers in neuromodulation16,17, and in vitro synaptic plasticity18-19.

Simultaneous Pre- and Post-synaptic Electrophysiological Recording from Xenopus Nerve-muscle Co-cultures

This video demonstrates the procedures used to grow primary cultures of embryonic Xenopus nerve and muscle cells and the usefulness of this preparation for making simultaneous pre- and post-synaptic patch clamp recordings.

Simultânea de pré e pós-sináptica gravação eletrofisiológico de<em&gt; Xenopus</em&gt; Nervo músculo-Co-culturas

Much information about the coupling of  presynaptic ionic currents with the release of neurotransmitter has been obtained  from invertebrate preparations, ...

Neurociência

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Avaliando Neurogênese Primária em<em&gt; Xenopus</em&gt; Os embriões Usando Imunomarcação

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as accessibility to numerous imaging approaches, electrophysiological techniques and behavioral assays. The Xenopus tadpole olfactory system is particularly well suited to investigate the function of synapses established during normal development or reformed after injury. Here, we describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae. We outline a combination of in vivo measurements of presynaptic calcium responses in glomeruli of the olfactory bulb with olfactory-guided behavior assays. Methods can be combined with the transection of olfactory nerves to study the rewiring of synaptic connectivity. Experiments are presented using both wild-type and genetically modified animals expressing GFP reporters in central nervous system cells. Application of the approaches described to genetically modified tadpoles can be useful for unraveling the molecular bases that define vertebrate behavior.

Functional Evaluation of Olfactory Pathways in Living Xenopus Tadpoles

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system in vivo. We describe methodologies to evaluate the processing of olfactory information in living Xenopus larvae in normal rearing conditions or after injury.

Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

Xenopus tadpoles offer a unique platform to investigate the function of the nervous system. They provide multiple experimental advantages, such as ...

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro and in vivo. Fluorescent probes are particularly useful in determining the bio-distribution of administered large molecules, where the addition of a small-molecule fluorescent label is unlikely to affect the kinetics or bio-distribution of the compound. A variety of methods exist to examine bio-distribution that vary significantly in the amount of effort required and whether the resulting measurements are fully quantitative, but using multiple methods in conjunction can provide a rapid and effective system for analyzing bio-distributions.
Ex vivo whole-organ imaging is a method that can be used to quickly compare the relative concentrations of fluorescent molecules within tissues and between multiple types of tissues or treatment groups. Using an imaging platform designed for live-animal or whole-organ imaging, fluorescence within intact tissues can be determined without further processing, saving time and labor while providing an accurate picture of the overall bio-distribution. This process is ideal in experiments attempting to determine the tissue specificity of a compound or for the comparison of multiple different compounds. Quantitative tissue histology on the other hand requires extensive further processing of tissues in order to create a quantitative measure of the labeled compounds. To accurately assess bio-distribution, all tissues of interest must be sliced, scanned, and analyzed relative to standard curves in order to make comparisons between tissues or groups. Quantitative tissue histology is the gold standard for determining absolute compound concentrations within tissues.
Here, we describe how both methods can be used together effectively to assess the ability of different administration methods and compound modifications to target and deliver fluorescently labeled molecules to the central nervous system1.

The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules

Ex vivo whole-organ imaging is a rapid method for determining the relative concentrations of fluorescently labeled compounds within and between tissues or treatment groups. Conversely, quantitative fluorescence histology, while more labor intensive, allows for the quantification of the absolute tissue levels of labeled molecules.

O uso de<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado

Fluorescent labeling is a well-established process for examining the fate of labeled molecules under a variety of experimental conditions both in vitro ...

Biologia

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. Previous research has demonstrated the regenerative ability of the heart of the adult Xenopus tropicalis, an anuran amphibian with a diploid genome and a close evolutionary relationship with mammals. Additionally, studies have shown that following ventricular apex resection, the heart can regenerate without scarring in X. tropicalis. Consequently, these previous results suggest that X. tropicalis is an appropriate alternative vertebrate model for the study of adult heart regeneration. A surgical model of cardiac regeneration in the adult X. tropicalis is presented herein. Briefly, the frogs were anesthetized and fixed; then, a small incision was made with iridectomy scissors, penetrating the skin and pericardium. Gentle pressure was applied to the ventricle, and the apex of the ventricle was then cut out with scissors. Cardiac injury and regeneration were confirmed by histology at 7-30 days post resection (dpr). This protocol established an apical resection model in adult X. tropicalis, which&#160;can be employed to elucidate the mechanisms of adult heart regeneration.

An Apical Resection Model in the Adult Xenopus tropicalis Heart

Xenopus tropicalis is an ideal model for regenerative research as many of its organs possess a remarkable regenerative capacity. Here, we present a method for constructing a heart injury model in X. tropicalis via apex resection.

Modelo de Ressecção Apical no Coração de Xenopus tropicalis Adulto

It is known that in adult mammals, the heart has lost its regenerative capacity, making heart failure one of the leading causes of death worldwide. ...

Medicina

Perfusão sanguínea em rãs africanas com garras para transcriptômica e proteômica

Effective Rapid Blood Perfusion in Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol in Xenopus, aimed at a consistent and drastic reduction of blood within all tissues, is defined. Perfusion is carried out by inserting a needle directly into the ventricle of the heart and pumping heparinized phosphate-buffered saline (PBS) through the vascular system. The procedure can be completed in approximately 10 min per animal. The blood is dominated by a few highly abundant proteins and cell types, creating numerous issues as these proteins mask most other molecules and cell types of interest. The reproducible characterization of adult Xenopus tissues with quantitative proteomics and single-cell transcriptomics will benefit from applying this protocol prior to organ sampling. The protocols for tissue sampling are defined in companion papers. These procedures are aimed at the standardization of practices across Xenopus of different sex, age, and health status, specifically X. laevis and X. tropicalis.

Autor em destaque: Perfusão sanguínea rápida e eficaz em Xenopus  

Presented here is an effective rapid blood perfusion protocol to prepare tissue samples from African clawed frogs for transcriptomics and proteomics studies.

Perfusão sanguínea rápida eficaz em Xenopus

Xenopus have been powerful model organisms for understanding vertebrate development and disease for over 100 years. Here, a rapid blood perfusion protocol ...

Técnicas para amostragem rápida de seis órgãos cruciais em Xenopus adultos

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Stem Cell-like

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Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária

Microsonda eletroforese capilar espectrometria de massa para célula única Metabolomics em embriões de viver rã (Xenopus laevis)

Simultânea de pré e pós-sináptica gravação eletrofisiológico de

Avaliando Neurogênese Primária em

Avaliação funcional das vias olfativas vivos Xenopus girinos

O uso de

Modelo de Ressecção Apical no Coração de Xenopus tropicalis Adulto

Perfusão sanguínea rápida eficaz em Xenopus