Avaliação da citotoxicidade dependente de anticorpos e mediada por células em células cancerígenas usando bioensaio Reporter de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos

É bem sabido que a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos é um mecanismo importante pelo qual os anticorpos exercem certos efeitos imunomediados. Portanto, queremos encontrar um método melhor para testar a eficácia de um medicamento de anticorpos no tratamento do câncer, usando ADCCSA. O protocolo é rápido e direto.

Usando um protocolo simples de mistura e leitura, podemos obter o resultado em um dia, agilizando assim a pesquisa. Ao usar o bioensaio ADCC, podemos realizar a triagem em massa do medicamento anticorpo terapêutico com mais precisão. A relação sinal-ruído do ensaio é alta, o que pode ajudar na avaliação precisa do anticorpo terapêutico.

Para começar, cultive, as células T alvo BHT 101 e SW 1736 até atingirem 80% de confluência em frascos T75. Depois de remover o meio, lave as células uma vez com PBS e incuba-as com um mililitro de tampão de dissociação celular não enzimático por cinco minutos. Adicione PBS para interromper a reação.

Gire as células a 135G por cinco minutos e, em seguida, adicione cinco mililitros de PBS. Determine a contagem de células e semeie as células a 15.000 células por poço em microplacas de poliestireno branco de 96 poços com fundo plano e transparente. Para começar, prepare as células T alvo BHT 101 e SW 1736 para o ensaio.

Em seguida, prepare o cetuximabe para se ligar ao receptor do fator de crescimento epidérmico e o bevacizumabe como controle negativo. Para fazer o tampão de bioensaio ADCC, adicione 1,4 mililitros de soro de imunoglobulina G com baixo teor de imunoglobulina G em 33,6 mililitros de RPMI 1640, conforme fornecido no kit. Usando o tampão, dilua os anticorpos para preparar 400 microlitros de cada anticorpo em três concentrações diferentes.

Pré-aqueça o tampão de bioensaio ADCC em banho-maria a 37 graus Celsius por pelo menos 30 minutos. Remova as células efetoras do bioensaio ADCC do armazenamento refrigerado de 80 graus Celsius negativos e coloque-as em banho-maria a 37 graus Celsius por aproximadamente dois a três minutos. Balance suavemente e inspecione visualmente o frasco sem invertê-lo durante o processo de descongelamento.

Em seguida, transfira 630 microlitros de células efetoras para um tubo de 15 mililitros, contendo 3,6 mililitros de tampão ADCCSA. Inverta suavemente o tubo duas vezes para misturar as células com o tampão. Para começar, prepare as células-alvo, as células efetoras e os anticorpos desejados para o ensaio ADCC.

Após a incubação durante a noite, remova o meio das células-alvo e adicione 25 microlitros de tampão bioácido ADCC seguido de 25 microlitros de antagonistas aos poços apropriados. Em seguida, adicione 75.000 células defeitoras em 25 microlitros de tampão de bioensaio ADCC por poço na microplaca de 96 poços contendo células-alvo e incube a placa por seis horas a 37 graus Celsius. Para preparar o reagente de ensaio de luciferase, adicione tampão de ensaio de luciferase ao substrato de ensaio de luciferase liofilizado.

Em seguida, adicione 75 microlitros do reagente de ensaio de luciferase a cada poço da placa contendo células-alvo, anticorpos e células efetoras e incube a placa por 30 minutos em temperatura ambiente. Usando um luminômetro, meça o sinal de luminescência em cada poço para fornecer uma leitura quantitativa da atividade do ADCC. Para análise dos dados, calcule a indução de dobra, usando a fórmula.

O cetuximabe induziu maior atividade de ADCC em todas as concentrações testadas, mas nenhuma atividade de ADCC foi detectada com bevacizumabe em linhagens celulares BHT 101 e SW 11736, demonstrando o efeito ADCC de direcionar antígenos de membrana extracelular EGFR para ambas as linhagens celulares.