Valutazione della citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente nelle cellule tumorali utilizzando il biotest del reporter di citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente

È noto che la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente è un meccanismo importante attraverso il quale gli anticorpi esercitano determinati effetti immuno-mediati. Quindi vogliamo trovare un metodo migliore per testare l'efficacia di un farmaco anticorpale nel trattamento del cancro, utilizzando l'ADCCSA. Il protocollo è rapido e semplice.

Utilizzando un semplice protocollo di miscelazione e lettura, possiamo ottenere il risultato entro un giorno, accelerando così la ricerca. Utilizzando il biotest ADCC, possiamo eseguire lo screening di massa del farmaco anticorpale terapeutico in modo più accurato. Il rapporto segnale/rumore del test è elevato, il che può aiutare a valutare accuratamente l'anticorpo terapeutico.

Per iniziare, la coltura, le cellule T bersaglio BHT 101 e SW 1736 fino a raggiungere l'80% di confluenza in fiasche T75. Dopo aver rimosso il terreno, lavare le cellule una volta con PBS e incubarle con un millilitro di tampone di dissociazione cellulare non enzimatico per cinque minuti. Aggiungi PBS per fermare la reazione.

Centrifugare le celle a 135 G per cinque minuti, quindi aggiungere cinque millilitri di PBS. Determinare la conta delle cellule e seminare le cellule a 15.000 cellule per pozzetto in micropiastre di polistirene bianco a 96 pozzetti con fondo piatto e trasparente. Per iniziare, preparare le cellule T target BHT 101 e SW 1736 per il test.

Quindi preparare Cetuximab per legarsi al recettore del fattore di crescita epidermico e Bevacizumab come controllo negativo. Per realizzare il tampone per il biodosaggio ADCC, aggiungere 1,4 millilitri di siero a basso contenuto di immunoglobuline G in 33,6 millilitri di RPMI 1640, come fornito nel kit. Utilizzando il tampone, diluire gli anticorpi per preparare 400 microlitri di ciascun anticorpo in tre diverse concentrazioni.

Preriscaldare il tampone del biodosaggio ADCC in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Rimuovere le cellule effettrici del biotest ADCC dalla cella frigorifera a meno 80 gradi Celsius e metterle in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per circa due o tre minuti. Scuotere delicatamente e ispezionare visivamente la fiala senza capovolgerla durante il processo di scongelamento.

Quindi trasferire 630 microlitri di cellule effettrici in una provetta da 15 millilitri, contenente 3,6 millilitri di tampone ADCCSA. Capovolgere delicatamente la provetta due volte per mescolare le cellule con il tampone. Per iniziare, preparare le cellule bersaglio, le cellule effettrici e gli anticorpi desiderati per il test ADCC.

Dopo l'incubazione notturna, rimuovere il terreno dalle cellule bersaglio e aggiungere 25 microlitri di tampone bioacido ADCC seguiti da 25 microlitri di antagonisti nei pozzetti appropriati. Quindi aggiungere 75.000 cellule disertrici in 25 microlitri di tampone per saggio biologico ADCC per pozzetto nella micropiastra da 96 pozzetti contenente le cellule bersaglio e incubare la piastra per sei ore a 37 gradi Celsius. Per preparare il reagente del dosaggio della luciferasi, aggiungere il tampone del saggio della luciferasi al substrato del saggio della luciferasi liofilizzato.

Quindi aggiungere 75 microlitri di reagente per il dosaggio della luciferasi a ciascun pozzetto della piastra contenente cellule bersaglio, anticorpi e cellule effettrici e incubare la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando un luminometro, misurare il segnale di luminescenza in ciascun pozzetto per fornire una lettura quantitativa dell'attività dell'ADCC. Per l'analisi dei dati, calcolare l'induzione della piega, utilizzando la formula.

Cetuximab ha indotto una maggiore attività di ADCC a tutte le concentrazioni testate, ma nessuna attività di ADCC è stata rilevata con Bevacizumab nelle linee cellulari BHT 101 e SW 11736, dimostrando l'effetto ADCC di colpire gli antigeni di membrana extracellulari EGFR per entrambe le linee cellulari.